具有磷脂酶c活性的多肽以及對(duì)其進(jìn)行編碼的多核苷酸的制作方法
【專利說明】具有磷脂酶C活性的多肽以及對(duì)其進(jìn)行編碼的多核苷酸
[0001] 對(duì)序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包括一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。
[0003] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及具有磷脂酶C活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及 包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體以及宿主細(xì)胞連同產(chǎn)生和使用這些多肽的方法。
[0005] 另外，本發(fā)明涉及通過利用具有磷脂酶C活性的酶來降低包括高量的非水合磷的 食用油中的含磷組分的含量的方法。
[0006] 相關(guān)技術(shù)說明
[0007] 己知幾種類型的磷脂酶，根據(jù)磷脂分子中受到攻擊的鍵的位置，這些磷脂酶在其 特異性方面存在不同。磷脂酶Al(PLAl)去除1-位的脂肪酸而產(chǎn)生游離的脂肪酸和1-溶 血-2-?；字?。磷脂酶A2(PLA2)去除2-位的脂肪酸而產(chǎn)生游離的脂肪酸和1-酰 基-2-溶血磷脂。將術(shù)語磷脂酶B(PLB)用于具有A1和A2兩者活性的磷脂酶。磷脂酶C(PLC) 去除磷酸部分而產(chǎn)生1，2二酰甘油和磷酸脂。磷脂酶D(PLD)產(chǎn)生1，2-二酰甘油-磷酸和 喊性基團(tuán)。
[0008] 具有磷脂酶C活性的多肽可應(yīng)用于工業(yè)方法，例如用于精煉植物油。在消費(fèi)之前， 將植物油脫膠以提供精煉的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性植物油，其具有中性味道和淺顏色。該脫膠方法包 括從富含甘油三酯的油級(jí)分去除磷脂組分（膠）。
[0009] 傳統(tǒng)上，該脫膠方法已基于水提取、酸亦或堿處理，隨后是分離方法。由于磷脂組 分的乳化特性，該脫膠過程已導(dǎo)致油（即甘油三酯）的損失。
[0010] 由于磷脂的有效水解（其減少了乳化特性），酶促脫膠降低了油損失。對(duì)于具有磷 脂酶C活性且適用于在食用油的酶促脫膠中應(yīng)用的另外的酶存在著需要。
[0011] 一種具有磷脂酶C活性且與本發(fā)明的酶有88 %序列一致性的酶從W02012062817 中已知。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 諸位發(fā)明人已經(jīng)從青霉屬菌株或更具體地從2007年發(fā)現(xiàn)于中國的埃默森青霉菌 的菌株中分離一種具有磷脂酶C活性的新酶。因此，本發(fā)明提供了具有磷脂酶C活性的新 穎多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。
[0014] 本發(fā)明涉及具有磷脂酶C活性的分離的多肽，這些分離的多肽選自下組，該組由 以下各項(xiàng)組成：
[0015] (a) -種多肽，該多肽與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%的序列一致性；
[0016] (b) -種由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與（i)SEQ IDNO: 1的成熟多肽編碼序列、或（ii) (i)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交；
[0017] (c) -種多肽，該多肽由與SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列具有至少90%序列 一致性的多核苷酸編碼；
[0018] (d)SEQIDNO:2的成熟多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）位 置處包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0019] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有磷脂酶C活性。
[0020] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸；核酸構(gòu)建體；重組表達(dá)載體； 包括這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些多肽的方法。
[0021] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的這些多肽的組合物。
[0022] 本發(fā)明還涉及上述多肽或上述組合物在磷脂水解的方法中，諸如在降低食用油中 的磷脂含量的方法中的用途。
[0023] 本發(fā)明還涉及用一種編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的一種轉(zhuǎn)基因植物、植物 部分或植物細(xì)胞。
[0024] 定義
[0025] 磷脂酶C活性：術(shù)語"磷脂酶C活性"意指催化以下反應(yīng)的活性:A磷脂酰膽堿+H20 =1，2-sn-二酰甘油+磷酸膽堿。根據(jù)"材料與方法"中所描述的程序來確定磷脂酶C活 性。一種具有"磷脂酶C活性"的酶可以屬于EC3. 1. 4. 3。
[0026]本發(fā)明的這些多肽具有SEQIDNO: 2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至 少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、以及至少100 %的磷脂酶C 活性。
[0027]術(shù)語"磷脂酶C活性"意指一種具有磷脂酶C的多肽將針對(duì)磷脂酰膽堿（PC)、磷脂 酰乙醇胺（PE)、磷脂酸（PA)和磷脂酰肌醇（PI)中的一種或多種具有活性。
[0028] 等位基因變體：術(shù)語"等位基因變體"意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或 更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多 態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊模ㄔ谒幋a的多肽中沒有改變）或可編碼具有改變的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0029] 催化結(jié)構(gòu)域：術(shù)語"催化結(jié)構(gòu)域"意思指一種酶的包含該酶的催化機(jī)器的區(qū)域。 [0030]cDNA:術(shù)語"cDNA"意指可以通過從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分 子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對(duì)應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。 早先的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的 步驟進(jìn)行加工，包括剪接。
[0031] 編碼序列：術(shù)語"編碼序列"意指直接指定一個(gè)多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個(gè)開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個(gè)起始密碼子（如ATG、 GTG或TTG)開始并且以一個(gè)終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0032] 控制序列：術(shù)語"控制序列"意指對(duì)于表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是天然的（即，來自相 同基因）或外源的（即，來自不同基因），或相對(duì)于彼此是天然的或外源的。此類控制序列 包括但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。 至少，控制序列包括啟動(dòng)子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與 編碼一種多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以 提供有多個(gè)接頭。
[0033] 表達(dá)：術(shù)語"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0034] 表達(dá)載體：術(shù)語"表達(dá)載體"意指線性或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼多肽的多 核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列相連接。
[0035]片段：術(shù)語"片段"意指在一種成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè) (例如若干個(gè)）氨基酸的一種多肽。其中該片段具有磷脂酶C活性。在一個(gè)方面，一個(gè)片段 包含至少1700個(gè)氨基酸殘基（例如，SEQIDNO:2的氨基酸1至1700)、至少1600個(gè)氨基 酸殘基（例如，SEQIDNO:2的氨基酸1至1600)、或至少1500個(gè)氨基酸殘基（例如，SEQ IDNO:2的氨基酸1至1500)。
[0036] 宿主細(xì)胞：術(shù)語"宿主細(xì)胞"意指任何細(xì)胞類型，該細(xì)胞類型對(duì)于用包含本發(fā)明的 多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的。術(shù)語"宿主細(xì)胞"涵 蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0037] 分離的：術(shù)語"分離的"意指處于自然界中不出現(xiàn)的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的 物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括（1)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)，（2)包括但不限于任何酶、變體、核 酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所 有天然發(fā)生的成分中去除；（3)相對(duì)于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或（4)通 過增加該物質(zhì)相對(duì)于與其本質(zhì)相關(guān)的其他組分的量而修飾的任何物質(zhì)（例如，編碼該物質(zhì) 的基因的多拷貝；使用比編碼該物質(zhì)的基因本質(zhì)相關(guān)的啟動(dòng)子強(qiáng)的啟動(dòng)子）。一種分離的 物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
[0038] 成熟多肽：術(shù)語"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ IDNO:2的氨基酸1至594。SEQIDNO:2的氨基酸-16至-1是一種信號(hào)肽。本領(lǐng)域中已 知的是，一個(gè)宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由同一多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽（即， 具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0039] 成熟多肽編碼序列：術(shù)語"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有磷脂酶C活性的成熟 多肽的一種多核苷酸。在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO: 1的核苷酸49至1830。 SEQIDNO: 1的核苷酸1至48編碼一種信號(hào)肽。
[0040] 核酸構(gòu)建體：術(shù)語"核酸構(gòu)建體"意指單-鏈或雙鏈的一種核酸分子，該核酸分子 是從天然存在的基因中分離的，或者以一種本來不存在于自然界中的方式被修飾成含有核 酸的區(qū)段，或者是合成的，該核酸分子包含一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0041] 可操作地連接：術(shù)語"可操作地連接"意指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對(duì)于多核 苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置處，從而使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。
[0042] 序列一致性：兩個(gè)氨基酸序列之間或者兩個(gè)核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)度通過參數(shù) "序列一致性"來描述。
[0043] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件 (TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，賴斯（Rice)等人，2000,遺 傳學(xué)趨勢(shì)（TrendsGenet.) 16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本）的尼德爾（Needle) 程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德爾曼）和 Wunsch(翁施），1970,分子生物學(xué)雜志（J.Mol.Biol.)48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸 序列之間的序列一致性。使用的這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5,以及EBLOSUM62 (BLOSUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出 (使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[0044](一致的殘基X100V(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0045] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件， 賴斯（Rice)等人，2000,見上文）（優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的尼德爾程序中所實(shí)施的尼 德爾曼-翁施算法（尼德爾曼（Needleman)和翁施（Wunsch)，1970,見上文）來確定兩個(gè) 脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。使用的這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰 分0. 5以及EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長(zhǎng)的一 致性"的輸出（使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[0046](一致的脫氧核糖核苷酸X100V(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0047] 嚴(yán)格條件：
[0048]非常低嚴(yán)格條件：術(shù)語"非常低嚴(yán)格條件"是指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探 針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并變性 的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、 0. 2 %SDS，在45 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0049]低嚴(yán)格條件：術(shù)語"低嚴(yán)格條件"意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言， 遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚 精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、0. 2% SDS，在50 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0050]中嚴(yán)格條件：術(shù)語"中嚴(yán)格條件"意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言， 遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚 精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、0. 2% SDS，在55 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0051]中-高嚴(yán)格條件：術(shù)語"中-高嚴(yán)格條件"意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探 針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并變性 的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、 0. 2 %SDS，在60 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0052]高嚴(yán)格條件：術(shù)語"高嚴(yán)格條件"意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言， 遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚 精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、0. 2% SDS，在65 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0053]非常高嚴(yán)格條件：術(shù)語"非常高嚴(yán)格條件"是指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探 針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并變性 的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC、 0. 2 %SDS，在70 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0054] 子序列：術(shù)語"子序列"意指使一個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）核苷酸從成熟多肽編 碼序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中該子序列編碼具有磷脂酶C活性的片段。 在一個(gè)方面，一個(gè)子序列包含至少1800個(gè)核苷酸（例如，SEQIDNO: 1的核苷酸1至1800)， 至少1700個(gè)核苷酸（例如，SEQIDNO: 1的核苷酸1至1700)，或至少1600個(gè)核苷酸（例 如，SEQIDNO: 1的核苷酸1至1600)。
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