高生物量和/或高生長速度重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高生物量和/或高生長速度重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 工程菌株的生長是工業(yè)發(fā)酵的關(guān)鍵。菌體生長速度慢會延長生產(chǎn)周期，降低效率， 提高成本，不利于菌株的大規(guī)模應(yīng)用。而菌體發(fā)酵最終達(dá)到的細(xì)胞密度也是至關(guān)重要的。因 此急需一種生長速度快，可達(dá)到的細(xì)胞密度大的菌株。
[0003] 聰類化合物是由異戊二帰為結(jié)構(gòu)單元的化合物。聰類化合物的合成途徑分為MVA 途徑和MEP途徑。MEP途徑分為兩個階段；1.生成中間體異戊帰基焦磯酸（Isopenten^ diphosphateIPP)W及其雙鍵異構(gòu)體二甲基丙基焦磯酸（Dimethylall}dpyrophosphate DMAPP)階段，2.聰類生成及其修飾階段?；騝rtE、crtI和crtB可W進行連續(xù)的催化反 應(yīng)，將DMAPP轉(zhuǎn)化為鏈抱紅素。W鏈抱紅素作為底物，可W生產(chǎn)多種高附加值的產(chǎn)物，如番 茄紅素和奸青素。番茄紅素是最有力的抗氧化劑之一，可W有效的防治因衰老，免疫力下降 引起的各種疾病。在自然界，奸青素具有最強的天然抗氧化性，具有抗氧化、抗衰老、抗腫 瘤、預(yù)防必腦血管疾病等多種作用。獲取天然的番茄紅素和奸青素工藝復(fù)雜，成本高，不適 宜大規(guī)模生產(chǎn)。而利用微生物發(fā)酵技術(shù)進行生產(chǎn)，能有效的降低成本，節(jié)約資源，值得深入 研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供高生物量和/或高生長速度的重組菌的 構(gòu)建方法及其得到的重組菌。
[0005] 本發(fā)明所提供的重組菌的構(gòu)建方法，包括對受體菌進行A1、A2和A3的改造或?qū)λ?述受體菌進行所述A1和所述A2的改造，得到生物量和/或生長速度高于所述受體菌的重 組菌；
[0006] 所述A1為將所述受體菌的磯酸轉(zhuǎn)移酶G亞基（phosphotransferasesystemptsG subunit,ptsG)基因敲除；
[0007] 所述A2為將所述受體菌的半乳糖抑制子（Galactoserepressor,GalR)基因敲 除；
[0008] 所述A3為向所述受體菌中導(dǎo)入葡萄糖激酶（glucokinase,Glk)基因；
[0009] 所述受體菌為大腸桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌或嗜血桿菌。
[0010] 上述重組菌的構(gòu)建方法中，所述生物量可W單位發(fā)酵液內(nèi)所含的重組菌的數(shù)量來 體現(xiàn)，所述重組菌的數(shù)量可W菌落形成單位（C化）表示。
[0011] 上述重組菌的構(gòu)建方法中，所述受體菌可為大腸桿菌BW25113。
[0012] 上述重組菌的構(gòu)建方法中，所述磯酸轉(zhuǎn)移酶G亞基基因編碼B1或B2的蛋白質(zhì)：
[0013]B1、由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0014]B2、在SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列中經(jīng)過突變得到的具有磯酸轉(zhuǎn)移酶G亞基 功能的由B1衍生的蛋白質(zhì)；
[0015] 所述半乳糖抑制子基因編碼C1或C2的蛋白質(zhì)：
[0016]C1、由SEQIDNo. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0017] C2、在SEQIDNo. 3所示的氨基酸序列中經(jīng)過突變得到的具有半乳糖抑制子功能 的由C1衍生的蛋白質(zhì)；
[001引所述葡萄糖激酶基因編碼D1或D2的蛋白質(zhì)：
[0019] D1、由SEQIDNo. 5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0020] D2、在SEQIDNo. 5所示的氨基酸序列中經(jīng)過突變得到的具有葡萄糖激酶功能的 由D1衍生的蛋白質(zhì)。
[0021] 上述重組菌的構(gòu)建方法中，所述磯酸轉(zhuǎn)移酶G亞基基因為B11) -B13)中的任一種 DNA分子：
[0022] B11)其編碼序列是沈QIDNo. 2的cDNA分子或基因組DNA;
[0023]B12)在嚴(yán)格條件下與B11)限定的DNA分子雜交且編碼所述磯酸轉(zhuǎn)移酶G亞基的 cDNA分子或基因組DNA;
[0024]B13)與B11)或B12)限定的DNA分子具有90%W上的同一性且編碼所述磯酸轉(zhuǎn) 移酶G亞基的cDNA分子或基因組DNA;
[002引所述半乳糖抑制子基因為C11) -C13)中的任一種DNA分子：
[0026]C11)其編碼序列是沈QIDNo. 4的cDNA分子或基因組DNA;
[0027]C12)在嚴(yán)格條件下與C11)限定的DNA分子雜交且編碼所述半乳糖抑制子的cDNA 分子或基因組DM;
[0028]C13)與C11)或C12)限定的DM分子具有90%W上的同一性且編碼所述半乳糖 抑制子的cDNA分子或基因組DNA;
[0029] 所述葡萄糖激酶基因為D11) -D13)中的任一種DNA分子：
[0030]D11)其編碼序列是沈QIDNo.6的第 237-1205 位（SEQIDNo.6是 ptsGup-119-g化-kan-ptsGdown片段，起始位置是g化起始密碼子的第1位，終止位置是 g化終止密碼子的最后1位）cDNA分子或基因組DNA;
[0031]D12)在嚴(yán)格條件下與D11)限定的DNA分子雜交且編碼所述葡萄糖激酶的cDNA分 子或基因組DNA;
[003引D13)與D11)或D12)限定的DNA分子具有90%W上的同一性且編碼所述葡萄糖 激酶的cDNA分子或基因組DNA。
[0033] 上述突變?yōu)槿〈?或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基。
[0034] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述重組菌是對所述大腸桿菌BW25113進行所述 A1、所述A2和所述A3的改造得到的重組菌，其名稱為BW25113AptsGAgalRg化；在本發(fā)明 的另一個實施方式中，所述重組菌是對所述大腸桿菌BW25113進行所述A1和所述A2的改 造得到的重組菌，其名稱為BW25113AptsGAgalR。
[003引所述BW25113AptsGAgalRg；Lk的構(gòu)建方法包括下述1)-3)，所述BW25113AptsGAgalR的構(gòu)建方法包括下述1)和2):
[0036] 1)將所述大腸桿菌BW25113的所述磯酸轉(zhuǎn)移酶G亞基（ptsG)基因敲除，保持所 述大腸桿菌BW25113的其它基因不變，得到所述大腸桿菌BW25113的突變體，將其命名為 BW25113AptsG；
[0037] 2)將所述BW25113AptsG的所述半乳糖抑制子（GalR)基因敲除，保持所述大 腸桿菌BW25113AptsG的其它基因不變，得到所述BW25113AptsG的突變體，將其命名為 BW25113AptsGAgalR；
[0038] 3)向所述BW25113AptsGAgalR中導(dǎo)入所述葡萄糖激酶（G化）基因，得到所述 BW25113AptsGAgalR的突變體，將其命名為BW25113AptsGAgalRg化。
[0039] 上述重組菌的構(gòu)建方法中，所述葡萄糖激酶基因可通過葡萄糖激酶基因表達(dá)盒導(dǎo) 入；所述葡萄糖激酶基因表達(dá)盒的核巧酸序列是SEQIDNo. 6的第61-1554位(起始位置是 119啟動子的第1位，終止位置是終止子的最后1位)。
[0040] 上述重組菌的構(gòu)建方法中，所述葡萄糖激酶基因可通過SEQIDNo.6所示的DNA 分子導(dǎo)入。
[0041] 由上述任一種重組菌的構(gòu)建方法構(gòu)建的重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0042] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建鏈抱紅素產(chǎn)量高的產(chǎn)鏈抱紅 素重組菌的構(gòu)建方法及其得到的產(chǎn)鏈抱紅素重組菌。
[0043] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)鏈抱紅素重組菌的構(gòu)建方法，包括向上述任一種重組菌中導(dǎo)入 鏈抱紅素合成相關(guān)基因，得到產(chǎn)鏈抱紅素重組菌。
[0044] 上述產(chǎn)鏈抱紅素重組菌的構(gòu)建方法中，所述鏈抱紅素合成相關(guān)基因由crtE(枕牛 兒枕牛兒基焦磯酸合成酶）基因、crtl(八氨番茄紅素脫氨酶）基因、crtB(八氨番茄紅素 合成酶）基因和idi(異戊帰焦磯酸異構(gòu)酶）基因組成；所述CrtE基因編碼由SEQIDNo.8 所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；所述crtl基因編碼由SEQIDNo. 9所示的氨基酸序列組 成的蛋白質(zhì)；所述crtB基因編碼由SEQIDNo. 10所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；所述 idi基因編碼由SEQIDNo. 11所不的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0045] 上述產(chǎn)鏈抱紅素重組菌的構(gòu)建方法中，所述CrtE基因的編碼序列是SEQIDNo.7 的第1993-2922位；所述crtl基因的編碼序列是SEQIDNo.7的第2940-4418位；所述 CrtB基因的編碼序列是SEQIDNo.7的第4436-5368位；所述idi基因的編碼序列是SEQ IDNo.7 的第5386-5934位。
[0046] 上述產(chǎn)鏈抱紅素重組菌的構(gòu)建方法中，所述鏈抱紅素合成相關(guān)基因可通過沈Q ID No. 7的第1-6190位的表達(dá)盒化啟動子、目的基因及終止子組成）導(dǎo)入。
[0047] 上述產(chǎn)鏈抱紅素重組菌的構(gòu)建方法中，所述鏈抱紅素合成相關(guān)基因具體可通過 沈QIDNo. 7所示的DNA分子（PLY036)導(dǎo)入。
[0048] 由上述任一種產(chǎn)鏈抱紅素重組菌的構(gòu)建方法構(gòu)建的產(chǎn)鏈抱紅素重組菌也屬于本 發(fā)明的保護范圍。
[0049] 實驗證明，對作為受體菌的大腸桿菌BW25113進行所述A1、A2和A3改造得到 的重組菌BW25113AptsGAgalRg化，W及對作為受體菌的大腸桿菌BW25113進行所述A1 和A2改造得到的重組菌BW25113AptsGAgalR，在相同的培養(yǎng)條件下，均培養(yǎng)12小時， BW25113AptsGAgalRg化的生物量是大腸桿菌BW25113的3.26倍，BW25113AptsGAgalR 的生物量是大腸桿菌BW25113的2.81倍，說明BW25113AptsGAgalRg化和 BW25113AptsGAgalR不但生物量顯著高于受體菌，二者的生長速度也顯著高于受體菌。W BW25113AptsGAgalRg化作為受體菌導(dǎo)入含有鏈抱紅素合成相關(guān)基因表達(dá)盒的PLY036得 到的重組菌BW25113AptsGAgalRg化/pLY036,WBW25113AptsGAgalR作為受體菌導(dǎo)入 含有鏈抱紅素合成相關(guān)基因表達(dá)盒的