多兔VH鏈相對于鼠類和人對應物具有額外成對半胱氨酸。除 在cys22與cys92之間形成的保守二硫橋之外，也存在cys21_cys79橋，以及在一些兔鏈中 在⑶RH1的末個殘基與⑶RH2的首個殘基之間形成的⑶R間S-S橋。此外，多對半胱氨酸 殘基常見于CDR-L3中。此外，許多兔抗體CDR不屬于任何先前已知的典型結(jié)構(gòu)。具體來說， ⑶R-L3常比人或鼠類對應物的⑶R-L3長得多。
[0053] 如之前所陳述，將非人CDR移植于本文公開的框架上會產(chǎn)生其中CDR是以適當構(gòu) 象顯示的分子。如果需要，那么可通過移植非人供體免疫結(jié)合劑的抗原相互作用框架殘基 來改進免疫結(jié)合劑的親和力。這些位置可例如通過以下方式來鑒定
[0054] (i)鑒定相應生殖系祖先序列，或者，在高度同源框架序列的情況下，通過使用共 有序列；
[0055] (ii)產(chǎn)生供體可變結(jié)構(gòu)域序列與步驟（i)的生殖系祖先序列或共有序列的序列 比對；以及
[0056] (iii)鑒定不同殘基。
[0057] 在許多情況下，在體內(nèi)親和力產(chǎn)生過程期間，分子的表面上的不同殘基突變，假定 來產(chǎn)生對抗原的親和力。
[0058] 在另一方面，本發(fā)明提供一種包含本文所述的免疫結(jié)合劑接受體框架的免疫結(jié)合 劑。所述免疫結(jié)合劑可例如為scFv抗體、全長免疫球蛋白、Fab片段、Dab或納米抗體。
[0059] 在優(yōu)選實施方案中，使免疫結(jié)合劑連接于一種或多種分子，例如治療劑（如細胞 毒性劑）、細胞因子、趨化因子、生長因子或其它信號傳導分子、成像劑或第二蛋白質(zhì)（如轉(zhuǎn) 錄活化劑或DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）。
[0060] 如本文公開的免疫結(jié)合劑可例如用于診斷應用、治療應用、靶標驗證或基因療法 中。
[0061] 本發(fā)明進一步提供一種編碼本文公開的免疫結(jié)合劑接受體框架或如本文公開的 免疫結(jié)合劑的分離的核酸。
[0062] 在另一實施方案中，提供包含本文公開的核酸的載體。
[0063] 如本文公開的核酸或載體可例如用于基因療法中。
[0064] 本發(fā)明進一步涵蓋一種包含本文公開的載體和/或核酸的宿主細胞。
[0065] 此外，提供一種組合物，其包含如本文公開的免疫結(jié)合劑接受體框架、如本文公開 的免疫結(jié)合劑、如本文公開的分離的核酸或如本文公開的載體。
[0066] 本文公開的序列是以下序列（X殘基是⑶R插入位點，并且含有至少3個并且最多 50個氨基酸）：
[0067] SEQ ID NO:l:可變重鏈框架a58
[0068] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (X) n=3_
[0069] 50WVRQAPGKGLEWVS (X) n=3_
[0070] 50RESVSRDNSKNTVYLQINSLRAEDTAVYYCAM(X)n=3_50WGQGTLVTVSS
[0071] SEQIDNO:2 :可變輕鏈框架KI27
[0072] EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3_50WYQQKPGKAPKLLIY(X) n=3_50
[0073] GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3_5〇FGQGTKLTVLG
[0074] SEQIDNO:3 :框架序列
[0075] EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X) n=3_50WYQQKPGKAPKLLIY(X) n=3_50
[0076] GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3_50FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGG GS
[0077] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(X)n=3_50ffVRQAPGKGLEWVS(X)n=3_50RESVSRDNSKNTVYLOI NSLRAEDTAVYYCAM(X)n=3_50WGOGTLVTVSS
[0078]SEQIDN0:4:接頭
[0079] GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
[0080] 在另一方面，本發(fā)明提供用于通過將非人供體抗體的CDR移植于穩(wěn)定和可溶性抗 體框架上來使非人抗體人源化的方法。在特別優(yōu)選實施方案中，來自兔抗體的CDR主干和 框架是上述那些。
[0081] 用于將⑶R移植到人接受體框架中的一般性方法已由Winter在美國專利號 5, 225, 539中，以及由Queen等在W09007861A1中公開，所述專利據(jù)此以引用的方式整體并 入本文。用于將來自兔單克隆抗體的CDR移植于所選框架上的一般性策略與Winter等和 Queen等的策略相關(guān)，但在某些關(guān)鍵方面有分歧。具體來說，本發(fā)明方法與本領(lǐng)域中已知的 典型Winter和Queen方法的分歧在于如本文公開的人抗體框架特別適合作為人或非人供 體抗體的接受體。因此，不同于Winter和Queen的一般性方法，用于本發(fā)明的人源化方法 的框架序列不必是與供體CDR所源于的非人（例如兔）抗體的序列展現(xiàn)最大序列類似性的 框架序列。此外，不需要自供體序列移植框架殘基來支持CDR構(gòu)象。至多，可引入位于框架 中的抗原結(jié)合氨基酸或在體細胞高突變期間出現(xiàn)的其它突變。
[0082] 以下描述用以產(chǎn)生具有高可溶性和穩(wěn)定性的人源化兔源性抗體的移植方法的特 定細節(jié)。
[0083] 在本發(fā)明方法的示例性實施方案中，首先鑒定CDR供體抗體的氨基酸序列，并且 使用常規(guī)序列比對工具（例如Needleman-Wunsch算法和Blossum矩陣）比對序列?？墒?用常規(guī)抗體編號系統(tǒng)進行空位引入和殘基位置命名。舉例來說，可使用免疫球蛋白可變結(jié) 構(gòu)域的AHo編號系統(tǒng)。也可應用Kabat編號流程，因為它是最廣泛采用的用于對抗體中的 殘基編號的標準。Kabat編號可例如使用SUBM程序加以指定。這個程序根據(jù)由Kabat 和同事建立的系統(tǒng)來分析抗體序列的可變區(qū)，并且對序列編號（Deret等1995)。對框架 和CDR區(qū)的界定通常是遵循基于序列可變性，并且是最通常使用的Kabat定義來進行。然 而，對于CDR-H1，指定優(yōu)選是Kabat定義（意味著接觸數(shù)據(jù)是通過分析一子組3D復合結(jié)構(gòu) 的抗體與抗原之間的接觸來產(chǎn)生（MacCallum等，1996))與Chotia定義（其基于結(jié)構(gòu)環(huán) 區(qū)域的位置）的組合（也參見圖1)。用于鑒定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中的氨基酸殘基位 置的兩種不同編號系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換表提供于A.Honegger,J.Mol.Biol. 309(2001)657-670中。 Kabat編號系統(tǒng)進一步描述于Kabat等（Kabat,E.A?，等（1991)SequencesofProteinsof ImmunologicalInterest,第 5 版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH 出版號 91-3242)中。AHo編號系統(tǒng)進一步描述于（Honegger,A?和Pluckthun，A. (2001) J.Mol.Biol. 309:657-670)中。
[0084] 兔單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域可例如使用例如序列分析算法的EXCEL執(zhí)行程序和 基于分析人抗體譜系的分類方法來分類成相應人子組（Knappik等，2000,JMolBiol. 2月 11 日；296(1) : 57-86)。
[0085] 可指定供體抗原結(jié)合區(qū)的CDR構(gòu)象，隨后也可鑒定為維持不同典型結(jié)構(gòu)所需的殘 基位置。使用Chothia(1989)定義確定兔抗體的六個抗體高變區(qū)中的五個（L1、L2、L3、H1 和H2)的⑶R典型結(jié)構(gòu)。
[0086] 本發(fā)明抗體可進一步優(yōu)化來顯示增強的功能性質(zhì)，例如增強的可溶性和/或穩(wěn)定 性。在某些實施方案中，根據(jù)2008年3月12日提交的題為"SequenceBasedEngineering andOptimizationofSingleChainAntibodies"的PCT申請序列號PCT/EP2008/001958 中公開的"功能共有"方法優(yōu)化本發(fā)明抗體，所述申請以引用的方式并入本文。
[0087] 用于取代的示例性框架殘基位置和示例性框架取代描述于2008年6月25日提交 的題為"MethodsofModifyingAntibodies,andModifiedAntibodieswithImproved FunctionalProperties"的PCT申請?zhí)朠CT/CH2008/000285 以及 2008 年 6 月 25 日提交的 題為"SequenceBasedEngineeringandOptimizationofSingleChainAntibodies" 的PCT申請?zhí)朠CT/CH2008/000284 中。
[0088] 在其它實施方案中，本發(fā)明的免疫結(jié)合劑包含2008年6月25日提交的題為 "SolubilityOptimizationofImmunobinders" 的美國臨時申請序列號 61/075, 692 中所 述的一個或多個穩(wěn)定性增強突變。在某些優(yōu)選實施方案中，免疫結(jié)合劑在選自由12、103和 144 (AHo編號慣例）組成的重鏈氨基酸位置組的氨基酸位置處包含可溶性增強突變。在一 個優(yōu)選實施方案中，免疫結(jié)合劑包含一個或多個選自由以下組成的組的取代：(a)在重鏈 氨基酸位置12處的絲氨酸（S) ; (b)在重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸（S)或蘇氨酸（T); 以及（c)在重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶或蘇氨酸（T)。在另一實施方案中，免疫結(jié) 合劑包含以下取代：(a)在重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸（S) ; (b)在重鏈氨基酸位置103 處的絲氨酸（S)或蘇氨酸（T);以及（c)在重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸（S)或蘇氨酸 ⑴。
[0089] 在某些優(yōu)選實施方案中，免疫結(jié)合劑在輕鏈接受體框架的在輕鏈可變區(qū)的根據(jù) AHo編號系統(tǒng)的位置1、3、4、10、47、57、91和103中的至少一個中的框架殘基處包含穩(wěn)定性 增強突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈接受體框架包含一個或多個選自由以下組成的組的取 代：(a)在位置1處的谷氨酸（E)，（b)在位置3處的纈氨酸（V)，（c)在位置4處的亮氨酸 (L) ; (d)在位置10處的絲氨酸⑶；（e)在位置47處的精氨酸（R) ; (e)在位置57處的絲 氨酸⑶；（f)在位置91處的苯丙氨酸（F);以及（g)在位置103處的纈氨酸（V)。
[0090] 可使用多種可用方法中的任一個來產(chǎn)生包含如上所述的突變的人源化抗體。
[0091] 因此，本發(fā)明提供一種根據(jù)本文所述的方法加以人源化的免疫結(jié)合劑。
[0092] 在某些優(yōu)選實施方案中，所述免疫結(jié)合劑的靶標抗原是VEGF或TNFa。
[0093] 本發(fā)明中所述或通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的多肽可例如使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來 合成?；蛘?，可合成編碼所需可變區(qū)的核酸分子，并且通過重組方法產(chǎn)生多肽。
[0094] 舉例來說，一旦已確定人源化可變區(qū)的序列，即可通過分子生物學領(lǐng)域中熟知的 技術(shù)制備那個可變區(qū)或包含它的多肽。更具體來說，重組DNA技術(shù)可用于通過用核酸序列 (例如編碼所需可變區(qū)（例如修飾的重鏈或輕鏈；其可變結(jié)構(gòu)域或其其它抗原結(jié)合片段） 的DNA序列）轉(zhuǎn)化宿主細胞來產(chǎn)生廣泛范圍的多肽。
[0095] 在一個實施方案中，可制備包括可操作地連接于編碼至少乂11或^的DNA序列的啟 動子的表達載體。必要或需要時，可制備包括可操作地連接于編碼互補可變結(jié)構(gòu)域的DNA 序列的啟動子的