一種沿階草ems同質(zhì)突變體庫快速構(gòu)建的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，特別涉及一種沿階草EMS同質(zhì)突變體庫快速構(gòu)建的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沿階草又名麥冬(Oph1pogon bodinieri)，是我國特有的觀葉地被植物，屬百合科沿階草屬中沿階草種多年生常綠草本植物，因其植株低矮，耐蔭性強(qiáng)，抗病抗蟲性好，終生免修剪等特性，而作為許多地方理想的觀葉地被植物或園林綠化中的構(gòu)景植物；沿階草還具有藥用性，其塊根，常為滋陰中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，還是“藥食同源”品種，在保健食品的開發(fā)方面也有大量的應(yīng)用。沿階草作為我國特有的一種重要的無性繁殖植物，不但品種改良近年來不斷得到重視，其特有的一些生物學(xué)性狀如強(qiáng)耐蔭性和藥效好等也使得它成為尋找某些有重要利用價值的基因如耐蔭基因、藥用性好等基因資源發(fā)掘利用的典型材料。
[0003]分析鑒定基因的功能及基因之間的相互作用，基因?qū)ιL發(fā)育的影響，是功能基因組學(xué)的重點研究內(nèi)容。目前盡管已經(jīng)開發(fā)出了多種分析鑒定基因的新技術(shù)新方法，但最直接最有效的方法是構(gòu)建飽和基因突變體庫，通過突變體分析鑒定基因的功能。所以突變體庫的構(gòu)建是功能基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。目前模式植物擬南芥、水稻等作物均已構(gòu)建了飽和突變體庫并進(jìn)行了相關(guān)功能基因組學(xué)的研究，獲得了一批有重要價值的創(chuàng)新種質(zhì)資源。
[0004]突變體庫的構(gòu)建類型:按照生物產(chǎn)生突變體的過程分為:自發(fā)突變體庫(大約只有萬分之一以上的生殖細(xì)胞會發(fā)生突變，所以突變頻率很低)；理化誘變突變體庫(受限于個體和器官組織水平的再生，而導(dǎo)致誘變后代中嵌合體現(xiàn)象很嚴(yán)重，同質(zhì)突變頻率很低)；和插入突變體庫(易受受體材料及組培方法的影響而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率不高)等。其中，利用理化誘導(dǎo)劑獲得突變體是目前許多植物構(gòu)建突變體庫的主要方法。主要原因是其操作簡便，產(chǎn)生的突變可隨機(jī)分布于整個基因組、密度高，成本低，特別適宜于飽和突變體庫的倉Ij制，而且所獲得的突變體不涉及轉(zhuǎn)基因事件，所以安全性高、便于應(yīng)用。
[0005]在眾多的化學(xué)誘變劑中，甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate，EMS)因其可在一個基因組上產(chǎn)生多個點突變，且分布均勻，有利于等位基因突變體的獲得，特別是較小的突變?nèi)后w便可獲得飽和的突變體庫而成為應(yīng)用最廣泛，即高效又穩(wěn)定的一種化學(xué)誘變劑。
[0006]同質(zhì)突變體的獲得:最快速有效的方法就是通過單個突變細(xì)胞的組培再生獲得。由同質(zhì)突變體獲得的變異性狀由于突變體無嵌合現(xiàn)象，所以是能夠穩(wěn)定遺傳的，是組成同質(zhì)突變體庫的基礎(chǔ)。
[0007]但如何使一個單細(xì)胞發(fā)育成一棵完整植株，一直是許多植物組培再生的難題。目前的研究表明絕大多數(shù)植物體細(xì)胞胚起源于單細(xì)胞，體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的過程，所以體細(xì)胞胚再生途徑是再生種子來源、種苗脫毒快繁、誘導(dǎo)體細(xì)胞變異或基因轉(zhuǎn)化的理想的受體系統(tǒng)。
[0008]長期以來大部分植物組培再生都不是依賴于細(xì)胞水平上的再生，而是局限于個體或器官組織水平的再生。由多細(xì)胞組織器官誘變產(chǎn)生的再生植株后代，因其眾多細(xì)胞基因突變的差異性往往導(dǎo)致突變體嵌合現(xiàn)象很嚴(yán)重，性狀不穩(wěn)定、重復(fù)性差、再生篩選時間延長，同質(zhì)突變體頻率很低、由于很難獲得同質(zhì)突變體，從而導(dǎo)致育種效率下降等一系列弊端。
[0009]研究表明:體細(xì)胞誘變、體細(xì)胞胚再生是快速獲得廣泛變異的同質(zhì)突變體、避免嵌合體形成的理想方法，很容易在短時間內(nèi)獲得大量的多性狀的同質(zhì)突變體，產(chǎn)生表型可見并且遺傳穩(wěn)定的突變體庫。所以體細(xì)胞化學(xué)誘變技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞胚再生技術(shù)，是保證快速獲得EMS同質(zhì)突變體庫的關(guān)鍵技術(shù)。
[0010]目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)利用遺傳背景相同的細(xì)葉沿階草體細(xì)胞通過EMS誘變處理，體細(xì)胞胚再生植株構(gòu)建具有豐富變異材料的飽和同質(zhì)突變體庫的方法報道。因此本發(fā)明突破了以往大多數(shù)植物:1)盡管以化學(xué)誘變方法創(chuàng)制了突變體，但構(gòu)建突變體庫的親本材料的遺傳背景不相同；2)盡管以化學(xué)誘變方法創(chuàng)制了突變體，但突變體大多是以個體或器官組織發(fā)生途徑再生的植株，從而導(dǎo)致突變體嵌合現(xiàn)象非常嚴(yán)重；3)由于突變體嵌合現(xiàn)象很嚴(yán)重，所以產(chǎn)生的性狀很不穩(wěn)定，延長了再生篩選時間，很難快速獲得同質(zhì)突變體，也就難以快速構(gòu)建起遺傳穩(wěn)定的變異豐富的飽和同質(zhì)突變體庫。本項發(fā)明提供的一種快速構(gòu)建沿階草EMS飽和同質(zhì)突變體庫的方法，不但有利于沿階草功能基因組學(xué)、遺傳育種與生理發(fā)育等問題進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，同時也為選育沿階草新品種提供了最直接有效的突變體材料，具有重要的實用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明主要解決的問題是提供一種體細(xì)胞EMS誘變與體細(xì)胞胚再生相結(jié)合，快速構(gòu)建沿階草EMS飽和同質(zhì)突變體庫的一種優(yōu)化方法。
[0012]技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種沿階草EMS同質(zhì)突變體庫快速構(gòu)建的方法，該方法包括如下步驟:
[0013]I)高頻體細(xì)胞胚外植體材料準(zhǔn)備:選取室外健康無病蟲害的沿階草植株，取其幼嫩莖葉并帶3-4片幼葉，無菌消毒后在無菌培養(yǎng)基中組培成無菌試管苗，取其莖葉基部0.5-1.0cm大小外植體，通過高頻體胚再生系統(tǒng)的培養(yǎng)，就會持續(xù)不斷地產(chǎn)生體細(xì)胞胚和胚狀體及完整地再生植株，以再生植株作為高頻體細(xì)胞胚外植體材料來源；
[0014]2)早期體細(xì)胞胚外植體的培養(yǎng):將上述具高頻體細(xì)胞胚再生能力的外植體切取其葉、莖基部0.5cm大小組織塊，放在體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上25-28°C無菌室暗培養(yǎng)7_10d，此時大部分體細(xì)胞為單細(xì)胞時期，稱作早期體細(xì)胞胚，以此作為誘變劑處理材料；
[0015]3)化學(xué)誘變劑準(zhǔn)備:包括不同濃度甲基磺酸乙酯(EMS)溶液準(zhǔn)備；
[0016]4)早期體細(xì)胞胚外植體的HMS處理:將早期體細(xì)胞胚外植體先分成6個大組，每個大組再分成3份，6個大組用于6個不同濃度的EMS誘變劑的處理；每個大組分成的3份分別用于3個不同浸泡時間的處理；EMS溶液浸泡處理時間分為:1.0小時、1.5小時和2.0小時；
[0017]5)體細(xì)胞胚分化培養(yǎng):將經(jīng)EMS誘變處理過的早期體細(xì)胞胚外植體，重新接種于體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)在溫度為25-28°C無菌室暗培養(yǎng)至50-60d，中間繼代一次，有利于體細(xì)胞胚分化，可見外植體上大大小小生長發(fā)育出幾十個早期突變胚狀體；
[0018]6)突變胚狀體快繁増殖培養(yǎng):將上述早期突變胚狀體切成0.5cm大小塊，分別編號轉(zhuǎn)接于體細(xì)胞胚快繁增殖培養(yǎng)基，放在25-28°C光下培養(yǎng)50-60d，中間繼代一次，可獲得大量成熟的突變胚狀體；
[0019]7)成熟突變胚狀體再生植株:將成熟突變胚狀體轉(zhuǎn)接于植株再生培養(yǎng)基中，在無菌室溫度25-28°C光下培養(yǎng)20-25d，獲得具根、莖、葉完整的再生植株；
[0020]8)突變體再生植株煉苗移栽:當(dāng)根長生長到1-1.5cm時，將各突變體株系分別編號移栽到花盆，選擇輕型基質(zhì)，放置在溫室大棚內(nèi)，自動間歇噴霧裝置澆水；成活率可達(dá)100%。揭去培養(yǎng)瓶的封口膜，在室內(nèi)煉苗I?2d，用鑷子小心取出小苗，洗凈根上附著的培養(yǎng)基，移栽到裝有輕型基質(zhì)(泥炭:蛭石=1:1)的花盆中，放入溫室溫度為24°C?26°C，適當(dāng)遮蔭，或?qū)⑿∶绶诺矫绱蚕?，自動間歇噴霧裝置澆水。
[0021]9)田間突變體庫建立:60d后選擇溫暖濕潤陰天將各個突變體株系移栽到室外林下或田間區(qū)試圃，分別編號，記載相關(guān)性狀，在突變體生長發(fā)育的各階段進(jìn)行突變體鑒定、篩選，以此建立起沿階草理化飽和突變體庫，用于后續(xù)沿階草選擇育種和基因功能組學(xué)等方面的研究。
[0022]由于小苗生長旺盛，對移栽大田的條件要求也不高，極易種植，小苗的成活率可達(dá) 100%。
[0023]其中，所述EMS溶液配制成0.0-1.0% 6個不同濃度；EMS濃度優(yōu)選0.4%, EMS溶液浸泡處理時間優(yōu)選1.5小時。
[0024]其中，所述無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)為1/2MS+2.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+(λ 7%瓊月旨。
[0025]其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸 +30g/L 鹿糖 +3.5g/L phytagelo
[0026]其中，所述步驟4)中EMS溶液處理步驟為:在無菌環(huán)境下取出已準(zhǔn)備好的用于EMS處理的外植體浸泡于各濃度的EMS溶液中處理1.5±0.5小時，處理期間將含外植體的容器置于搖床上以60±5rpm的轉(zhuǎn)速輕搖，EMS溶液處理畢，倒掉EMS溶液，用無菌水浸沒外植體，輕搖沖洗5-6次直至去除外植體中殘留的EMS，處理結(jié)束后，重新接種于體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)。
[0027]其中，所述步驟6)中體細(xì)胞胚快繁增殖培養(yǎng)基為MS+2mg/L BA+0.2mg/L NAA+40g/L蔗糖+3.5g/L phytagel，光照強(qiáng)度為1500_20001χ，光照時間為每天10-14小時。
[0028]其中，所述步驟7)中植株再生培養(yǎng)基為l/2MS+20g/L白糖+0.7%瓊脂。
[0029]其中，本發(fā)明所述的高頻體胚再生系統(tǒng)是指將初生胚狀體轉(zhuǎn)入高頻體細(xì)胞胚培養(yǎng)基(MS+BA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+鹿糖 40g/L+3.5g/L phytagel)上光下培養(yǎng) 50_60d，中間繼代一次，就會持續(xù)不斷大量地產(chǎn)生次生胚狀體即體細(xì)胞胚(球形胚、魚雷胚和子葉胚)。為保證得到遺傳背景一致的沿階草EMS誘導(dǎo)飽和突變體庫，需將成熟的胚狀體(子葉胚)轉(zhuǎn)入無激素的成苗培養(yǎng)基(MS+白糖30g/L+0.7%瓊脂)光下培養(yǎng)，20-25d后形成完整再生植株，以其作為高頻體細(xì)胞胚材料來源，切取其葉、莖基部0.5cm大小組織塊作為高頻體細(xì)胞胚外植體材料，放在體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7-10d，此時大部分體細(xì)胞為單細(xì)胞時期，稱作早期體細(xì)胞胚(胚性單細(xì)胞)作為誘變劑處理材料。
[0030]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulphonate，EMS)是應(yīng)用最廣泛，即高效又穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑。其中EMS可在一個基因組上產(chǎn)生多個點突變，產(chǎn)生的突變可隨機(jī)分布于整個基因組，且分布均勻，密度高，成本低，有利于等位基因突變體的獲得，特別是較小的突變?nèi)后w便可獲得飽和的突變體庫；而且所獲得的突變體不涉及轉(zhuǎn)基因事件，所以安全性高、便于應(yīng)用。本發(fā)明利用EMS化學(xué)誘變劑的明顯優(yōu)點，又克服了以往利用其獲得的突變體通常因其起源于多細(xì)胞，由于不同細(xì)胞突變基因的差異性，往往就導(dǎo)致突變體嵌合現(xiàn)象特別嚴(yán)重，后代性狀很難穩(wěn)定，導(dǎo)致重復(fù)性差，影響突變體再生性、延長了突變體篩選時間，使得獲得同質(zhì)突變體頻率很低，由于很難獲得同質(zhì)突變