一種酶活性提高的丙酮酸羧化酶突變體p474n及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶活性提高的丙酮酸羧化酶突變體P474N及其應(yīng)用，屬于遺傳工 程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作為一種真核模式微生物，因具有：遺傳 信息豐富，代謝改造操作方便；營養(yǎng)需求簡單，分離提取工藝成本低廉；在低pH條件下（甚 至pH〈3. 0)生長良好；能夠耐受高濃度的底物；被FDA認(rèn)證為GRAS(General Regarded As Safe)微生物，發(fā)酵產(chǎn)品具有安全性等優(yōu)點(diǎn)而成為發(fā)酵生產(chǎn)羧酸（乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延 胡索酸、琥珀酸、a -酮戊二酸等）的潛在最適微生物。然而，釀酒酵母在高濃度糖及通風(fēng)的 條件分批發(fā)酵產(chǎn)生大量的乙醇，對于以羧酸為目標(biāo)產(chǎn)物來說，乙醇的大量積累使得碳流大 量的損失，且釀酒酵母本身不具備羧酸的合成途徑。通過弱化乙醇途徑中的關(guān)鍵酶的活性， 可以減少通往乙醇的碳代謝流，從而減少碳流的損失；在此基礎(chǔ)上，可通過阻止或弱化目標(biāo) 羧酸的進(jìn)一步代謝，來構(gòu)建目標(biāo)羧酸的合成途徑。丙酮酸羧化酶的作用是將丙酮酸轉(zhuǎn)化為 草酰乙酸，進(jìn)而可將碳流引入到目標(biāo)羧酸的合成途徑，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地 描述為"生物閥門"，如何強(qiáng)化丙酮酸羧化反應(yīng)，將碳流更有效地引入到目標(biāo)羧酸的合成途 徑，成為代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)羧酸的一個(gè)關(guān)鍵問題。已有研宄表明細(xì)胞中丙酮酸羧 化酶活性的高低對蘋果酸、琥珀酸、谷氨酸的積累有著重要作用。任何以二元羧酸為目標(biāo)產(chǎn) 物的釀酒酵母發(fā)酵工藝，都將面臨同樣一個(gè)問題：如何強(qiáng)化丙酮酸羧化反應(yīng)，促進(jìn)碳流由丙 酮酸流向目標(biāo)羧酸的合成途徑？通過對丙酮酸羧化酶進(jìn)行定向改造來提高延胡索酸等二 元羧酸的產(chǎn)量目前未見報(bào)道，因此，本發(fā)明所提供的方案，對于利用釀酒酵母生產(chǎn)羧酸的研 宄具有普遍的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種提高丙酮酸羧化酶活性的方法及基因工程 菌，為代謝工程改造釀酒酵母高效生產(chǎn)延胡索酸及其它二元羧酸打下基礎(chǔ)（注：丙酮酸羧 化酶在釀酒酵母高效生產(chǎn)二元羧酸中的共同作用是將碳流由丙酮酸引入到目標(biāo)產(chǎn)物的合 成途徑）。本發(fā)明在構(gòu)建乙醇減少、可積累延胡索酸的工程菌的基礎(chǔ)上，通過過量表達(dá)源 于米根霉（Rhizopus oryzae)丙酮酸羧化酶基因RoPYC，并通過焚光定位確認(rèn)該酶定位在 釀酒酵母細(xì)胞的胞質(zhì)中，進(jìn)而對該酶的Proline474位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，結(jié)合生物素濃度添 加，提高了丙酮酸羧化酶的活性，明顯促進(jìn)了延胡索酸的積累。
[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種丙酮酸羧化酶突變體，所述突變體是在氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示的親本米根霉丙酮酸羧化酶的基礎(chǔ)上，對第474位的氨基酸進(jìn)行了 突變。
[0005] 所述突變，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是進(jìn)行了飽和突變。
[0006] 所述突變體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將第474位的脯氨酸突變成為天冬 酰胺。
[0007] 所述親本米根霉丙酮酸羧化酶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO. 2所不的序列。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)所述突變體的基因工程菌。
[0009] 所述基因工程菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是釀酒酵母。
[0010] 所述釀酒酵母，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，同時(shí)缺失了丙酮酸脫羧酶roci、乙醇 脫氫酶ADH1、延胡索酸酶FUM1。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用表達(dá)所述突變體的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)二 元羧酸的方法。
[0012] 所述二元羧酸，包括延胡索酸、蘋果酸、琥珀酸、a-酮戊二酸等。
[0013] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是用于促進(jìn)延胡索酸的積累。
[0014] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在丙酮酸脫羧酶roci、乙醇脫氫酶 ADH1和延胡索酸酶FUM1同時(shí)缺失的酵母菌中，過表達(dá)所述丙酮酸羧化酶突變體。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述丙酮酸脫羧酶基因roCl的核苷酸序列如Gene ID:850733所示，乙醇脫氫酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示，延胡索酸酶 基因FUM1的核苷酸序列如Gene ID:855866所示。
[0016] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加生物素。所 述生物素添加量可以是0-128 y g/L。
[0017] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是：將過表達(dá)丙酮酸羧化酶突變體的三基 因缺失菌株 Saccharomyces cerevisiae CEN. PK2-1C A F^Cl A ADH1 A FUM1 的種子液，接 種至發(fā)酵培養(yǎng)基，與28-32°C、150-250rpm條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0018] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是將30°C、220rpm下培養(yǎng)24h的基因 工程菌種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)96h。
[0019] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述突變體以及所述突變體得到的延胡索酸在食品、飼料、化 工、藥物制備等方面的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的突變體命名：是以SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列為基準(zhǔn)，采用"原始氨基 酸位置替換的氨基酸"來表示突變體。比如P474N代表將位置474的氨基酸由親本的脯氨 酸（Pro, P)替換為天冬酰胺（Asn，N)。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：（1)對米根霉的丙酮酸羧化酶的P474位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變， 得到了比酶活提高的丙酮酸羧化酶突變體P474N，其比酶活較親本提高了 12.8% ; (2)構(gòu) 建了過表達(dá)丙酮酸羧化酶突變體的釀酒酵母，能夠有效提高二元羧酸的產(chǎn)量，為高效生產(chǎn) 延胡索酸及其它二元羧酸創(chuàng)造了條件，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和前景；在丙酮酸脫羧 酶H)C1、乙醇脫氫酶ADH1和延胡索酸酶FUM1同時(shí)缺失的酵母菌的延胡索酸產(chǎn)量提高了 13. 3% ; (3)通過在發(fā)酵過程中添加生物素，可使延胡索酸產(chǎn)量達(dá)到357mg/L。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :RoPYC-GFP蛋白定位觀察；
[0023] 圖2 :丙酮酸羧化酶突變菌株的富馬酸產(chǎn)量對比圖；
[0024] 圖3 :RoPYC P474位點(diǎn)定點(diǎn)突變對丙酮酸羧化酶活性的影響；
[0025] 圖4 :不同濃度生物素添加對表達(dá)P474N的工程菌的延胡索酸積累的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 乙醇、殘?zhí)呛考把雍魉岬臏y定方法：采用高效液相色譜儀（HPLC)檢測。發(fā)酵 液經(jīng)處理且上清液經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜過濾后，利用RID (示差折光檢測器）檢測乙醇和殘 糖含量，利用VWD(紫外檢測器）檢測延胡索酸含量，液相色譜方法如下：高效液相色譜儀為 美國Waters公司產(chǎn)品，型號為1515,色譜柱為Aminex HPX-87H column (Bio-Rad)。柱溫： 35°C;流動相：0. 0275% (v/v)稀硫酸，經(jīng)0. 22 ym濾膜過濾并除氣；流速：0. 6mL/min ;檢測 時(shí)間：25min ;進(jìn)樣量：20yL。
[0027] 生物量的測定方法（Bio-Rid核酸儀）：用0. 1M HC1稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，設(shè)定波長為 600nm，取200 y L測定其吸光值。
[0028] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去離子水容，pH自然，高壓 滅菌（115°C，20min)。
[0029] 發(fā)酵培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源3. 4g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分別添 加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，添加碳酸鈣5g/L，裝液量 為40mL/250mL。可添加0-128 y g/L的生物素。
[0030] 酵母轉(zhuǎn)化方法（質(zhì)粒）：（1)在3mLYro液體培養(yǎng)基中接入平板活化的釀酒酵母 單菌落，30°C、220rpm培養(yǎng)過夜；（2)倒?jié)MEP管菌液，在4000rpm條件下進(jìn)行室溫lmin離 心；（3)適量無菌水水洗，在4000rpm條件下進(jìn)行室溫lmin離心；（4)依次加入1. 0M LiAc 36 y L，10mg/mL ssDNA 10 y L(ssDNA 提前沸水浴 5min，冰上放置 5min)，質(zhì)粒 500ng，50% PEG240 y L，溫和混勻；（5)42°C熱激30分鐘；（6)在4000rpm條件下進(jìn)行室溫lmin離心， 加lmL無菌水水洗；（7) 4000rpm離心lmin，留適量水吹吸細(xì)胞，涂布選擇性平板，30°C培養(yǎng) 3-5d〇
[0031] 實(shí)施例1 :突變位點(diǎn)的選擇
[0032] 如何通過定點(diǎn)突變技術(shù)來提高丙酮酸羧化酶的活性，難點(diǎn)在于突變位點(diǎn)的確定。
[0033] 本發(fā)明將來源于假單胞菌、芽孢桿菌、根瘤菌、分支桿菌、葡萄球菌、古細(xì)菌以及真 核細(xì)胞等不同種屬的丙酮酸羧化酶進(jìn)行氨基酸序列比對，最終選擇對RoPYC的P474進(jìn)行19 個(gè)飽和突變，并將突變菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)考察突變對延胡索酸積累的影響。
[0034] 實(shí)施例2 :RoPYC在釀酒酵母中的定位研宄
[0035] 1、TEFlpromoter 和 RoPYC 基因 0RF 克隆到 pGFP33 載體
[0036] 按照同源重組試劑盒原理，設(shè)計(jì)兩端帶有15個(gè)堿基以上與載體同源的引物，如表 1，小寫字母為同源臂，大寫字母為PCR引物。
[0037] 表1擴(kuò)增RoPYC基因的引物
[0038]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丙酮酸羧化酶突變體，其特征在于，所述突變體是在氨基酸序列如SEQIDNO.I 所示的米根霉丙酮酸羧化酶的基礎(chǔ)上，對第474位的氨基酸進(jìn)行了突變。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體是將第474位的脯氨酸突變 成為天冬酰胺。
3. 表達(dá)權(quán)利要求1或2所述突變體的基因工程菌。
4. 權(quán)利要求1-2任一所述突變體在有機(jī)酸生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
5. -種利用權(quán)利要求1所述突變體促進(jìn)延胡索酸積累的方法，其特征在于，所述方法 是在丙酮酸脫羧酶roCl、乙醇脫氫酶ADHl和延胡索酸酶FUMl同時(shí)缺失的酵母菌中，過表達(dá) 所述丙酮酸羧化酶突變體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸脫羧酶基因roci的核苷酸序 列如GeneID:850733所示，乙醇脫氫酶基因ADHl的核苷酸序列如GeneID:854068所示， 延胡索酸酶基因FUMl的核苷酸序列如GeneID:855866所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加 生物素。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法是：將過表達(dá)丙酮酸羧化酶突變 體的三基因缺失菌株SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1CAPDClAADHlAFUMl的 種子液，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，與28_32°C、150_250rpm條件下進(jìn)行培養(yǎng)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中 含有0-128yg/L的生物素。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5-8任一所述方法得到的延胡索酸。
10. 權(quán)利要求9所述延胡索酸在食品、飼料、化工、藥物制備方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶活性提高的丙酮酸羧化酶突變體P474N及其應(yīng)用，屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明將米根霉的丙酮酸羧化酶的P474位點(diǎn)突變成了天冬酰胺，得到的突變體酶活提高了12.8％。在敲除PDC1和ADH1的基礎(chǔ)上敲除基因FUM1，同時(shí)過量丙酮酸羧化酶突變體P474N，發(fā)現(xiàn)延胡索酸產(chǎn)量提高了13.3％。同時(shí)通過添加64μg/L的生物素，延胡索酸產(chǎn)量達(dá)到357mg/L，較不添加生物素時(shí)(256.7±3.0mg/L)提高了37％。該發(fā)明有效強(qiáng)化了碳代謝流由丙酮酸進(jìn)入延胡索酸的合成途徑，為構(gòu)建工程酵母高效生產(chǎn)延胡索酸及其它二元羧酸創(chuàng)造了條件，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和前景。
【IPC分類】C12R1-865, C12N1-19, C12P7-50, C12N9-00, C12P7-46
【公開號】CN104845948
【申請?zhí)枴緾N201510289056
【發(fā)明人】徐國強(qiáng), 蔣伶活, 吳滿珍, 李鵬越
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月29日