一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法。所述制備方法，包括如下步驟：采用溶壁酶和崩潰酶組成的混合酶液對(duì)樺褐孔菌菌絲膜進(jìn)行酶解，對(duì)酶解液用8層擦鏡紙過(guò)濾，收集濾液、離心，所得沉淀即為樺褐孔菌原生質(zhì)體。所述轉(zhuǎn)化步驟：將質(zhì)粒pAN7?1通過(guò)PEG/CaCl2介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化至樺褐孔菌原生質(zhì)體中，得到含有質(zhì)粒pAN7?1的樺褐孔菌。采用本方法制得的樺褐孔菌原生質(zhì)體產(chǎn)率高達(dá)5×107個(gè)/mL，再生率為7％。本發(fā)明的制備和轉(zhuǎn)化方法為后期對(duì)該菌進(jìn)行遺傳操作改造，提高三萜化合物及其前體的產(chǎn)量，進(jìn)而提高樺褐孔菌的藥用價(jià)值，滿足市場(chǎng)的需求奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及真菌生物學(xué)，具體涉及一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的 制備方法和轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樺褐孔菌（Inonotus obliquus)是一種珍貴的藥用真菌，早在16世紀(jì)，東歐民間就 廣泛用樺褐孔菌防治多種疑難雜癥，如胃癌、腸癌及心血管類疾病。樺褐孔菌藥用價(jià)值的主 要活性成分是三萜化合物，具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌活性。隨著野生資源的日益枯竭及對(duì) 樺褐孔菌需求量的日益增加，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)提高人工培養(yǎng)樺褐孔菌菌絲體三萜類化合 物的產(chǎn)量來(lái)滿足人們對(duì)樺褐孔菌的需求尤為重要。因此，十分有必要建立樺褐孔菌的遺傳 轉(zhuǎn)化體系，以便于后期對(duì)該真菌進(jìn)行遺傳操作改造，提高三萜化合物及其前體的產(chǎn)量，進(jìn)而 提高樺褐孔菌的藥用價(jià)值，滿足市場(chǎng)的需求。而目前沒(méi)有對(duì)樺褐孔菌轉(zhuǎn)化方法的報(bào)道。樺褐 孔菌在實(shí)驗(yàn)室主要以菌絲繁殖，但孢子極難獲得，為獲得遺傳轉(zhuǎn)化所需的單細(xì)胞材料，制備 高質(zhì)量的樺褐孔菌原生質(zhì)體是以上研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種制備高質(zhì)量樺褐孔菌原生質(zhì)體的方法和一種適合樺褐 孔菌的轉(zhuǎn)化方法。
[0004] 本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法， 包括制備步驟和轉(zhuǎn)化步驟。
[0005] ( -）制備步驟:采用溶壁酶和崩潰酶組成的混合酶液對(duì)樺褐孔菌菌絲膜進(jìn)行酶 解，得到樺褐孔菌原生質(zhì)體。具體如下：
[0006] 1)原生質(zhì)體的制備:無(wú)菌接種環(huán)撩起樺褐孔菌菌絲膜，加入離心管中，用無(wú)菌水和 滲透壓穩(wěn)定劑洗滌，用無(wú)菌濾紙片吸干水分，按每l〇〇mg樺褐孔菌菌絲膜加1-1.5ml混合酶 液的比例，加入混合酶液，于30-35°C，90rpm，酶解2-3h，得酶解液；
[0007] 2)原生質(zhì)體純化:酶解液用8層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，將濾液收集到離心管中，4000rpm 離心10min，棄去上清液，取沉淀，即為樺褐孔菌原生質(zhì)體。
[0008] 優(yōu)選的，所述的混合酶液是：按質(zhì)量比，溶壁酶:崩潰酶=1.5-2.5:1，混合后，由滲 透壓穩(wěn)定劑溶解，經(jīng)〇. 22μπι微孔濾膜過(guò)濾，混合酶液中，酶的總濃度為25-35mg/ml。
[0009] 更優(yōu)選的，所述的混合酶液是:按質(zhì)量比，溶壁酶:崩潰酶=2:1，混合后，由滲透壓 穩(wěn)定劑溶解，經(jīng)〇. 22μπι微孔濾膜過(guò)濾，混合酶液中，酶的總濃度為30mg/ml。
[0010] 優(yōu)選的，所述的滲透壓穩(wěn)定劑是KC1水溶液。
[0011] (二)轉(zhuǎn)化步驟:將質(zhì)粒PAN7-1通過(guò)PEG/CaCl2介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化至樺褐孔菌原生質(zhì)體中， 得到含有質(zhì)粒PAN7-1的樺褐孔菌。具體如下：
[0012] 用STC buffer稀釋樺褐孔菌原生質(zhì)體至濃度為1 X 107個(gè)/ml，得到樺褐孔菌原生 質(zhì)體懸液，每150μ1樺褐孔菌原生質(zhì)體懸液與10μ1線性化質(zhì)粒pAN7_l輕輕混勾，隨后依次加 入100μl、300μl、500μl、600μl的PEGsolution，并輕輕混勻，冰浴20min，室溫放置20min后 加入4111131'(：131^€6廣于4°(：，3000印111/1^11離心201^11，棄上清液，取沉淀加入41111液體再生 培養(yǎng)基，孵育12_14h，4000rpm/min離心10min，留少許上清液，使沉淀懸浮，取150μ1沉淀涂 布到含有潮霉素 Β抗性的再生培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)得陽(yáng)性菌落，然后提取陽(yáng)性菌落的基 因組，以潮霉素 B作為篩選標(biāo)記基因，篩選陽(yáng)性克隆，得到含有質(zhì)粒pAN7-l的樺褐孔菌。
[0013] 優(yōu)選的，所述的STC buffer組成為：1·2Μ山梨醇、50mM CaCl2、10mM Tris-HC1，PH =7.5〇
[0014] 優(yōu)選的，所述的再生培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、磷酸 二氫鉀lg、MgS〇4 · 7H20 lg，蒸餾水 1000ml，ΡΗ=6·8,瓊脂 18g。
[0015] 所述的質(zhì)粒pAN7-l是一種大腸桿菌：真菌穿梭載體，全長(zhǎng)6756bp，含有雙抗性基 因-氨芐青霉素(Amp)和潮霉素(hph)抗性基因，hph基因的啟動(dòng)子是構(gòu)巢曲霉gpdA基因的啟 動(dòng)子，終止子是構(gòu)巢曲霉trpC基因的終止子，為現(xiàn)有技術(shù)中的已知產(chǎn)品。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是:采用本發(fā)明的方法制得的樺褐孔菌原生質(zhì)體，質(zhì)量好，原生 質(zhì)體的釋放量達(dá)5 X 107個(gè)/mL，再生率為7 %，處于較高的水平。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是用溶壁酶和崩潰酶混合酶液制備的樺褐孔菌原生質(zhì)體酶解液圖。
[0018] 圖2是用8層擦鏡紙過(guò)濾后的原生質(zhì)體圖。
[0019] 圖3是樺褐孔菌原生質(zhì)體再生出的菌落圖。
[0020]圖4是以陽(yáng)性菌株的基因組為模板，擴(kuò)增hph基因的PCR產(chǎn)物鑒定圖，其中泳道1為 DL2000DNA Marker，泳道2、3分別為以陽(yáng)性菌落的基因組和質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn) 物。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0022] 實(shí)施例1 一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法 [0023](一)樺褐孔菌菌絲膜的制備
[0024]將樺褐孔菌菌絲接種于含0.08 %MgS〇4的PDA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6天后，用接種環(huán) 挑取菌落片層到含有無(wú)菌水和玻璃珠的50ml離心管中（玻璃珠和50ml離心管均已滅菌），渦 旋振蕩，直至成為很小的菌絲片段，用移液槍吸取lml菌絲片段到含0.08 %MgS〇4的200ml PDA液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)12天，得到樺褐孔菌菌絲膜。
[0025](二)混合酶液的制備
[0026] 分別稱取60mg溶壁酶和30mg崩潰酶，加入3ml滲透壓穩(wěn)定劑(0.6mol/L KC1溶液）， 待酶完全溶解之后，用〇. 22μπι濾膜過(guò)濾，取濾液，用滲透壓穩(wěn)定劑制成濃度為30mg/ml的混 合酶液，置于無(wú)菌間備用，當(dāng)天使用。
[0027](三)原生質(zhì)體的制備
[0028]取50ml空離心管，用無(wú)菌接種環(huán)撩起制備好的樺褐孔菌菌絲膜至該離心管中，用 無(wú)菌水和滲透壓穩(wěn)定劑各洗兩次，用無(wú)菌濾紙片吸干水分，按每l〇〇mg樺褐孔菌菌絲膜加 lml混合酶液的比例，加入混合酶液，于32°C，90rpm，酶解2h，得到的酶解液，顯微鏡鏡檢結(jié) 果如圖1所示，由圖1可見(jiàn)，原生質(zhì)體數(shù)量較多，大小均一，質(zhì)量較高。
[0029] (四）原生質(zhì)體的純化
[0030] 酶解液用8層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，去除菌絲，將濾液收集到離心管中，結(jié)果如圖2所 示，由圖2可見(jiàn)，并無(wú)菌絲碎片剩余，可以排除再生的菌落是由菌絲碎片生長(zhǎng)出的菌落而非 原生質(zhì)體再生的可能性，4000rpm離心10min，棄去上清液，沉淀用4°C預(yù)冷的滲透壓穩(wěn)定劑 和STC buffer(1.2M山梨醇、50mM CaCl2、10mM Tris-HC1，PH = 7.5)各洗2次，最后用STC buff er穩(wěn)定液懸原生質(zhì)體，即制得樺褐孔菌原生質(zhì)體懸液，冰浴備用。
[0031]采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)所得原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果表明，樺褐孔菌原生質(zhì)體的 濃度為5X107個(gè)/mL，將制得的原生質(zhì)體涂布到再生培養(yǎng)基上，再生出的菌落如圖3所示，經(jīng) 計(jì)算，再生率約為7 %。
[0032](五)樺褐孔菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
[0033] 用STC buffer稀釋樺褐孔菌原生質(zhì)體懸液至濃度為1 X 107個(gè)/ml，每150μ1稀釋后 的樺褐孔菌原生質(zhì)體懸液與1〇μ1線性化質(zhì)粒ΡΑΝ7-1輕輕混勻，隨后依次加入100μΙ、300μ1、 500μl、600μl的PEGsolution，并輕輕混勻，冰浴20min，室溫放置20min后加入4mlSTC buffer，于4°C，3000rpm/min離心20min，棄上清液，取沉淀加入4ml液體再生培養(yǎng)基(葡萄糖 20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、磷酸二氫鉀lg、MgS〇4 · 7H20 lg，蒸餾水1000ml，PH=6.8,瓊 脂18g)，孵育12h，4000rpm/min離心10min，留少許上清液，使沉淀懸浮，取150μ1沉淀涂布到 含有潮霉素 Β抗性的再生培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)得陽(yáng)性菌落，然后提取陽(yáng)性菌落的基因 組，以潮霉素 B作為篩選標(biāo)記基因，篩選陽(yáng)性克隆，得到含有質(zhì)粒pAN7-l的樺褐孔菌。
[0034](六）陽(yáng)性克隆的鑒定
[0035]將含有質(zhì)粒pAN7-l的樺褐孔菌轉(zhuǎn)接于50μg/ml潮霉素 B的再生培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng) 10天，用接種環(huán)挑取菌絲片段，提取其基因組。以所得基因組為模板，以HPH-F(5' ACGTCTGTCGAGAAGTTTC-3 '）和HPH-R(5 ' -CACAGCCATCGGTCCAG-3 '）為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn) 證質(zhì)粒PAN7-1是否導(dǎo)入樺褐孔菌的原生質(zhì)體中。
[0036] 其反應(yīng)體系如下：
[0038] PCR擴(kuò)增程序如下：
[0040] PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果如圖4所示。由圖4可見(jiàn)，以陽(yáng)性轉(zhuǎn) 化子的基因組為模板，與陽(yáng)性質(zhì)粒所得結(jié)果一致。
[0041] 實(shí)施例2混合酶液對(duì)樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法的影響
[0042] 方法同實(shí)施例1，區(qū)別在于，混合酶液的配制方法如下：
[0043] 分別稱取45mg溶壁酶和30mg崩潰酶，加入3ml滲透壓穩(wěn)定劑(0.6mol/L KC1溶液）， 待酶完全溶解之后，用〇. 22μπι濾膜過(guò)濾，取濾液，用滲透壓穩(wěn)定劑制成濃度為25mg/ml的混 合酶液，置于無(wú)菌間備用，當(dāng)天使用。
[0044] 樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法及釋放量測(cè)定與實(shí)施例1相同，經(jīng)測(cè)定后，本 實(shí)施例方法制得的樺褐孔菌原生質(zhì)體的濃度為9 X 106個(gè)/ml。將制得的原生質(zhì)體涂布到再 生培養(yǎng)基上，再生率約為6.87 %。
[0045] 實(shí)施例3混合酶液對(duì)一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化的影響
[0046] 方法同實(shí)施例1，區(qū)別在于，混合酶液的配制方法如下：
[0047] 分別稱取75mg溶壁酶和30mg崩潰酶，加入3ml滲透壓穩(wěn)定劑(0.6mol/L KC1溶液）， 待酶完全溶解之后，用〇. 22μπι濾膜過(guò)濾，取濾液，用滲透壓穩(wěn)定劑制成濃度為35mg/ml的混 合酶液，置于無(wú)菌間備用，當(dāng)天使用。
[0048]樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法及釋放量測(cè)定與實(shí)施例1相同，經(jīng)測(cè)定后，本 實(shí)施例方法制得的樺褐孔菌原生質(zhì)體的濃度為2.5 X107個(gè)/ml。將制得的原生質(zhì)體涂布到 再生培養(yǎng)基上，再生率約為6.38 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:包括制備步驟:采用溶壁酶 和崩潰酶組成的混合酶液對(duì)樺褐孔菌菌絲膜進(jìn)行酶解，得到樺褐孔菌原生質(zhì)體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述 的制備步驟具體如下： 1) 原生質(zhì)體的制備:無(wú)菌接種環(huán)撩起樺褐孔菌菌絲膜，加入離心管中，用無(wú)菌水和滲透 壓穩(wěn)定劑洗滌，用無(wú)菌濾紙片吸干水分，按每l〇〇mg樺褐孔菌菌絲膜加1-1.5ml混合酶液的 比例，加入混合酶液，于30-35 °C，90rpm，酶解2-3h，得酶解液； 2) 原生質(zhì)體純化:酶解液用8層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，將濾液收集到離心管中，4000rpm離心 lOmin，棄去上清液，取沉淀，即為樺褐孔菌原生質(zhì)體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于： 所述的混合酶液是:按質(zhì)量比，溶壁酶:崩潰酶=1.5-2.5:1，混合后，由滲透壓穩(wěn)定劑溶解， 經(jīng)0.22μηι微孔濾膜過(guò)濾，混合酶液中，酶的總濃度為25-35mg/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述 的混合酶液是:按質(zhì)量比，溶壁酶:崩潰酶=2:1，混合后，由滲透壓穩(wěn)定劑溶解，經(jīng)0.22μπι微 孔濾膜過(guò)濾，混合酶液中，酶的總濃度為30mg/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述 的滲透壓穩(wěn)定劑是KC1水溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于： 包括轉(zhuǎn)化步驟:將質(zhì)粒PAN7-1通過(guò)PEG/CaCl 2介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化至樺褐孔菌原生質(zhì)體中，得到含有 質(zhì)粒PAN7-1的樺褐孔菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述 的轉(zhuǎn)化步驟具體如下：用STC buffer稀釋樺褐孔菌原生質(zhì)體至濃度為1 X 107個(gè)/ml，得樺褐 孔菌原生質(zhì)體懸液，每150μ1樺褐孔菌原生質(zhì)體懸液與10μ1線性化質(zhì)粒pAN7-l輕輕混勻，隨 后依次加入1〇〇μ1、300μ1、500μ1、600μ1的PEG solution，并輕輕混勻，冰浴20min，室溫放置 20min后加入4ml STC buffer，于4°C，3000rpm/min離心20min，棄上清液，取沉淀加入4ml液 體再生培養(yǎng)基，孵育12-14h，4000rpm/min離心10min，留少許上清液，使沉淀懸浮，取150μ1 沉淀涂布到含有潮霉素 Β抗性的再生培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)得陽(yáng)性菌落，然后提取陽(yáng)性菌 落的基因組，以潮霉素 B作為篩選標(biāo)記基因，篩選陽(yáng)性克隆，得到含有質(zhì)粒pAN7-l的樺褐孔 菌。8. 根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于： 所述的STC buffer組成為：1·2Μ山梨醇、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl，PH=7.5〇9. 根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的一種樺褐孔菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于： 所述的再生培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、磷酸二氫鉀lg、 MgS〇4 · 7H20 lg，蒸餾水 1000ml，ΡΗ=6·8,瓊脂 18g。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK105969671SQ201610412117
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】劉宏生, 鄧芳博, 趙健, 朱俊豐
【申請(qǐng)人】遼寧大學(xué)