一種鏈球菌噬菌體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鏈球菌噬菌體菌株及其應(yīng)用，特別 是一株寬宿主譜、強(qiáng)裂解性鏈球菌噬菌體及其在防治奶牛乳房炎中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛乳房炎是國(guó)際性的難題，也是成年奶牛最貴的一個(gè)疾病。國(guó)外資料報(bào)道，乳房 炎的發(fā)病率約25-60%，我國(guó)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病率20-70%。在美國(guó)，乳房炎每年造成的經(jīng)濟(jì)損 失達(dá)20億美元，在世界范圍內(nèi)，每年的牛奶生產(chǎn)損失約計(jì)380萬(wàn)噸。奶牛乳房炎不僅對(duì)奶 牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益帶來(lái)巨大損失，而且有些乳房炎病原菌易產(chǎn)生各種有害產(chǎn)物，引起乳 及乳制品污染，對(duì)人類健康帶來(lái)巨大危害。因此，如何防止乳房炎的發(fā)生成為奶牛生產(chǎn)的關(guān) 鍵措施。
[0003] 鏈球菌屬是引起奶牛乳房炎的重要病原菌。引起奶牛乳房炎的鏈球菌屬病 原體主要為蘭氏B群的無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)、C群停乳鏈球菌 (Streptococcus dysgalactiae)以及乳房鏈球菌（Streptococcus uberis)，其中無(wú)乳鏈球 菌和停乳鏈球菌是接觸傳染性病原體，乳房鏈球菌是環(huán)境致病性病原體。由于致病菌的多 樣性，耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，鏈球菌對(duì)常用抗生素的耐藥性愈來(lái)愈強(qiáng)，給防治帶來(lái)很大的困 難。盡管目前抗生素仍然是控制奶牛乳房炎的主要手段，但單靠抗生素不能從根本上解決 奶牛乳房炎問(wèn)題，抗生素治療無(wú)效乳房炎病例越來(lái)越多，所以，尋找新型抗菌、殺菌制劑迫 在眉睫，探索尋求新的奶牛乳房炎的治療方法已成為全世界面臨的重要課題。
[0004] 美國(guó)洛克菲勒大學(xué)Vincent教授率先開(kāi)展了采用肺炎鏈球菌噬菌體及其裂解酶 治療肺炎的研宄，這重新開(kāi)啟了細(xì)菌性疾病的噬菌體療法的研宄。噬菌體是一類感染細(xì)菌 的病毒，在自然界中分布廣泛，與細(xì)菌關(guān)系密切，不會(huì)引起體內(nèi)菌群失調(diào)或?qū)е履繕?biāo)菌群出 現(xiàn)耐藥性。在鏈球菌菌體方面，美國(guó)針對(duì)肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae) 菌 體開(kāi)展了廣泛研宄，并獲得了多株裂解性噬菌體和部分裂解酶。Loeffler等在Science雜 志上發(fā)表的研宄表明：其獲得的S. pneumoniae噬菌體Dp21的溶壁酶Pal可在30s內(nèi)使15 株S. pneumoniae的CFU降低1 X 104/mL，其中3株對(duì)青霉素有強(qiáng)烈抗性。目前，國(guó)內(nèi)尚未有 鏈球菌噬菌體治療奶牛乳房炎的相關(guān)報(bào)道。鑒于噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌溶解破壞的特異性和噬 菌體治療的諸多優(yōu)勢(shì)，因此，噬菌體被認(rèn)為是治療奶牛乳房炎及環(huán)境消毒的一種有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種寬宿主譜、強(qiáng)裂解性鏈球菌噬菌體。
[0006] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供上述噬菌體在防治奶牛乳房炎中的應(yīng)用。
[0007] 為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種鏈球菌噬菌體，該噬菌體屬于肌尾噬菌體科，頭部呈正多面體，頭部直徑約為 78nm，尾長(zhǎng)約為118nm。將該噬菌體命名為vB_StrM_Ll，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏， 保藏單位地址是：武漢市武昌珞珈山，郵編是430072,保藏號(hào)：CCTCC M 2014430,分類命 名：鏈球菌菌體（Streptococcus phage)，保藏日期為2014年9月19日。
[0009] 該噬菌體是2014年3月從南京市西崗奶牛場(chǎng)污水中采集得到的，采集人是包紅 朵，采集者的聯(lián)系電話是025-84391627。
[0010] 其中，該噬菌體對(duì)無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和草綠色鏈球菌具有裂解 作用。
[0011] 上述的鏈球菌噬菌體在制備防治奶牛乳房炎試劑中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0012] 一種藥物組合物，該藥物組合物包含上述鏈球菌噬菌體。
[0013] 其中，將所述的藥物組合物制成噴施劑噴灑在牛舍中，控制鏈球菌的污染，包括將 所述的藥物組合物噴施在奶牛的體表、奶牛養(yǎng)殖器具、奶牛的養(yǎng)殖環(huán)境中。
[0014] 其中，利用所述的藥物組合物對(duì)感染鏈球菌的奶牛進(jìn)行乳頭藥浴，防治奶牛乳房 炎。
[0015] 其中，利用所述的藥物組合物對(duì)感染鏈球菌的奶牛進(jìn)行乳房灌注，防治奶牛乳房 炎。
[0016] 有益效果：
[0017] (1)采用噬菌體特異性裂解奶牛乳房炎鏈球菌可以殺滅具有多重耐藥性的鏈球 菌。
[0018] (2)本發(fā)明提供的鏈球菌噬菌體對(duì)多種引起奶牛乳房炎的鏈球菌致病菌均具有較 強(qiáng)的殺滅活性；
[0019] (3)本發(fā)明提供的噬菌體是一種新型的防治奶牛乳房炎鏈球菌致病菌的產(chǎn)品和手 段；
[0020] (4)經(jīng)小鼠試驗(yàn)，本發(fā)明提供的鏈球菌噬菌體毒副作用小，安全性高；
[0021] (5)鏈球菌噬菌體具有較好的親水性，容易配制成噴灑液、藥浴液或注射液，對(duì)環(huán) 境或乳房?jī)?nèi)的鏈球菌進(jìn)行殺滅。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1噬菌體的噬菌斑形態(tài)。
[0023] 圖2噬菌體的透射電鏡照片。
[0024] 圖3溫度對(duì)噬菌體活性的影響。
[0025] 圖4 pH值對(duì)噬菌體活性的影響。
[0026] 圖5噬菌體在培養(yǎng)基中的殺菌效果。
[0027] 圖6噬菌體在奶牛料槽上的殺菌效果。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0029] 實(shí)施例1 :噬菌體分離及制備。
[0030] 本發(fā)明試驗(yàn)用噬菌體的宿主菌為無(wú)乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12403。
[0031] 本發(fā)明樣品采自江蘇省南京市西崗奶牛場(chǎng)污水，取上清經(jīng)雙層濾紙過(guò)濾， lOOOOrpm離心20min，再用0. 22 y m濾膜過(guò)濾上清。取10ml過(guò)濾上清，加入0. 5ml宿主菌 過(guò)夜培養(yǎng)物，再加入無(wú)菌CaCl2母液至終濃度1. 25mM混勻后，加入20ml THB培養(yǎng)基，室溫作 用30min，再放置于37°C，待培養(yǎng)至6~8h后，取上述培養(yǎng)物以12000rpm，4°C，離心30min， 取上清；再取此上清l〇ml，加入0. 5mL宿主菌過(guò)夜培養(yǎng)物，加入無(wú)菌CaCl2母液至終濃度 1. 25mM混勻后，加入20mLTHB培養(yǎng)基，按上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)離心，獲得富集的上清；按照以 上的試驗(yàn)方法再富集一次，將富集三次的上清用0. 22 y m濾膜過(guò)濾，形成噬菌體原液。
[0032] 將固體THB平板分為2個(gè)區(qū)域：吸取宿主菌液0. 1ml滴于平板正中央，用涂棒將菌 液均勻地涂開(kāi)；待其晾干后，取噬菌體原液10 U