第二表達(dá)載體（即其中親本表達(dá)載體編碼VH，第二表達(dá)載體編碼 '，并且反 之亦然）。可接著用一種或兩種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系（例如永生化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系），并且 在允許嵌合可變結(jié)構(gòu)域或嵌合抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)（參見例如Neuberger等的國(guó)際專利 申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB85/00392)。
[0096] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可制備包含供體CDR和接受體FR氨基酸序列的可變區(qū)，接著 將變化引入核酸分子中以實(shí)現(xiàn)CDR氨基酸取代。
[0097] 用于制備編碼多肽的氨基酸序列變體的核酸分子的示例性本領(lǐng)域認(rèn)可方法包括 但不限于通過定點(diǎn)（或寡核苷酸介導(dǎo)）誘變、PCR誘變和盒式誘變較早制備的編碼所述多 狀的DNA進(jìn)彳丁制備。
[0098] 定點(diǎn)誘變是一種用于制備取代變體的優(yōu)選方法。這個(gè)技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的 (參見例如Carter等NucleicAcidsRes. 13:4431-4443 (1985)以及Kunkel等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA82:488(1987))。簡(jiǎn)要來說，在進(jìn)行DNA的定點(diǎn)誘變時(shí)，親本DNA是通 過首先使編碼所需突變的寡核苷酸雜交于所述親本DNA的單鏈來改變。在雜交之后，DNA聚 合酶用于使用雜交的寡核苷酸作為引物，并且使用親本DNA的單鏈作為模板來合成整個(gè)第 二鏈。因此，編碼所需突變的寡核苷酸被并入所得雙鏈DNA中。
[0099]PCR誘變也適于制備多肽的氨基酸序列變體。參見Higuchi，PCR Protocols,第 177-183 頁（AcademicPress,1990);以及Vallette等，Nuc.Acids Res. 17:723-733 (1989)。簡(jiǎn)要來說，當(dāng)少量模板DNA用作PCR中的起始物質(zhì)時(shí)，在序列方面 略微不同于模板DNA中的相應(yīng)區(qū)域的引物可用于產(chǎn)生相對(duì)大量的僅在引物不同于模板所 處的位置處不同于模板序列的特定DNA片段。
[0100] 用于制備變體的另一方法盒式誘變是基于由Wells等，Gene34:315-323(1985) 描述的技術(shù)。起始物質(zhì)是包含待突變的DNA的質(zhì)粒（或其它載體）。鑒定待突變的親本DNA 中的密碼子。在鑒定的突變位點(diǎn)的各側(cè)上必須存在獨(dú)特限制核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果不存在 所述限制位點(diǎn)，那么它們可使用上述寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法來產(chǎn)生以將它們引入編碼多 肽的DNA中的適當(dāng)位置。在這些位點(diǎn)處切割質(zhì)粒DNA以使它線性化。使用標(biāo)準(zhǔn)程序合成編 碼DNA的在限制位點(diǎn)之間，但含有所需突變的序列的雙鏈寡核苷酸，其中寡核苷酸的兩個(gè) 鏈?zhǔn)欠謩e合成，接著使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)雜交在一起。這個(gè)雙鏈寡核苷酸稱為盒。這個(gè)盒被設(shè)計(jì) 來具有可與線性化質(zhì)粒的末端相容以使它可直接連接于質(zhì)粒的5'末端和3'末端。這個(gè)質(zhì) ?，F(xiàn)在含有突變DNA序列。
[0101] 通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的可變區(qū)可被重新塑造以及進(jìn)一步改變來進(jìn)一步增加抗原 結(jié)合性。因此，上述步驟可前置以或繼之以其它步驟，包括例如親和力成熟。此外，經(jīng)驗(yàn)結(jié) 合數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步優(yōu)化。
[0102] 除氨基酸取代之外，本發(fā)明也預(yù)期其它修飾，例如對(duì)Fc區(qū)氨基酸序列的修飾以產(chǎn) 生效應(yīng)物功能改變的Fc區(qū)變體?？衫缛笔c區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基以降低或增強(qiáng) 與FcR的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，可修飾一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)殘基以產(chǎn)生所述Fc區(qū)變體。通 常，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案，將缺失至多1至約10個(gè)Fc區(qū)殘基。包含一個(gè)或多個(gè)氨基 酸缺失的本文Fc區(qū)將優(yōu)選保留起始Fc區(qū)或天然序列人Fc區(qū)的至少約80 %，并且優(yōu)選至少 約90 %，并且最優(yōu)選至少約95 %。
[0103] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過重組方法產(chǎn)生本發(fā)明中所述或通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的 多肽，例如人源化Ig可變區(qū)和/或包含人源化Ig可變區(qū)的多肽。舉例來說，可將編碼多肽 的聚核苷酸序列插入適合表達(dá)載體中以達(dá)成重組表達(dá)。當(dāng)多肽是抗體時(shí)，可將編碼任選連 接于恒定區(qū)的其它輕鏈和重鏈可變區(qū)的聚核苷酸插入相同或不同表達(dá)載體中。親和標(biāo)簽序 列（例如His(6)標(biāo)簽）可任選連接或包括在多肽序列內(nèi)以有助于下游純化。使編碼免疫球 蛋白鏈的DNA區(qū)段可操作地連接于表達(dá)載體中的確保免疫球蛋白多肽的表達(dá)的控制序列。 表達(dá)控制序列包括但不限于啟動(dòng)子（例如天然相關(guān)或異源啟動(dòng)子）、信號(hào)序列、增強(qiáng)子元件 和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，表達(dá)控制序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核 啟動(dòng)子系統(tǒng)。一旦載體已并入適當(dāng)宿主中，即在適于高水平表達(dá)核苷酸序列以及收集和純 化多肽的條件下維持宿主。
[0104] 這些表達(dá)載體通常可作為游離體或作為宿主染色體DNA的整合部分在宿主生 物體中復(fù)制。通常，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記（例如氨芐西林抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗 性或新霉素抗性）以允許檢測(cè)用所需DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞（參見例如美國(guó)專利號(hào) 4, 704, 362)。
[0105] 大腸桿菌是一種特別用于克隆本發(fā)明的聚核苷酸（例如DNA序列）的原核宿 主。適用的其它微生物宿主包括桿菌屬（如枯草芽孢桿菌）和其它腸桿菌科（如沙門菌屬 (Salmonella)、沙雷菌屬（Serratia)和各種假單胞菌屬（Pseudomonas)物種）。
[0106] 如酵母的其它微生物也用于表達(dá)。酵母屬和畢赤酵母屬是示例性酵母宿主，其中 根據(jù)需要，適合載體具有表達(dá)控制序列（例如啟動(dòng)子）、復(fù)制起點(diǎn)、終止序列等。典型啟動(dòng)子 包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。誘導(dǎo)性酵母啟動(dòng)子尤其包括來自醇脫氫酶、異細(xì) 胞色素C和負(fù)責(zé)甲醇、麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子。
[0107] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，大腸桿菌和釀酒酵母是優(yōu)選宿主細(xì)胞。
[0108] 除微生物之外，哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)物也可用于表達(dá)和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽（例如 編碼免疫球蛋白或其片段的聚核苷酸）。參見Winnacker,FromGenestoClones,VCH Publishers，N.Y.，N.Y. (1987)。真核細(xì)胞實(shí)際上是優(yōu)選的，因?yàn)槟軌蚍置诋愒吹鞍踪|(zhì)（例 如完整免疫球蛋白）的許多適合宿主細(xì)胞系在本領(lǐng)域中已被開發(fā)，并且包括CH0細(xì)胞系、 各種Cos細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞、293細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化B細(xì)胞和雜交瘤。用于這些細(xì) 胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子（Queen等，Immunol. Rev. 89:49 (1986));以及必需處理信息位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸 化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選表達(dá)控制序列是源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳 頭狀瘤病毒、巨細(xì)胞病毒等的啟動(dòng)子。參見Co等，J.Immunol. 148:1149(1992)。
[0109] 可通過視細(xì)胞宿主的類型而變化的熟知方法將含有目標(biāo)聚核苷酸序列（例如重 鏈和輕鏈編碼序列以及表達(dá)控制序列）的載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中。舉例來說，氯化鈣轉(zhuǎn) 染通常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、基因槍或病毒基轉(zhuǎn)染可用于其 它細(xì)胞宿主。（一般參見Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(Cold SpringHarborPress,第2版，1989)。用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的其它方法包括使用聚凝 胺、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電穿孔和顯微注射（一般參見Sambrook等，上文）。對(duì)于產(chǎn)生 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因可顯微注射至受精卵母細(xì)胞中，或可并入胚胎干細(xì)胞的基因組中，并且 將所述細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移至去核卵母細(xì)胞中。
[0110] 主題多肽也可并入轉(zhuǎn)基因中以引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組中，并且隨后例如表達(dá) 在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中（參見例如Deboer等5, 741，957;Rosen5, 304, 489;以及Meade 5, 849, 992。適合轉(zhuǎn)基因包括與來自乳腺特定基因（如酪蛋白或0乳球蛋白）的啟動(dòng)子和 增強(qiáng)子可操作連接的輕鏈和/或重鏈編碼序列。
[0111] 可使用單一載體或兩個(gè)載體表達(dá)多肽。舉例來說，可將抗體重鏈和輕鏈克隆至單 獨(dú)表達(dá)載體中，并且共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)序列可用于促進(jìn)本發(fā)明多肽的表達(dá)。
[0113] 一旦表達(dá)，即可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)程序純化多肽，所述標(biāo)準(zhǔn)程序包括硫酸銨沉 淀、親和柱（例如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G)、柱色譜法、HPLC純化、凝膠電泳等（一般參見 Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag，N.Y.，（1982))。
[0114] 可由所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)人源化Ig可變區(qū)或包含它們的多肽。它們 也可在體內(nèi)在細(xì)胞中表達(dá)。被轉(zhuǎn)化（例如轉(zhuǎn)染）來產(chǎn)生改變的抗體的細(xì)胞系可為永生化哺 乳動(dòng)物細(xì)胞系，如具有淋巴來源的那些（例如骨髓瘤、雜交瘤、三源雜交瘤或四源雜交瘤細(xì) 胞系）。細(xì)胞系也可包括已通過用病毒（例如埃-巴二氏病毒）轉(zhuǎn)化加以永生化的正常淋 巴樣細(xì)胞，如B細(xì)胞。
[0115] 盡管用于產(chǎn)生多肽的細(xì)胞系通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，但也可使用來自其它來源 (如細(xì)菌和酵母）的細(xì)胞系。具體來說，可使用大腸桿菌源性細(xì)菌菌株，尤其例如噬菌體展 不〇
[0116] 如骨髓瘤細(xì)胞系的一些永生化淋巴樣細(xì)胞系在它們的正常狀態(tài)下會(huì)分泌分離的 Ig輕鏈或重鏈。如果所述細(xì)胞系用在本發(fā)明方法期間制備的表達(dá)改變的抗體的載體轉(zhuǎn)化， 那么將不必進(jìn)行方法的其余步驟，前提是正常分泌的鏈互補(bǔ)于由早先制備的載體編碼的Ig 鏈的可變結(jié)構(gòu)域。
[0117] 如果永生化細(xì)胞系不分泌或不分泌互補(bǔ)鏈，那么將必須向細(xì)胞中引入編碼適當(dāng)互 補(bǔ)鏈或其片段的載體。
[0118] 在永生化細(xì)胞系分泌互補(bǔ)輕鏈或重鏈的情況下，可例如通過用載體轉(zhuǎn)化適合細(xì)菌 細(xì)胞，接著使細(xì)菌細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合（例如通過原生質(zhì)球融合）來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。 或者，可通過電穿孔將DNA直接引入永生化細(xì)胞系中。
[0119] 在一個(gè)實(shí)施方案中，如本發(fā)明中所述或通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的人源化Ig可變區(qū) 可存在于任何抗體的抗原結(jié)合片段中。片段可重組產(chǎn)生以及工程化、合成、或通過用蛋白水 解酶消化抗體來產(chǎn)生。舉例來說，片段可為Fab片段；用木瓜蛋白酶消化會(huì)在接合兩個(gè)重鏈 的鏈間（即VH_VH)二硫鍵之前的區(qū)域使抗體斷裂。這導(dǎo)致形成含有輕鏈以及重鏈的 CH1結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)相同片段?；蛘?，片段可為F(ab'）2片段。這些片段可通過用胃蛋白酶消 化抗體來產(chǎn)生，所述胃蛋白酶在鏈間二硫鍵之后裂解重鏈，并且產(chǎn)生含有兩個(gè)抗原結(jié)合位 點(diǎn)的片段。另一替代方案在于使用"單鏈"抗體。可以多種方式構(gòu)建單鏈Fv(SCFv)片段。 舉例來說，末端可連接于V。的N末端。通常，將接頭（例如（GGGGS)4;SEQIDN0:4) 放置在％與V 間。然而，可逆轉(zhuǎn)可連接各鏈所依的順序，并且可包括有助于檢測(cè)或純化 的標(biāo)簽（例如Myc標(biāo)簽、His標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽）（如這些標(biāo)簽的標(biāo)簽可附接于本發(fā)明的任 何抗體或抗體片段；它們的使用不局限于scFv)。因此，并且如下所指示，標(biāo)記的抗體在本 發(fā)明的范圍內(nèi)。在替代性實(shí)施方案中，本文所述或通過本文所述的方法產(chǎn)生的抗體可為重 鏈二聚體或輕鏈二聚體。更進(jìn)一步，可使用抗體輕鏈或重鏈或其部分，例如單結(jié)構(gòu)域抗體 (DAb)〇
[0120] 在另一實(shí)施方案中，如本發(fā)明中所述或通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的人源化Ig可 變區(qū)存在于單鏈抗體（ScFv)或微型抗體中（參見例如美國(guó)專利號(hào)5, 837, 821或TO94/09817A1)。微型抗體是由各自包含ScFv分子的兩個(gè)多肽鏈組成的二聚分子（即包含 一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的單一多肽，例如 '結(jié)構(gòu)域由柔性接頭連接于VH結(jié)構(gòu)域，所述VH 結(jié)構(gòu)域通過連接肽融合于CH3結(jié)構(gòu)域）。ScFv分子可以VH-接頭取向或V^接頭-VH 取向