1-3個(gè)重復(fù)序列的變體也是可能的（Holliger等 (1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)?？捎糜诒景l(fā)明的其它接頭由Alfthan 等（1995)，ProteinEng. 8:725-731;Choi等（2001)，Eur.J.Immunol. 31:94-106;Hu等 (1996)，CancerRes. 56:3055-3061;Kipriyanov等（1999)，J.Mol.Biol. 293:41-56 以及 Roovers等（2001)，CancerImmunol描述。
[0023] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"功能性質(zhì)"是例如為了改進(jìn)多肽的制造性質(zhì)或治療功效，其改 進(jìn)（例如相對(duì)于常規(guī)多肽）對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是合乎需要和/或有利的多肽（例如 免疫結(jié)合劑）性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是穩(wěn)定性（例如熱穩(wěn)定性）。在另一實(shí)施 方案中，功能性質(zhì)是可溶性（例如在細(xì)胞條件下）。在另一實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是聚集特 性。在另一實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是蛋白質(zhì)表達(dá)（例如在原核細(xì)胞中）。在另一實(shí)施方案 中，功能性質(zhì)是在制造過(guò)程中包涵體溶解之后的再折疊特性。在某些實(shí)施方案中，功能性質(zhì) 不是抗原結(jié)合親和力改進(jìn)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，一種或多種功能性質(zhì)的改進(jìn)對(duì)免疫結(jié) 合劑的結(jié)合親和力不具有實(shí)質(zhì)性影響。
[0024] 術(shù)語(yǔ)"CDR"是指抗體的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)主要促成抗原結(jié)合的六個(gè)高變區(qū)中的一個(gè)。 一種最通常用于六個(gè)CDR的定義由KabatE.A?等，（1991)Sequencesofproteinsof immunologicalinterest.NIHPublication91-3242)提供。如本文所用，CDR的Kabat定 義僅用于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶Rl、⑶R2和⑶R3(⑶RLl、⑶RL2、⑶RL3或L1、L2、L3)，& 及重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R2和⑶R3(⑶RH2、⑶RH3或H2、H3)。然而，如本文所用的重鏈可 變結(jié)構(gòu)域的⑶R1(⑶RH1或H1)是由以位置26起始，并且在位置36之前終止的殘基位置 (Kabat編號(hào)）定義。這個(gè)定義基本上是如由Kabat和Chotia不同定義的⑶RH1的融合 (對(duì)于圖解，也參見圖1)。
[0025] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體框架"是指可變結(jié)構(gòu)域VL或VH的一部分，其充當(dāng)這個(gè)可 變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)（CDR)的骨架。實(shí)質(zhì)上，它是無(wú)CDR的可變結(jié)構(gòu)域。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"表位"或"抗原決定簇"是指抗原上為免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的位點(diǎn) (例如TNF分子上的特定位點(diǎn)）。表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或 15個(gè)呈獨(dú)特空間構(gòu)象的連續(xù)或非連續(xù)氨基酸。參見例如EpitopeMappingProtocolsin MethodsinMolecularBiology,第 66 卷，G.E.Morris編（1996)。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"、"選擇性結(jié)合"、"選擇地結(jié)合"和"特異地結(jié)合"是指抗體結(jié) 合預(yù)定抗原上的表位。通常，抗體結(jié)合的親和力（KD)約小于1(T7M，如約小于l(T8M、l(r9M或 lO^M或甚至更低。術(shù)語(yǔ)"KD"或"Kd"是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。通 常，本發(fā)明抗體結(jié)合TNF的解離平衡常數(shù)（KD)小于約1(T7M，如約小于KT8M、1(T9M或10^1 或甚至更低，例如如在BIAC0RE儀器中使用表面等離子體共振（SPR)技術(shù)所測(cè)定。
[0028] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"核酸分子"是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可為單鏈或 雙鏈，但優(yōu)選是雙鏈DNA。當(dāng)核酸被置于與另一核酸序列成功能關(guān)系時(shí)，它被"可操作地連 接"。舉例來(lái)說(shuō)，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連接于編碼序列。
[0029] 術(shù)語(yǔ)"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)它已與之連接的另一核酸的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方 案中，載體是"質(zhì)粒"，其是指其中可連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在另一實(shí)施方案 中，載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可連接至病毒基因組中。本文公開的載體可能夠在 它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制（例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離哺乳動(dòng)物 載體），或可在引入宿主細(xì)胞中后整合至宿主細(xì)胞的基因組中，并且由此連同宿主基因組一 起復(fù)制（例如非游離哺乳動(dòng)物載體）。
[0030] 術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"是指其中已引入表達(dá)載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、微生 物、植物或動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選是大腸桿菌（Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis);釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)、 CH0(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢株系）或NS0細(xì)胞。
[0031] 術(shù)語(yǔ)"兔形目動(dòng)物"是指包含兔科（例如野兔和家兔）和鼠兔科（鼠兔）的兔形 目分類的成員。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，兔形目動(dòng)物是兔。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"兔"是指屬于 兔科的動(dòng)物。
[0032] 如本文所用，"同一性"是指兩個(gè)多肽、分子之間或兩個(gè)核酸之間的序列匹配。當(dāng) 兩個(gè)比較序列中的某一位置均被相同堿基或氨基酸單體亞單位占據(jù)時(shí)（例如如果兩個(gè)多 肽中的某一位置各自被賴氨酸占據(jù)），那么相應(yīng)分子在那個(gè)位置處是相同的。兩個(gè)序列之 間的"同一性百分比"隨在考慮空位的數(shù)目以及各空位的長(zhǎng)度下，由序列共有的相同位置的 數(shù)目而變，所述空位需要被引入以達(dá)成兩個(gè)序列的最優(yōu)比對(duì)。通常，比較是在兩個(gè)序列被比 對(duì)以給與最大同一性時(shí)進(jìn)行。所述比對(duì)可例如使用已并入GCG軟件包中的GAP程序中的 Needleman和Wunsch(J.MoI.Biol. (48):444_453(1970))算法的方法，利用Blossum62 矩 陣或PAM250矩陣、以及空位權(quán)重16、14、12、10、8、6或4和長(zhǎng)度權(quán)重1、2、3、4、5或6來(lái)提供。
[0033] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與由本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。盡管在實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明時(shí)可使用與本文所述的 那些方法和材料類似或等效的方法和材料，但以下描述適合方法和材料。在沖突的情況下， 以包括定義的本說(shuō)明書為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例僅具有說(shuō)明性而非意圖具有限制性。
[0034] 本發(fā)明的各個(gè)方面進(jìn)一步詳述于以下小節(jié)中。應(yīng)了解各種實(shí)施方案、優(yōu)選物和范 圍可任意組合。此外，視具體實(shí)施方案而定，所選定義、實(shí)施方案或范圍可能不適用。
[0035] 如果不另外陳述，那么氨基酸位置是根據(jù)AHo編號(hào)流程指示。AHo編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)一步 描述于Honegger,A?和Pluckthun，A. (2001)J.Mol.Biol. 309:657-670)中?；蛘?，可使用如 Kabat等（Kabat,E.A.，等（1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest, 第 5 版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào) 91-3242)中進(jìn)一步 所述的Kabat編號(hào)系統(tǒng)。用于鑒定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中的氨基酸殘基位置的兩種不同 編號(hào)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換表提供于A.Honegger,J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670 中。
[0036] 在第一方面，本發(fā)明提供一種用于移植來(lái)自兔形目動(dòng)物物種，例如來(lái)自兔的CDR 的人接受體框架序列。驚人地發(fā)現(xiàn)人單鏈VH框架a58(SEQIDNO: 1)實(shí)質(zhì)上可與兔抗體的 抗原結(jié)合位點(diǎn)高度相容。因此，a58VH代表用以構(gòu)建由兔環(huán)的移植獲得的穩(wěn)定人源化scFv 抗體片段的適合骨架。
[0037] 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種免疫結(jié)合劑接受體框架，其包含與SEQID No. 1具有至少70 %同一性的VH序列。
[0038] 所述序列可與任何其它適合可變輕鏈組合。優(yōu)選的可變輕鏈?zhǔn)且补_于 W003/097697中并指定為KI27的SEQID勵(lì):2，或如冊(cè)03/097697中公開的任何其它￥1序 列。
[0039] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，可變重鏈框架是通過(guò)接頭連接于可變輕鏈框架。接頭可為任 何適合接頭，例如包含序列GGGGS(SEQIDNO:5)的1至4個(gè)重復(fù)的接頭，優(yōu)選是（GGGGS)4 肽（SEQIDN0:4)，或如Alfthan等（1995)ProteinEng.8:725-731 中公開的接頭。
[0040] 因此，本發(fā)明提供一種免疫結(jié)合劑接受體框架，其包含
[0041] (丨）與5￡〇10吣.1具有至少70%同一性，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu) 選至少95%同一性的可變重鏈框架；和/或
[0042] (ii)與SEQIDNo. 2 具有至少 70% 同一性，優(yōu)選至少 75%、80%、85%、90%，更優(yōu) 選至少95%同一性的可變輕鏈框架。
[0043] 在非常優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種序列與SEQIDNO: 3具有至少60%，更優(yōu) 選至少65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %同一性的免疫結(jié)合劑。
[0044] 框架可與實(shí)際上任何兔⑶R相容。在含有不同兔⑶R下，與兔野生型單鏈相反，它 被充分表達(dá)并良好產(chǎn)生，并且仍然幾乎完全保留原始供體兔抗體的親和力。
[0045] 如本文所述的免疫結(jié)合劑接受體框架可在重鏈框架中，優(yōu)選在位置12、103和 144(AHo編號(hào)）處包含可溶性增強(qiáng)取代。優(yōu)選地，疏水性氨基酸被親水性更大的氨基酸取 代。親水性氨基酸是例如精氨酸（R)、天冬酰胺（N)、天冬氨酸（D)、谷氨酰胺（Q)、甘氨酸 (G)、組氨酸（H)、賴氨酸（K)、絲氨酸（S)和蘇氨酸（T)。更優(yōu)選地，重鏈框架包含（a)在位 置12處的絲氨酸⑶；(b)在位置103處的絲氨酸⑶或蘇氨酸⑴和/或（c)在位置144 處的絲氨酸（S)或蘇氨酸（T)。
[0046] 此外，穩(wěn)定性增強(qiáng)氨基酸可存在于可變輕鏈框架的一個(gè)或多個(gè)位置1、3、4、10、47、 57、91和103 (AHo編號(hào)）處。更優(yōu)選地，可變輕鏈框架包含在位置1處的谷氨酸（E)、在位 置3處的纈氨酸（V)、在位置4處的亮氨酸（L)、在位置10處的絲氨酸（S);在位置47處的 精氨酸（R)、在位置57處的絲氨酸（S)、在位置91處的苯丙氨酸（F)和/或在位置103處 的纈氨酸（V)。
[0047] 因?yàn)楣劝滨０发龋﹥A向于脫氨，所以在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，VH在位置141處包 含甘氨酸（G)。這個(gè)取代可改進(jìn)蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
[0048] 舉例來(lái)說(shuō)，本文公開的接受體框架可用于產(chǎn)生保留非人CDR所源于的非人抗體的 結(jié)合性質(zhì)的人抗體或人源化抗體。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋一種如本文公開的 免疫結(jié)合劑接受體框架，其進(jìn)一步包含來(lái)自供體免疫結(jié)合劑，優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物免疫結(jié)合 劑，更優(yōu)選來(lái)自兔形目動(dòng)物免疫結(jié)合劑，并且最優(yōu)選來(lái)自兔的重鏈CDR1、CDR2和CDR3和/ 或輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種對(duì)所需抗原具有特 異性的免疫結(jié)合劑，其包含
[0049] (i)兔形目動(dòng)物的可變輕鏈⑶R;以及
[0050] (ii)與SEQIDNO. 1 具有至少 70%，優(yōu)選至少 75%、80%、85%、90%、95%，并且 最優(yōu)選100%同一性的人可變重鏈框架。
[0051] 優(yōu)選地，兔形目動(dòng)物是兔。更優(yōu)選地，免疫結(jié)合劑包含來(lái)自供體免疫結(jié)合劑的重鏈 CDR1、CDR2和CDR3以及輕鏈CDR1、CDR2和CDR3。
[0052] 如本領(lǐng)域中所知，許