再加入2mL培養(yǎng)液吹 打各孔底壁，細胞徹底脫壁后，吸入離屯、管中。（2)離屯、細胞：將離屯、管置于低速離屯、機中， 于1500巧m離屯、5min后，棄去上清液；加入12血PBS液重懸細胞，再于1500巧m離屯、5min， 棄上清液；再滴入3mL的PBS液于離屯、管中重懸細胞后，將細胞懸液吸至流式細胞儀專用上 機管中，150化pm離屯、5min后，棄上清液。
[0042] 3. 3Annexin-V-門TC和PI雙標記活細胞法檢測細胞調(diào)亡
[0043] (1)用微量加樣器向流式管中加入10yL的Annexin-V-FITC和5yL的PI(兩種 試劑勿相混，勿和管底細胞相接觸）。（2)加入200yL結合緩沖液，將Annexin-V-FITC和 PI沖至管底與細胞相混，并輕輕吹打，形成單細胞懸液。（3)避光反應15min或放入4°C冰 箱30min。（4)上機前加入300yLPBS結合緩沖液，并輕輕吹打，而后立刻上機（流式細胞 儀）檢測。光源為488nm氣離子激光器，每份標本收集細胞10000個，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠 色巧光，PI發(fā)紅色巧光。（5)經(jīng)流式細胞儀分析，獲得由四個象限組成的散點圖，圖上每一 個點代表一個細胞，都具有兩個參數(shù)值。左上Ql象限代表細胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細胞 (An-PI+)，右上Q2象限代表晚期調(diào)亡細胞和壞死細胞（An+PI+)，左下Q3象限代表正常細胞 (An-PI-)，右下Q4象限代表早期調(diào)亡細胞（An+PI-)。
[0044] 4、統(tǒng)計學分析
[0045] 使用統(tǒng)計學軟件SPSS10. 0進行統(tǒng)計分析。（1)使用析因設計的方差分析，對相同 藥物濃度不同處理時間、相同處理時間不同藥物濃度各組之間化合物（I)對SACC-M細胞 的生長抑制率進行兩兩比較。（2)使用簡單相關分析，分析生長抑制率與作用時間之間、抑 制率與藥物濃度之間的相關性，得出相關系數(shù)r，并對r值進行t檢驗，從而得出藥效隨時間 和濃度的變化關系。（3)使用二項分布的U檢驗對流式細胞術檢測的各用藥組及對照組的 調(diào)亡率進行統(tǒng)計分析。
[0046]S、結果及結論
[0047] UMTT比色試驗 柳4引 （1)實驗表明化合物（I)對SACC-M細胞有明顯的增殖抑制作用，藥物作用24、 48、7化后最高抑制率可達80.4% (表1)。（2)相同處理時間、不同濃度組之間的抑制率比 較有明顯差異（P<〇. 01);相同濃度組、不同處理時間之間的抑制率有明顯差異（P<〇. 01); 藥物濃度和處理時間無交互作用（P= 0. 901)。（3)組間兩兩比較：相同時間、不同濃度組 之間，抑制率有明顯差異（P<〇. 01);處理2地、4她、7化后，同一濃度、不同時間組之間有明 顯差異（P<〇. 01)。（3)藥效（抑制率）與作用時間和藥物濃度均具有正相關性，抑制率與 作用時間具有正相關性（r= 0. 291，P= 0. 042);抑制率與濃度具有正相關性（r= 0. 926， P<0. 001)O W例 2、流式細胞術檢測 陽化日]2.1對照組細胞的調(diào)亡情況
[0051] 對照組（正常調(diào)亡組）細胞均屬于自然調(diào)亡，24h時其調(diào)亡率為4. 9 %，4化時的調(diào) 亡率為7.1%，7化的調(diào)亡率為6.1% (表2)，調(diào)亡率隨培養(yǎng)時間差別不大，無統(tǒng)計學意義。
[0052] 2. 2用藥組細胞隨時間變化調(diào)亡情況
[0053] 經(jīng)12. 5mmol/L化合物（I)處理2地后，其調(diào)亡率為25. 5% ;處理4化后，調(diào)亡 率上升至40. 9 %，多為早期調(diào)亡；處理7化后，調(diào)亡率為67.6%，多為晚期調(diào)亡，細胞調(diào)亡率 隨著處理時間延長而明顯上升（表2)，各時間組之間調(diào)亡率有統(tǒng)計學意義（P<0. 01)。
[0054] 2. 3用藥組細胞隨濃度變化調(diào)亡情況 陽化5] 處理7化后，2. 5、5. 0、7. 5、10. 0、12. 5mmol/L化合物（I)組的細胞調(diào)亡率分別為 16 %、24. 2 %、26.I%、66. 3 %、67.6%，且在藥物濃度達到12. 5mmol/L時，晚期調(diào)亡率明顯 增大（表2)，各藥物濃度組間調(diào)亡率有統(tǒng)計學意義（P<0. 01)。
[0056] 結論，本研究表明化合物（I)具有誘導SACC-M調(diào)亡的作用，且調(diào)亡率隨藥物作 用時間的延長和用藥濃度的增加呈上升趨勢。應用化合物（I)治療腺樣囊性癌有可能成 為一種很有前景的治療方法。
[0057] 表1不同濃度不同作用時間抑制率（均值±SD)
[0059] 表2化合物（I)誘導SACC-M調(diào)亡情況
陽061] 實施例3
[0062] 片劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。 W63] 實施例4 W64] 口服液制備：按實施例I方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成 口服液。 W65] 實施例5
[0066] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。 W67] 實施例6
[0068] 注射液的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。 W例 實施例7
[0070] 無菌粉針的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無菌 烙封得粉針劑。
[0071] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可W對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權項】
1. 具有下述結構式的化合物（I)，2. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a)將 茵陳的干燥地上部分粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次 用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正 丁醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體 積，再用75 %乙醇洗脫8個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸 膏；（c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、65:1、30:1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠 進一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分； (e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲 醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。3. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為AB-8 型大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流 提取采用的乙醇濃度為80 %。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權利要求1所述的化合物 (I)和藥學上可接受的載體。6. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療涎腺腺樣囊性癌藥物中的應用。7. 權利要求5所述的藥物組合物在制備治療涎腺腺樣囊性癌藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的三萜化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。該化合物為首次報道，是一種結構新穎的三萜化合物，可以從茵陳的干燥地上部分中提取、分離純化得到。本研究證實該化合物具有誘導SACC-M凋亡的作用，且凋亡率隨藥物作用時間的延長和用藥濃度的增加呈上升趨勢，可以用來開發(fā)成治療涎腺腺樣囊性癌的藥物。
【IPC分類】C07J71/00, A61P35/00, A61K31/585
【公開號】CN105294817
【申請?zhí)枴緾N201510836820
【發(fā)明人】呂濤
【申請人】呂濤
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月25日