肽/β－1，3－葡聚糖復合體及其制造方法以及含有它的醫(yī)藥組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的肽/β－1，3－葡聚糖復合體含有β－1，3－葡聚糖、和將抗原性肽借助共價鍵與聚核苷酸或其衍生物鍵合了的肽/聚核苷酸綴合物，肽/聚核苷酸綴合物的聚核苷酸或其衍生物借助氫鍵與β－1，3－葡聚糖鍵合，形成具有由聚核苷酸或其衍生物的分子鏈1根和β－1，3－葡聚糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的復合體，或者β－1，3－葡聚糖的側鏈與抗原性肽借助利用炔烴與疊氮衍生物的環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基或乙烯砜基與硫醇基的反應的任意一種反應生成的共價鍵鍵合。
【專利說明】
肽/β-1，3-葡聚糖復合體及其制造方法以及含有它的醫(yī)藥 組合物
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及新型的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體及其制造方法以及含有它的醫(yī)藥組 合物。
【背景技術】
[0002] 基于疫苗的預防感染的基本原理是，利用人為的模擬感染，來誘導獲得性免疫，誘 導對于特定的病原體的抗體產生和細胞性免疫。已知在獲得性免疫中，擔任免疫的"記憶" 的Τ細胞、Β細胞起到核心作用，由DNA的重組帶來的抗體的可變區(qū)域的多樣性使得針對無數(shù) 的抗原的特異性免疫反應成為可能。另一方面，白血球、巨噬細胞、樹狀細胞等吞噬細胞起 到核心作用的自然免疫以往是貪食病原體或異物的非特異性過程，被認為僅起到在獲得性 免疫成立之前的作為"權宜之計"的作用，然而隨著關于自然免疫的分子機理的研究的進 展，顯而易見，在自然免疫中，也要進行自身?非自身的特異性識別，自然免疫對于獲得性 免疫的成立是必需的。更具體而言，最近的研究闡明，存在于樹狀細胞、巨噬細胞、Β細胞等 抗原提呈細胞中的Toll樣受體(TLR)家族與各種病原體反應，誘導細胞因子(cytokine)的 產生，通過促進初始T細胞向Thl細胞的分化、活化殺傷T細胞等，誘導獲得性免疫。
[0003] 由一連串的TLR家族識別的病原體的構成成分復雜多樣，而其中之一是作為TLR9 的配體的、具有CpG序列的DNA(CpG DNA)。CpG序列是在中心部排列胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G) 的以6個堿基為基本的序列，是哺乳類中很少見、多見于微生物的堿基序列。另外，在哺乳類 中，少量存在的CpG序列的大部分受到甲基化。哺乳類中基本上不存在的非甲基化CpG序列 具有強大的免疫賦活活性（例如參照非專利文獻1~3)。由于內吞作用而被引入細胞內的 CpG DNA由存在于吞噬小體樣小胞體中的TLR9識別，強烈地誘導Thl反應。Thl反應抑制Th2 反應占優(yōu)勢的過敏反應，并且具有強的抗腫瘤活性。因此，CpG DNA除了有望預防感染以外， 還有望用作對于過敏性疾病、腫瘤性疾病的佐劑(例如參照非專利文獻4)。
[0004] 但是，在將CpG DNA作為免疫療法的佐劑使用的情況下，如何在避免細胞質或血漿 中的核酸酶所致的分解、和與蛋白質的非特異性結合的同時使CpG DNA到達靶細胞的內部 成為問題。
[0005] 本發(fā)明人等作為新型的基因載體著眼于具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖（以下有 時簡稱為"β- 1，3 -葡聚糖"。），此前，發(fā)現(xiàn)β- 1，3 -葡聚糖與以核酸藥物（反義DNA、CpG DNA)為首的各種核酸形成新的類型的復合體(例如參照專利文獻1、2、非專利文獻5~7)。
[0006] 發(fā)現(xiàn)通過將天然中以3重螺旋存在的β-1，3-葡聚糖溶解于二甲亞砜(DMS0)等非 質子性極性有機溶劑、或0.1Ν以上的堿溶液中而解離為單鏈后，加入單鏈的核酸，將溶劑恢 復為水或中性，可以形成由1個分子的核酸和2個分子的β- 1，3 -葡聚糖構成的3重螺旋復 合體?？梢哉J為，該情況下，3重螺旋復合體中的β-1，3-葡聚糖分子與核酸分子主要利用 疏水性相互作用與氫鍵形成分子間鍵(參照非專利文獻8)。
[0007] 如上所述，通過將核酸與β- 1，3 -葡聚糖復合化，可以在抑制核酸酶所致的核酸 分子的水解、血漿蛋白質與核酸的非特異性結合等核酸分子與生物體內蛋白質的不希望的 相互作用的同時，使核酸到達細胞的內部。利用包含β-1，3-葡聚糖與核酸的復合體、以及 具有抗原性的蛋白質的3元復合體，成功實現(xiàn)CpG DNA向細胞內的傳遞(例如參照專利文獻 3、4、非專利文獻9~11)。
[0008] 現(xiàn)有技術文獻
[0009] 專利文獻、
[0010]專利文獻1:國際公開第01/34207號
[0011] 專利文獻2:國際公開第02/072152號
[0012] 專利文獻3:日本特開2007 -174107號公報
[0013] 專利文獻4:日本特開2010 - 70307號公報 [0014]非專利文獻
[0015] 非專利文獻 1 : Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger,H.Wagner,Adv.Immunol.,73,329-368(1999).
[0016] 非專利文獻 2:CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, M.Krieg,Annu.Rev.Immunol.,20,709-760(2002).
[0017] 非專利文獻3:The discovery of immunostimulatory DNA sequence， S. Yamamoto ? T. Yamamoto ?and T.Tokunaga? Springer Seminars in Immunopathology ? 22 ? 11-19(2000).
[0018] 非專利文獻4:《標準免疫學》第2版、醫(yī)學書院、2002年、333頁
[0019] 非專利文南犬5:Molecular Recognition of Adenine?Cytosine?and Uracil in a Single-Stranded RNA by a Natural Polysaccharide:Schizophyllan.K.Sakurai and S.ShinkaiJ.Am.Chem.Soc.?122,4520-4521(2000).
[0020] 非專利文獻6: Polysaccharide-Polynucleotide Complexes · 2 · Complementary Polynucleotide Mimic Behavior of the Natural Polysaccharide Schizophyllan in the Macromolecular Complex with Single-Stranded RNA and DNA.K.Sakurai?M.Mizu and S.Shinkai，Biomacromolecules，2，641_650(2001)·
[0021] 非專利文獻7 : Dect in_l target ing de 1 ivery of TNF-ctant isense ODNs complexed with0-l，3_glucan protects mice from LPS-induced hepatitis.S.Mochizuki and K.Sakurai ?J.Control.Release?151(2011)155-161.
[0022] 非專利文獻8: Structural Analysis of the Curdlan/Poly(cy tidy lie acid) Complex with Semiempirical Molecular Orbital Calculations.K.Miyoshi ?K.Uezu? K.Sakurai and S.Shinkai，Biomacromolecules，6，1540-1546(2005)·
[0023] 非專利文獻9:A Polysaccharide Carrier for Immunostimulatory CpG DNAs to Enhance Cytokine Secretion，M.Mizu，K.Koumoto，T.Anada，T.Matsumoto，M.Numata， S.Shinkai?T.Nagasaki and K.Sakurai?J.Am.Chem.Soc.?126?8372-8373(2004).
[0024] 非專利文獻 10:Protection of Polynucleotides against Nuclease-mediated Hydrolysis by Complexation with Schizophyllan，M.Mizu，K·Koumoto，T·Kimura， K.Sakurai and S.Shinkai?Biomaterials?25?15?3109-3116(2004).
[0025] 非專利文南犬11: Synthesis and in Vitro Characterization of Antigen- Conjugated Polysaccharide as a CpG DNA Carrier，N.Shimada，K.J·Ishii，Y.Takeda， C.Coban?Y.Torii ?S.Shinkai ?S.Akira and K·Sakurai，Bioconjugate Chem.?17 1136-1140(2006).

【發(fā)明內容】

[0026] 技術問題
[0027] 但是，上述以往的技術具有如下所示的問題。例如，在非專利文獻11記載的具有 β- 1，3 -葡聚糖/抗原性的蛋白質/CpG DNA的3元復合體的制造方法中，利用高碘酸氧化， 在β-1，3 -葡聚糖的側鏈的葡萄糖殘基上生成甲?；眠€原的氨基化反應，使甲?；?與具有抗原性的肽（以下有時簡稱為"抗原性肽"。）的氨基反應，形成β-1，3-葡聚糖與抗 原性肽發(fā)生共價鍵合而得的復合體，然而具有收率極低的問題。鑒于該情況，例如，在專利 文獻4記載的β-1，3 -葡聚糖/抗原性蛋白質(抗原性肽)/CpG DNA的3元復合體的制造方法 中，在使在側鏈中具有甲酰基的β-1，3 -葡聚糖與抗原性肽在堿水溶液中反應的同時進行 中和，或者在堿水溶液中使之反應而進行逐次中和，由此提高了 β- 1，3 -葡聚糖的側鏈上 的甲?；c抗原性肽的氨基的反應性及收率。但是，由于在肽中存在多個氨基，因此反應點 的控制困難。所以，有可能產生由抗原性肽的反應位置造成的免疫原性的差別、由與β- 1， 3 -葡聚糖的反應產物變?yōu)閺碗s的混合物引起的分離提純的困難性等問題。另外，與利用了 借助氫鍵的復合體形成的β- 1，3-葡聚糖與DNA的復合體的形成相比，基于β- 1，3-葡聚 糖與抗原性肽的共價鍵的形成的復合體的形成更煩雜。從這些方面考慮，專利文獻4記載的 β- 1，3 -葡聚糖/抗原性肽/CpG DNA的3元復合體的制造方法在生產率等方面依然存在有 問題。
[0028] 本發(fā)明是鑒于該情況而完成的，其目的在于，提供生產率優(yōu)異、具有高免疫賦活活 性的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體及其制造方法以及含有它的醫(yī)藥組合物。
[0029]用于解決問題的方法
[0030]依照所述目的的本發(fā)明的第一方式提供一種肽/β-1，3-葡聚糖復合體，其特征 在于，含有具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖、和與所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖化 學鍵合了的具有抗原性的肽，由此解決了上述問題。
[0031]本發(fā)明中，"化學鍵"不僅包括屬于分子內鍵的共價鍵、配位鍵，還包括構成分子集 團或原子集團的離子鍵、氫鍵及范德華鍵。
[0032]本發(fā)明的第一方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體中，所述具有β-1，3-葡聚糖骨 架的多糖優(yōu)選為裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然膠的任意一種。
[0033]本發(fā)明的第二方式提供一種肽/β-1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于，含有具有 β-1，3-葡聚糖骨架的多糖、和將具有抗原性的肽借助共價鍵與聚核苷酸或聚核苷酸衍生 物鍵合而得的肽/聚核苷酸綴合物，所述肽/聚核苷酸綴合物的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物 借助氫鍵與所述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖鍵合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷 酸衍生物的分子鏈1根和所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖的分子鏈2根構成的三重螺 旋結構的復合體，由此解決了上述問題。
[0034]本發(fā)明的第二方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體中，所述具有β-1，3-葡聚糖骨 架的多糖優(yōu)選為裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然膠的任意一種。
[0035] 本發(fā)明的第二方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體中，所述聚核苷酸或聚核苷酸衍 生物也可以是聚脫氧腺苷。
[0036] 本發(fā)明的第二方式的肽/β- 1，3-葡聚糖復合體中，所述聚核苷酸或聚核苷酸衍 生物優(yōu)選為DNA或RNA的磷酸二酯鍵的至少一部分由磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍生物。 [0037]本發(fā)明的第二方式的肽/β -1，3-葡聚糖復合體中，也可以磷酸二酯鍵的50%以 上由磷酸硫酯基取代。
[0038] 本發(fā)明的第二方式的肽/β- 1，3-葡聚糖復合體中，構成所述肽/聚核苷酸綴合物 的所述具有抗原性的肽與所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物也可以借助利用炔烴與疊氮衍 生物的環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基與硫醇基的反應、肽C末端的半胱氨酸殘基的硫醇基與硫 醇修飾核酸的硫醇基的反應的任意一種生成的共價鍵鍵合。
[0039] 本發(fā)明的第三方式提供一種肽/β-1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于，含有具有 β-1，3-葡聚糖骨架的多糖、和借助利用炔烴與疊氮衍生物的環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基 或乙烯砜基與硫醇基的反應的任意一種生成的共價鍵與所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的 多糖的主鏈或側鏈上的葡萄糖殘基鍵合的具有抗原性的肽，由此解決了上述問題。
[0040] 本發(fā)明的第三方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體中，所述具有β-1，3-葡聚糖骨 架的多糖優(yōu)選為裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然膠的任意一種。
[0041] 本發(fā)明的第四方式提供在本發(fā)明的第一~第三方式的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體 中具有如下特征的肽/β-1，3-葡聚糖復合體，即，還含有具備具有免疫賦活活性的部分堿 基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物，所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氫鍵與所述具 有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖鍵合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈 1根和所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的復合體，由 此解決了上述問題。
[0042] 本發(fā)明的第四方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體中，所述聚核苷酸或聚核苷酸衍 生物的、形成所述具有三重螺旋結構的復合體的部分優(yōu)選為聚脫氧腺苷。
[0043] 本發(fā)明的第四方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體中，所述聚核苷酸或聚核苷酸衍 生物的、形成所述具有三重螺旋結構的復合體的部分優(yōu)選為DNA或RNA的磷酸二酯鍵的至少 一部分由磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍生物。
[0044] 本發(fā)明的第四方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體中，在所述聚核苷酸或聚核苷酸 衍生物的、形成所述具有三重螺旋結構的復合體的部分中，也可以DNA或RNA的磷酸二酯鍵 的50 %以上由磷酸硫酯基取代。
[0045] 本發(fā)明的第五方式提供一種肽/β-1，3-葡聚糖復合體的制造方法，是制造如下 的肽/β-1，3-葡聚糖復合體的方法，即，含有具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖、和將具有 抗原性的肽借助利用炔烴與疊氮衍生物的環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基與硫醇基的反應、肽C 末端的半胱氨酸殘基的硫醇基與硫醇修飾核酸的硫醇基的反應的任意一種生成的共價鍵 與聚核苷酸或聚核苷酸衍生物鍵合而得的肽/聚核苷酸綴合物，所述肽/聚核苷酸綴合物的 聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氫鍵與所述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖鍵合，形成由 所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈1根和所述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖的分 子鏈2根構成的三重螺旋結構的復合體，所述方法的特征在于，在螯合劑的存在下進行所述 肽/聚核苷酸綴合物的利用液相色譜的分離，由此解決了上述問題。
[0046] 本發(fā)明的第六方式提供一種醫(yī)藥組合物，其含有具備具有免疫賦活活性的部分堿 基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物、和本發(fā)明的第一~第三方式的肽/β-1，3 -葡聚糖 復合體，由此解決了上述問題。
[0047] 本發(fā)明的第六方式的醫(yī)藥組合物中，所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物也可以借助 氫鍵與具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖鍵合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物 的分子鏈1根和所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的 聚核苷酸/β- 1，3-葡聚糖復合體。
[0048] 本發(fā)明的第六方式的醫(yī)藥組合物中，構成所述聚核苷酸/β -1，3 -葡聚糖復合體 的所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖優(yōu)選為裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然膠 的任意一種。
[0049] 本發(fā)明的第七方式提供一種醫(yī)藥組合物，其含有本發(fā)明的第四方式的肽/β- 1， 3 -葡聚糖復合體，由此解決了上述問題。
[0050] 發(fā)明效果
[0051] 根據(jù)本發(fā)明，可以獲得如下所示的有利的效果。
[0052] (1)由于可以根據(jù)β -1，3-葡聚糖及抗原性肽的種類、分子量、組合等，從β -1， 3-葡聚糖與抗原性肽的共價鍵、β-1，3-葡聚糖與肽/聚核苷酸綴合物的聚核苷酸或聚核 苷酸衍生物之間的氫鍵中選擇β-1，3-葡聚糖與抗原性肽的鍵合樣式，因此可以針對廣泛 的β- 1，3 -葡聚糖與抗原性肽的組合，獲得肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體。
[0053] (2)作為生成β-1，3-葡聚糖與抗原性肽的共價鍵的反應，使用炔烴與疊氮衍生 物的環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基與硫醇基的反應(邁克爾加成反應）的任意一種，由此在含 有水的極性溶劑中也可以迅速并且高效率地進行反應。所以，可以在短時間內高收率地獲 得肽/β-1，3 -葡聚糖復合體，還可以減輕分離提純所需的工夫。所以，本發(fā)明的肽/β- 1， 3-葡聚糖復合體的生產率優(yōu)異，可以低成本地制造。
[0054] (3)通過使用本發(fā)明的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體，與單獨使用抗原性肽的情況相 比，可以更加有效地進行對抗原性肽而言為特異性的免疫應答的誘導。
[0055] (4)通過將本發(fā)明的肽/β- 1，3-葡聚糖復合體與具備具有免疫賦活活性的部分 堿基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物組合使用，或使用還含有具備具有免疫賦活活性的 部分堿基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物、且聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氫鍵與 β-1，3 -葡聚糖鍵合而形成具有由聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈1根和β-1，3-葡 聚糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的復合體的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體，可以更加有 效地進行免疫應答的誘導。
[0056] (5)含有本發(fā)明的肽/β -1，3 -葡聚糖復合體的醫(yī)藥組合物與單獨使用抗原性肽 的情況相比，對于廣泛的抗原性肽可以更加有效地誘導特異性的免疫應答。因此，有望作為 疫苗或免疫賦活劑應用。
【附圖說明】
[0057]圖1是實施例1是dA40(S)(炔烴)和0VA(N3)的化學結構。
[0058]圖2是表示實施例1的抗原性肽/聚核苷酸綴合物制作的結果的HPLC色譜圖。
[0059]圖3是表示實施例2的抗原性肽一 dA40(S)與SPG的復合化的結果的凝膠電泳照片。
[0060] 圖4是表示對實施例3的通過將各樣品中進行了免疫誘導的小鼠的脾臟細胞用抗 原性肽刺激而產生的抗原性肽特異性IFN - γ的產生量進行定量而得的結果的曲線圖。
[0061] 圖5是表示實施例4的將各樣品中進行了免疫誘導的小鼠的脾臟細胞用抗原性肽 刺激并繁殖了的抗原性肽特異性細胞傷害性Τ細胞的比例的曲線圖。
[0062]圖6是表示實施例5的肽/CpG/SPG三元復合體的制作的結果的凝膠電泳照片。
[0063]圖7是表示對實施例6的通過將各樣品中進行了免疫誘導的小鼠的脾臟細胞用抗 原性肽刺激而產生的抗原性肽特異性IFN - γ的產生量進行定量而得的結果的曲線圖。 [0064]圖8是表示實施例7的將各樣品中進行了免疫誘導的小鼠的脾臟細胞用抗原性肽 刺激并繁殖了的抗原性肽特異性細胞傷害性Τ細胞的比例的曲線圖。
[0065] 圖9是表示對實施例8的通過將各樣品中進行了免疫誘導的小鼠的脾臟細胞用抗 原性肽刺激而產生的抗原性肽特異性IFN - γ的產生量進行定量而得的結果的曲線圖。
【具體實施方式】
[0066] 以下，對將本發(fā)明具體化了的實施方式進行說明，用以理解本發(fā)明。
[0067] 本發(fā)明的第一實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體含有具有β-1，3-葡聚糖骨 架的多糖(β-1，3 -葡聚糖）、和將具有抗原性的肽(抗原性肽)借助共價鍵與聚核苷酸或聚 核苷酸衍生物鍵合而得的肽/聚核苷酸綴合物。肽/聚核苷酸綴合物的聚核苷酸或聚核苷酸 衍生物借助氫鍵與β-1，3-葡聚糖鍵合，形成具有由聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈 1根和所述β-1，3-葡聚糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的復合體。
[0068] (1)β-1，3 - 葡聚糖
[0069] β-1，3-葡聚糖只要是可以形成具有由聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈1根 和β-1，3-葡聚糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的復合體的葡聚糖，就可以沒有特別 限制地使用任意的種類、分子量的葡聚糖。已知具有β- 1，3-葡聚糖骨架的多糖具有與 poly(C)等核酸近似的螺旋參數(shù)(例如參照高橋、小畠、鈴木、Prog.Polym.Phys . Jpn. 27卷、 767頁、及〈〈Conformation of Carbohydrates))nSharwood academic publisher、1998年）， 具有能夠與核酸堿基產生氫鍵的羥基，因此與核酸發(fā)生相互作用，形成具有三重螺旋結構 的穩(wěn)定的復合體。作為β-1，3-葡聚糖的具體例，可以舉出裂裥多糖、可得然膠、香菇多糖、 茯苓聚糖(pachyman)、灰樹花多糖、硬葡聚糖等。它們是主鏈利用β-鍵(β - D-鍵)鍵合的 葡聚糖，是側鏈的頻度不同的天然的多糖。這些β-1，3-葡聚糖可以不進行化學修飾等處 理地直接使用，然而也可以使用通常的高碘酸氧化法將其側鏈適當?shù)乩_間隔，由此來控 制其溶解性。
[0070] β-1，3 -葡聚糖的分子量可以根據(jù)肽/核苷酸綴合物中所含的聚核苷酸或聚核苷 酸衍生物的堿基序列及堿基長度等適當?shù)卣{節(jié)。但是，若分子量小，則難以體現(xiàn)出所謂的集 簇效應(高分子系的協(xié)同現(xiàn)象），因此不優(yōu)選。通常作為能夠與核酸形成復合體的β-1，3 - 葡聚糖的重均分子量(每1根分子鏈），隨著核酸堿基的種類、高次結構而不同，然而優(yōu)選為 2000以上，更優(yōu)選為4000以上，進一步優(yōu)選為6000以上。另外，與聚核苷酸上的核酸堿基形 成氫鍵的羥基的個數(shù)通常為5個以上，優(yōu)選為8個以上，進一步優(yōu)選為10個以上。
[0071] 而且，β-1，3-葡聚糖的重均分子量可以使用光散射法、沉降速度法(超離心法） 等任意的公知的方法來確定。
[0072] β-1，3-葡聚糖一般由菌類、真性細菌產生，因此可以通過在培養(yǎng)這些微生物后， 將菌體均質化，從細胞溶出部分或不溶性殘渣等雜質中利用超離心法等方法分離而得到。 一般而言，像這樣得到的β-1，3-葡聚糖以高分子量(重均分子量為數(shù)十萬左右)取得三重 螺旋結構。根據(jù)需要也可以進行低分子化而使用。低分子化是根據(jù)β-1，3-葡聚糖的種類、 所期望的分子量，從酶分解、酸水解等中適當?shù)剡x擇合適的方法及條件而進行。例如，在裂 裥多糖的情況下，可以利用借助80%DMS0 -硫酸的水解等，獲得具有各種分子量的單鏈裂 裥多糖。
[0073] (2)肽/聚核苷酸綴合物
[0074] 肽/聚核苷酸綴合物是將抗原性肽和聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助共價鍵鍵合 而得的復合體。與抗原性肽鍵合的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物如上所述，在與β- 1，3-葡 聚糖之間形成具有三重螺旋結構的復合體，由此起到使抗原性肽與β-1，3 -葡聚糖鍵合的 作用。
[0075] 作為"具有抗原性的肽"，只要是具有抗原性的肽，即，只要是在生物體的免疫系統(tǒng) 中被識別為異物、引發(fā)特異性抗體產生的（誘導免疫應答的）肽，則可以沒有特別限制地使 用具有任意的氨基酸序列及氨基酸殘基數(shù)的肽。作為本實施方式的肽/β- 1，3-葡聚糖復 合體的制造中所用的抗原性肽，可以舉出成為食物過敏等過敏的原因的蛋白質、細菌、病毒 等病原體、以腫瘤細胞等為起源的蛋白質當中的、具有可以作為抗原表位發(fā)揮作用的部分 氨基酸序列的肽。構成抗原性肽的氨基酸殘基數(shù)只要是可以作為抗原表位發(fā)揮作用，就沒 有特別限制，然而在大多數(shù)情況下，為5~30的范圍內，大部分處于8~17左右的范圍內。
[0076] 抗原性肽可以使用成為起源的蛋白質的酶分解、肽合成等任意公知的方法得到。 另外，抗原性肽的氨基酸序列可以使用利用了多肽陣列的抗原表位分析等任意的公知的方 法來確定。
[0077] 與抗原性肽鍵合的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物如上所述，只要是可以在與β- 1， 3-葡聚糖之間形成具有三重螺旋結構的復合體，就可以沒有特別限制地使用具有任意的 堿基序列及堿基數(shù)的聚核苷酸或其衍生物。作為聚核苷酸的具體例，可以舉出與β- 1，3 - 葡聚糖結合能高的聚多核糖腺苷酸(polyA)、聚多聚胞苷酸(polyC)、聚脫氧腺苷酸(poly (dA))、聚脫氧胸苷酸(poly(dT))。聚核苷酸的堿基數(shù)如上所述，只要是可以在與β-1，3 - 葡聚糖之間形成具有三重螺旋結構的復合體，就沒有特別限制，然而為了提高復合體形成 能力，聚核苷酸優(yōu)選與具有β-1，3 -葡聚糖結合能高的聚多核糖腺苷酸(polyA)、聚多聚胞 苷酸(polyC)、聚脫氧腺苷酸(poly (dA))、聚脫氧胸苷酸(poly (dT))的任意一種的重復序 列。構成優(yōu)選的重復序列的堿基及核苷酸的種類以及堿基數(shù)可以根據(jù)核苷酸部分的長度、 所用的β-1，3-葡聚糖的種類及分子量等適當?shù)卮_定。例如，在作為β-1，3-葡聚糖使用 裂裥多糖的情況下，聚脫氧核苷酸部分優(yōu)選作為重復序列具有P〇ly(dA)序列。對于重復序 列的長度，若堿基數(shù)少，則難以利用與β-1，3-葡聚糖的氫鍵形成三重螺旋結構，因此堿基 數(shù)需要為10以上，優(yōu)選為20~80,更優(yōu)選為30~80。
[0078] 聚核苷酸在生物體內容易受到由核酸酶造成的分解，因此為了提高在生物體內的 穩(wěn)定性，也可以取代聚核苷酸而使用聚核苷酸衍生物。作為聚核苷酸衍生物的例子，可以舉 出核糖核苷酸的2'位的羥基的全部或一部分被氟或甲氧基取代的衍生物、聚核糖核苷酸 (RNA)或聚脫氧核糖核苷酸(DNA)的磷酸二酯基的全部或一部分被磷酸硫酯基取代的衍生 物等。在聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸的磷酸二酯基的一部分被磷酸硫酯基取代的情 況下，優(yōu)選磷酸二酯鍵的50%以上被磷酸硫酯基取代。被磷酸硫酯基取代的磷酸二酯基的 位置沒有特別限制，既可以是連續(xù)的多個磷酸二酯基被取代，也可以是磷酸硫酯基不彼此 相鄰地被取代。
[0079] 聚核苷酸或聚核苷酸衍生物可以與抗原性肽的N末端、C末端、或側鏈的任意一個 鍵合。兩者可以利用適當?shù)姆磻怨倌軋F之間的反應直接鍵合，也可以借助適當?shù)拈g臂鍵 合。作為反應性官能團，可以直接使用存在于抗原性肽及聚核苷酸或聚核苷酸衍生物中的 官能團，或者使用將其利用化學修飾加以活化了的官能團，也可以導入適當?shù)姆磻怨倌?團。另外，聚核苷酸或聚核苷酸衍生物可以是5'末端側與抗原性肽鍵合，也可以是3'末端側 鍵合。
[0080] 優(yōu)選的肽/聚核苷酸綴合物的一例如下述的式(A)中所示，具有在肽的C末端側鍵 合有硫代磷酸酯化聚脫氧腺苷酸(P〇lyA的磷酸二酯基被磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍 生物)的5'末端側的結構。
[0081] [抗原性肽]-X-(dA(S))x ⑷
[0082] 而且，式(A)中，dA(S)表示硫代磷酸酯化脫氧腺苷酸，X例如為20以上80以下的整 數(shù)。X表示間臂或利用反應性官能團之間的反應形成的官能團。作為間臂的一例，可以舉出 烷基、聚乙二醇(PEG)等。作為反應性官能團的組合的例子，例如可以舉出生物體分子向生 物芯片表面的固定中所用的反應性官能團的組合，更具體而言，可以舉出下述所示的組合。 [0083] (a)炔烴與疊氮化合物
[0084] 炔烴與疊氮化合物(疊氮化物)利用如下所示的環(huán)加成反應(Husigen反應），形成 1，2,3-三唑環(huán)。兩者是可以導入包含生物體分子的大多數(shù)有機化合物的穩(wěn)定的官能團，在 含有水的溶劑中也會迅速并且大致定量地反應，基本上不伴隨副反應，不生成多余的廢棄 物，因此被作為所謂的"點擊化學"的核心的反應在生物化學的領域廣泛地使用。炔烴衍生 物及疊氮基可以使用任意的公知的方法，導入抗原性肽或聚核苷酸或者聚核苷酸衍生物 中。作為炔烴衍生物，炔丙醇、炔丙胺等具有反應性官能團的衍生物可以容易地獲取，可以 使它們與羧基、羥基等反應性官能團直接反應，或者與羰基二咪唑等一起反應，借助生成的 酰胺鍵、酯鍵、氨基甲酸酯鍵等將炔烴衍生物導入。對于疊氮基，也可以使用任意的公知的 方法，導入抗原性肽或聚核苷酸或者聚核苷酸衍生物中。而且，Husigen反應是在銅催化劑 的存在下進行，然而由于在抗原性肽及磷酸二酯基被磷酸硫酯基等含硫官能團取代了的聚 核苷酸衍生物中，存在有與銅離子配位的硫原子，因此銅的催化活性有可能降低。為了提高 反應率，優(yōu)選添加過剩量的銅。
[0085] [化1]
[0087] (b)馬來酰亞胺或乙烯砜與硫醇基
[0088]具有與吸電子性的羰基或砜基相鄰的雙鍵的馬來酰亞胺或乙烯砜在中性附近的 pH下，如下所示，利用與硫醇基的加成反應(邁克爾加成反應），生成穩(wěn)定的硫醚衍生物。由 于在市場上有具有適當?shù)拈g臂的馬來酰亞胺及乙烯砜衍生物銷售，因此很容易向抗原性肽 或聚核苷酸或者聚核苷酸衍生物中導入這些官能團。在向抗原性肽中導入硫醇基的情況 下，在含有半胱氨酸的抗原性肽的情況下，可以利用半胱氨酸殘基側鏈的硫醇基。但是，由 于半胱氨酸是存在比低的氨基酸，因此使用向抗原性肽的C末端側導入了半胱氨酸的物質。 作為含有硫醇基的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物，使用將這些5'末端的羥基轉換為硫醇基的 硫醇化聚核苷酸。
[0089][化2]
[0091 ] (c)半胱氨酸側鏈的硫醇基與硫醇化聚核苷酸的硫醇基
[0092]如上所述，使向C末端側導入了半胱氨酸的抗原性肽的半胱氨酸殘基側鏈的硫醇 基與硫醇化聚核苷酸的硫醇基反應，形成二硫基。由于二硫鍵在還原劑的存在下被切斷，因 此與上面兩者相比，在穩(wěn)定性的方面差。
[0093] (3)肽/β-1，3 -葡聚糖復合體的制造
[0094]裂裥多糖等的β-1，3 -葡聚糖通常在水中呈三重螺旋結構。所以，為了與聚核苷 酸或聚核苷酸衍生物形成復合體，溶解于DMS0之類的溶劑中來解開由分子間氫鍵及疏水性 相互作用造成的締合狀態(tài)，變?yōu)閱捂湣．斚蚱渲兄饾u添加含有聚核苷酸的水溶液(或醇等極 性溶劑的溶液)時，隨著溶劑的極性增大，聚核苷酸與β- 1，3 -葡聚糖就會因疏水性相互作 用而締合，在引入聚核苷酸的分子鏈的同時在分子內及分子間形成聚核苷酸與多糖的締合 體。其結果是，形成具有由1個分子的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物與2個分子的β-1，3-葡 聚糖分子構成的三重螺旋結構的復合體。復合體的形成例如可以通過測定CD(圓偏光二色 性)光譜，根據(jù)對構象變化的調查來確認。
[0095] 本發(fā)明的第二實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體含有具有β-1，3-葡聚糖骨 架的多糖、和借助利用炔烴與疊氮衍生物的環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基或乙烯砜基與硫醇 基的反應的任意一種反應生成的共價鍵與所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖的主鏈或 側鏈上的葡萄糖殘基鍵合的具有抗原性的肽。
[0096] 對于本實施方式的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體的制造中所用的抗原性肽、β- 1， 3-葡聚糖，由于與本發(fā)明的第一實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體的制造中所用的物 質相同，因此省略詳細的說明。β- 1，3 -葡聚糖與抗原性肽借助利用炔烴與疊氮衍生物的 環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基或乙烯砜基與硫醇基的反應的任意一種反應生成的共價鍵鍵 合?？乖噪呐cβ-1，3-葡聚糖分子的主鏈及側鏈的葡萄糖殘基的哪一個鍵合都可以，然 而若考慮空間位阻，則優(yōu)選鍵合于側鏈的葡萄糖殘基上。另外，抗原性肽以Ν末端側及C末端 側的哪一個鍵合都可以，或者也可以以側鏈鍵合，然而若考慮與抗原提呈細胞的接觸時的 空間位阻，則優(yōu)選以Ν末端側或C末端側與β-1，3-葡聚糖鍵合。對于炔烴衍生物及疊氮基 向β-1，3 -葡聚糖及抗原性肽中的導入，與本發(fā)明的第一實施方式的肽/β-1，3 -葡聚糖 復合體的制造中的肽/核苷酸綴合物的情況相同，可以使用任意的公知的方法進行。
[0097]本發(fā)明的第三實施方式的肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體是在上述的本發(fā)明的第一或 第二實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體中，還含有具備具有免疫賦活活性的部分堿基 序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物，聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氫鍵與β-1，3-葡聚 糖鍵合，形成具有由聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈1根和β-1，3-葡聚糖的分子鏈2 根構成的三重螺旋結構的復合體(含有抗原性肽、β-1，3 -葡聚糖、聚核苷酸或聚核苷酸衍 生物的三元復合體）。
[0098] 對于本實施方式的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體的制造中所用的抗原性肽、β- 1， 3 -葡聚糖、聚核苷酸或聚核苷酸衍生物中的借助氫鍵與β -1，3-葡聚糖鍵合的部分，由于 與本發(fā)明的第一、第二實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體的制造中所用的物質相同，因 此省略詳細的說明。
[0099] 作為聚核苷酸或聚核苷酸衍生物中的、具有免疫賦活活性的部分堿基序列的具體 例，可以舉出通過借助TLR9的識別進行自然免疫和獲得性免疫的"交聯(lián)"而活化免疫的、來 自于細菌或病毒的非甲基化CpG DNA、通過借助TLR3的識別進行自然免疫和獲得性免疫的 "交聯(lián)"而活化免疫的來自于病毒的雙鏈RNA、借助RIG - I樣受體(RLR)的識別來活化免疫的 病毒基因組RNA或人工RNA等。
[0100]上述的具備具有免疫賦活活性的部分堿基序列的RNA或DNA、與具有借助氫鍵與 β - 1，3 -葡聚糖鍵合的部分堿基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的雜合可以使用任意 的公知的方法獲取或合成。而且，在聚核苷酸或聚核苷酸衍生物是RNA的5'末端側與DNA的 3'末端側鍵合的嵌合核酸的情況下，RNA與DNA之間的磷酸二酯鍵特別容易受到分解，因此 優(yōu)選進行將與DNA鍵合了的RNA的5'末端側核苷酸中的2'位的羥基用甲氧基或氟基取代，并 且/或者將與DNA鍵合了的最初的核糖核苷酸的3 '位與同它相鄰的RNA的5 '位之間的磷酸二 酯基用磷酸硫酯基取代等衍生物化，提高對于水解的耐受性。
[0101] 本實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體可以利用下述的任意一種方法制造。
[0102] (1)使用與本發(fā)明的第一實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體的制造方法相同 的方法，使上述的β- 1，3 -葡聚糖、肽/核苷酸綴合物與聚核苷酸或聚核苷酸衍生物復合 化。
[0103] (2)使用與本發(fā)明的第一實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體的制造方法相同 的方法，使本發(fā)明的第二實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體與聚核苷酸或聚核苷酸衍 生物復合化。
[0104] 本發(fā)明的第四實施方式的醫(yī)藥組合物（以下簡稱為"醫(yī)藥組合物"。）含有具備具有 免疫賦活活性的部分堿基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物;通過借助氫鍵與β- 1，3-葡 聚糖骨架鍵合而形成、且具有由聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈1根和所述具有β- 1， 3 -葡聚糖骨架的多糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的聚核苷酸/β- 1，3 -葡聚糖復合 體;和本發(fā)明的第一或第二實施方式的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體、或本發(fā)明的第三實施方 式的肽/β- 1，3-葡聚糖復合體。
[0105] 聚核苷酸/β-1，3-葡聚糖復合體除了取代肽/核苷酸綴合物而使用核苷酸或聚 核苷酸衍生物以外，使用與本發(fā)明的第一實施方式的肽/β-1，3-葡聚糖復合體相同的方 法制造。
[0106] 在醫(yī)藥組合物的制造時，除了作為有效成分的肽/β-1，3 -葡聚糖復合體及聚核 苷酸/β-1，3-葡聚糖復合體以外，可以還使用任意的公知的成分(醫(yī)藥用途所容許的任意 的載體、賦形劑及添加物)及制劑方法。例如，醫(yī)藥組合物可以采取片劑、栓劑、膠囊劑、糖漿 劑、納米凝膠等微膠囊劑、滅菌液劑、懸浮液劑等注射劑、氣霧劑、噴劑等形態(tài)。
[0107] 醫(yī)藥組合物可以對人或恒溫動物(小鼠、大鼠、兔子、羊、豬、牛、馬、雞、貓、狗、猴子 等)利用口服及非口服路徑的任意一種施用。作為非口服施用路徑，可以舉出皮下、皮內及 肌肉注射、腹腔內給藥、點滴、向鼻粘膜或咽部的噴霧等。
[0108] 作為活性成分的肽/β- 1，3-葡聚糖復合體及聚核苷酸/β- 1，3 -葡聚糖復合體 的用量根據(jù)活性、成為治療對象的疾病、成為給藥對象的動物的種類、體重、性別、年齡、疾 病的嚴重度、給藥方法等而不同。若以體重60kg的成人為例，在口服給藥的情況下，每1天的 用量通常為約0.1~約l〇〇mg，優(yōu)選為約1.0~約50mg，更優(yōu)選為約1.0~約20mg，在非口服給 藥的情況下，每1天的用量通常為約0.01~約30mg，優(yōu)選為約0.1~約20mg，更優(yōu)選為約0.1 ~約10mg。在對其他動物給藥的情況下，將上述用量換算為每單位體重的用量后，使用乘以 成為給藥對象的動物的體重而得的用量。
[0109] 醫(yī)藥組合物可以作為用于通過活化免疫而治療及預防由細菌、病毒等病原體的感 染引起的感染癥、癌癥等腫瘤的疫苗等使用。
[0110]實施例
[0111] 下面，對為了確認本發(fā)明的作用效果而實行的實施例進行說明。
[0112] 實施例1:抗原性肽/聚核苷酸綴合物的制作
[0113] 本實施例中，對向具有脫氧線嘌呤40倍體中的磷酸二酯鍵全都被硫代磷酸酯鍵取 代了的結構的聚核苷酸衍生物（以下稱作"dA40(S)"。）的5'側導入了炔烴的聚核苷酸衍生 物（以下稱作"dA40 (S) (alkyne)"。）（從株式會社GENED I SIGN公司購入)與來自于卵清蛋白 (0VA)的抗原性肽(氨基酸序列：SIINFEKL(序列編號1))的向C末端導入了疊氮基的抗原性 肽（以下稱作"〇VA(N3)"）（從株式會社GENEDISIGN公司購入）的抗原性肽/聚核苷酸綴合物 (以下稱作"0VA肽一dA40(S)"）的制作進行了研究。將化學結構分別表示于圖1中。
[0114] 如下所示地將0VA(N3)(最終濃度：10μΜ~800μΜ、溶劑：水+DMS0)、dA40(S) (alkyne)(最終濃度:1 ΟμΜ、溶劑:水）、硫酸銅（II)五水合物(最終濃度：1.5mM、溶劑:水）、抗 壞血酸鈉(最終濃度:3.0mM、溶劑:水）、（三（1 -芐基一1H-1，2,3 -三唑一4 -基）甲基)胺 (最終濃度:〇.6mM、溶劑:DMS0)混合，在室溫下進行了 1小時的使用了銅催化劑的點擊化學。 反應后，用作為螯合劑的PH7.4的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(最終濃度:20mM以上)將樣品溶 液稀釋后，進行了HPLC測定。因 dA40(S)與HPLC色譜柱的相互作用強大而難以被溶出，因此 通過添加 Η)ΤΑ來減弱該相互作用，使之容易被溶出。
[0115] 在HPLC測定中，作為色譜柱使用Inertsil 0DS - 3(GL Science公司），作為洗脫液 使用0.1M三乙胺一乙酸(TEAA)緩沖液(pH7.0)和乙腈，作為檢測器使用二極管陣列，追蹤了 260nm下的dA40(S) (alkyne)的UV吸收變化。將結果表示于圖2中。確認因加入肽，dA40(S) (alkyne)的峰從17分鐘附近依賴于肽量地迀移到20分鐘附近。在使用了反相色譜柱的測定 中，溶出時間推遲，暗示了分子變得更加疏水。由該結果可知，生成了0VA肽一dA40 (S)。 [0116]實施例2:抗原性肽/聚核苷酸綴合物與具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖的復合化 [0117]本實施例中，作為具有β- 1，3 -葡聚糖骨架的多糖使用的裂裥多糖（SPG)使用日 本特開2010 -174107號公報的實施例中記載的方法獲得。將其以給定的方法提純。利用GPC 算出分子量，其結果是，在單鏈狀態(tài)下為15萬，在3鏈時為45萬。對該SPG與實施例1中制備的 OVA肽一 dA40 (S)的復合化進行了研究。
[0118] 如上所述，SPG等β- 1，3-葡聚糖在堿水溶液中解離為單鏈，而通過添加磷酸緩沖 液，將含有β- 1，3-葡聚糖的溶液中和時，3個分子的β- 1，3 -葡聚糖就會借助氫鍵締合， 三重螺旋結構得到再生。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，此時，若在混合物中存在dA40(S)等聚核苷酸或聚 核苷酸衍生物，1個分子的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物與2個分子的β- 1，3 -葡聚糖就會借 助氫鍵及疏水性相互作用締合，生成具有三重螺旋結構的復合體。本實施例中，對在作為聚 核苷酸或聚核苷酸衍生物的一例的dA40 (S)上鍵合有抗原性肽的抗原性肽一 DA40 (S)與SPG 的組合中，是否也同樣地生成具有三重螺旋結構的復合體進行了驗證。
[0119] 在0.25N NaOH溶液中溶解SPG(15mg/mL)，為了使之完全解離為單鏈，使用了放置2 天以上的溶液。將0VA肽一dA40 (S)的10 %二甲亞砜(DMS0)水溶液（以含有10體積％的01^0 的水作為溶劑的溶液。以下相同。）、與磷酸緩沖液(330mM NaH2P〇4、pH4.5)混合后，添加上述 的SPG溶液并攪拌。而且，以使SPG與0VA肽一 dA40 (S)的混合比以摩爾比計為3:1、SPG溶液與 磷酸緩沖液的體積比為1:1的方式，調整了各溶液的濃度。在4°C靜置一晚后，進行了攪拌后 的反應混合物的丙烯酰胺凝膠電泳。為了比較，對抗原性肽一 dA40(S)也進行了丙烯酰胺電 泳。
[0120] 電泳后，將丙烯酰胺凝膠用SYBR Gold染色，拍攝熒光圖像，將所得的結果表示于 圖3中。攪拌后的反應混合物的泳道（泳道2:complex(peptide/SPG))中，確認泳道1 (pep t i de - dA40 S)中觀測的0VA肽一 dA40 (S)的條帶消失。由該結果可知，0VA肽一 dA40 (S) 與SPG復合化，生成更高分子量的復合體(OVA肽一dA40 (S) /SPG復合體）。
[0121] 實施例3:抗原性肽與SPG的復合化對小鼠脾細胞的抗原性肽所致的抗原特異性免 疫應答造成的影響的評價
[0122] (1)具有來自于卵清蛋白（0VA)的氨基酸序列(序列編號1)的抗原性肽(0VA肽）（5μ g)、（2)0VA肽(5yg)及CpG DNA(堿基序列:ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(序列編號2)) (30yg)、（3) OVA肽一dA40 (S)/SPG復合體(參照實施例1、5yg)、（4)OVA肽一dA40(S)/SPG復合體(實施例1 中制備、5yg)及CpG DNA(30yg)、（ 5)OVA肽一dA40(S)/SPG復合體（5yg)及弗氏不完全佐劑 (IFA) (30yg)的任意一個施用到小鼠（C57BL/6小鼠、雄性、7周齡)皮內（1次）。從施用起1周 后，從小鼠采集脾細胞后，播種到96孔板中（1.0 X 106細胞/孔），用0VA肽進行刺激（10yg/ mL)，對是否誘導出抗原特異性干擾素一 γ (IFN- γ )進行了研究。
[0123] 在利用0VA肽對脾細胞的刺激24小時后，使用酶聯(lián)免疫測定(ELISA)，對培養(yǎng)基中 的IFN-γ量進行了定量。將結果表示于圖4中。對僅施用了0VA肽的情況、同時施用了0VA肽 及CpG DNA的情況、僅施用了0VA肽一dA40(S)/SPG復合體的情況，沒有看到對0VA肽而言特 異性的干擾素應答。在將0VA肽一 dA40(S)/SPG復合體與作為市售的佐劑的弗氏不完全佐劑 (IFA)同時施用的情況下，其應答也非常小。但是，在將0VA肽一dA40⑶/SPG復合體與CpG DNA同時施用的情況下，確認可以誘發(fā)明顯的免疫應答（IFN - γ的產生量的增大）。在僅施 用了 0VA肽的情況下，被從體內快速地排除掉，然而通過將0VA肽一 dA40 (S)與SPG復合化，可 以促進向抗原提呈細胞的引入，對此可以認為是因為，由于向其中加入CpG DNA對TLR9的刺 激，從而使得抗原特異性T細胞的比例增加。
[0124] 實施例4:抗原性肽與SPG的復合化對抗原性肽特異性細胞傷害性T細胞的誘導能 力造成的影響的評價
[0125] 實施例3中，將從皮內施用了（ 1)OVA肽、（2)OVA肽及CpG DNA、（ 3)OVA肽一dA40(S)/ SPG復合體、（4)0VA肽一dA40(S)/SPG復合體及CpG DNA的任意一個的小鼠采集、并用OVA 肽一 dA40(S)/SPG復合體刺激了的小鼠脾細胞培養(yǎng)6天，進行抗體染色后，使用流式細胞儀， 評價了對0VA肽而言特異性的細胞傷害性(CD8陽性)T細胞的比例。
[0126] 將對脾細胞中的0VA肽而言特異性的CD8陽性T細胞的比例表示于圖5中?？梢源_ 認，對于僅施用了0^^肽的情況化6口1：丨(16)、同時施用了0\^肽及0。6 0財?shù)那闆r(。6。1：丨(16 + CpG)、僅施用了0VA肽一dA40(S)/SPG復合體的情況(peptide/SPG)的任意一個情況，對0VA 肽而言特異性的CD8陽性T細胞的比例都很少，然而在將OVA肽一dA40(S)/SPG復合體與CpG DNA同時施用的情況下(peptide/SPG+CpG)，對OVA肽而言特異性的CD8陽性T細胞的比例明 顯增加。
[0127] 實施例5:抗原性肽、具備具有免疫賦活活性的部分堿基序列的聚核苷酸衍生物及 具有β- 1，3 -葡聚糖骨架的多糖的復合化
[0128] 對SPG與0VA肽一dA40(S)、CpG DNA-dA40(S)的同時復合化進行了研究。
[0129] 在0.25N NaOH溶液中溶解SPG(15mg/mL)，為了使之完全地解離為單鏈，使用了放 置2天以上的溶液。將CpG DNA-dA40 (S)(具有在CpG DNA的3 ' 一末端側鍵合了 dA40 (S)的結 構的聚核苷酸衍生物）的水溶液、0VA肽一dA40 (S)的10 % DMS0水溶液、和磷酸緩沖液(330mM NaH2P〇4，pH4 · 5)混合，添加上述的SPG溶液，并進行了攪拌。而且，SPG與OVA肽一 dA40⑶的混 合比、SPG與CpG DNA-dA40(S)的混合比都是以摩爾比計為3:1，以使SPG溶液與磷酸緩沖液 的體積比為1:1的方式，調整了各溶液的濃度。
[0130] 在電泳后，將丙烯酰胺凝膠用SYBR Gold染色，拍攝熒光圖像，將所得的結果表示 于圖6中。在攪拌后的反應混合物的泳道(泳道3:complex(peptide/CpG/SPG))中，確認泳道 1中觀測到的0VA肽一dA40(S)的條帶及泳道2中觀測到的CpG DNA-dA40(S)的條帶都消失。 由該結果可知，抗原性肽一dA40(S)及CpG DNA - dA40(S)兩者與SPG復合化，生成了更高分 子量的復合體(0VA肽一 dA40 (S) /CpG DNA-dA40 (S) /SPG三元復合體）。本實施例中，以使每 1個分子的三元復合體中含有最大7根dA40(S)的分子鏈的方式，調節(jié)了 SPG、0VA肽一 dA40 (S)及CpG DNA-dA40(S)的摩爾比。另外，由于OVA肽一dA40(S)與CpG DNA-dA40(S)的摩爾 比為1:1，并且認為兩者之間在與SPG的復合體形成能力方面沒有差別，因此認為生成了三 元復合體。
[0131] 作為0VA肽以外的抗原性肽，對具有下述的氨基酸序列的抗原性肽/核苷酸綴合 物，利用上述的方法制備了三元復合體。
[0132] [表 1]
[0135] 實施例6:基于抗原性肽/CpG/SPG三元復合體的肽特異性免疫應答的評價
[0136] 將（1)實施例2 中制備的0VA肽一dA40 (S)/SPG復合體(5yg)、（ 2)0VA肽一 dA40 (S)/ SPG復合體（5yg)及CpG DNA(30yg)、（ 3) OVA肽一dA40 (S)/SPG復合體（5yg)及CpG DNA-dA40 (S) /SPG復合體（除了沒有使用OVA肽一dA40 (S)的10 % DMSO水溶液以外，利用與實施例5相 同的方法制備：30yg)、（ 4)實施例5中制備的0VA肽一 dA40 (S) /CpG DNA-dA40 (S) /SPG三元 復合體(5yg)的任意一種向小鼠（C57BL/6小鼠、雄性、7周齡)皮內施用（1次）。從施用起1周 后，從小鼠采集脾細胞后，播種到96孔板中（1.0 X 106細胞/孔），用OVA肽進行刺激（10yg/ mL)，對是否誘導出抗原特異性干擾素一 γ (IFN- γ )進行了研究。
[0137] 在利用0VA肽對脾細胞的刺激24小時后，使用酶聯(lián)免疫測定(ELISA)，對培養(yǎng)基中 的IFN - γ量進行了定量。將結果表示于圖7中。如實施例3中所示，若僅為0VA肽一dA40(S)/ SPG復合體，則無法誘導對OVA肽而言特異性的干擾素應答，然而若同時施用OVA肽一 dA40 (S)/SPG復合體及CpG DNA，則誘導出強的干擾素應答。此外確認，利用OVA肽一dA40⑶/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元復合體的施用，也可以誘導出與同時施用OVA肽一dA40(S)/SPG復合 體及CpGDNA的情況相同程度的干擾素。有趣的情況在于，在同時施用0VA肽一 dA40 (S) / SPG 復合體及CpG DNA-dA40(S)/SPG復合體的情況下，確認誘導出強的干擾素應答。由這些結 果可知，利用0VA肽一 dA40 (S) /CpG DNA-dA40 (S) /SPG三元復合體的施用，也可以發(fā)揮0VA 肽向抗原提呈細胞的引入及借助基于CpG DNA的TLR9的細胞刺激的各自的效果。
[0138] 實施例7:基于抗原性肽/CpG/SPG三元復合體的肽特異性細胞傷害性T細胞的誘導 能力的評價
[0139] 實施例6中，將從皮內施用了（1)0VA肽、（2)0VA肽及CpG DNA、（3)0VA肽及CpG DNA-dA40 (S) /SPG復合體、（4)實施例5 中制備的OVA肽一 dA40 (S) /CpG DNA-dA40 (S) /SPG 三元復合體的任意一種的小鼠采集、且用OVA肽一 dA40 (S) /SPG復合體刺激了的小鼠脾細胞 培養(yǎng)6天，進行抗體染色后，使用流式細胞儀，評價了對0VA肽而言特異性的細胞傷害性(CD8 陽性)T細胞的比例。
[0140] 將CD8陽性T細胞中的對0VA肽而言特異性的CD8陽性T細胞的比例表示于圖8中。與 僅施用0VA肽的情況(peptide)、同時施用0VA肽及CpG DNA的情況(peptide+CpG)相比，在施 用0VA肽一dA40(S)/SPG復合體及CpG DNA - dA40(S)/SPG復合體的情況下（peptide+CpG/ SPG)、或施用OVA肽一dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元復合體的情況下（p印tide/CpG/ SPG )，可以使對OVA肽而言特異性的⑶8陽性T細胞的比例增大。
[0141] 實施例8:對來自于黑素瘤細胞特異性抗原蛋白質的肽的免疫應答(基于抗原性 肽/CpG/SPG三元復合體的肽特異性免疫應答的評價）
[0142] 將（1)使用具有來自于小鼠黑素瘤細胞特異性抗原蛋白質的氨基酸序列 (EGSRNQDWL (序列編號3))的抗原性肽(gp 100)依照實施例1、2同樣地制備的gp 100肽一 dA40 (S)/SPG復合體(5yg)及CpG DNA-dA40(S)/SPG復合體(30yg)、（2)依照實施例5同樣地制備 的gpl〇〇肽一dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元復合體（5yg)的任意一種向小鼠（C57BL/ 6小鼠、雄性、7周齡)皮內施用（1次）。從施用起1周后，從小鼠采集脾細胞后，播種到96孔板 中（1 .OX 106細胞/孔），用gplOO肽進行刺激（10yg/mL)，對是否誘導出抗原特異性的干擾 素一 γ (IFN - γ )進行了研究。
[0143] 在利用gplOO肽對脾細胞的刺激24小時后，使用酶聯(lián)免疫測定(ELISA)，對培養(yǎng)基 中的IFN - γ量進行了定量。將結果表示于圖9中。如實施例3中所示，若僅為gplOO肽一dA40 (S) /SPG復合體，貝lj無法誘導出對gp 100肽而言特異性的干擾素應答(data not shown)。但 是，若同時施用gp 100肽一 dA40 (S) /SPG復合體及CpG DNA-dA40 (S) /SPG復合體，則誘導出 強的干擾素應答。此外確認，利用gplOO肽一dA40(S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元復合體的 施用，同樣地誘導出干擾素。由這些結果可知，通過將含有0VA肽以外的抗原性肽的抗原性 肽/CpG/SPG三元復合體向小鼠施用，也可以誘導出肽特異性的免疫應答。
[0144] 實施例9:利用不同的抗原性肽的免疫應答
[0145] 使用0VA肽以外的抗原性肽，利用實施例5中記載的方法，制備出抗原性肽一dA40 (S)/CpG DNA-dA40(S)/SPG三元復合體，利用實施例6中記載的步驟，進行了肽特異性的免 疫應答的評價。將所用的抗原性肽的氨基酸序列及實驗結果(有無對抗原性肽而言特異性 的IFN - γ的誘導）表示于下述的表2中。而且，No.2中所示的氨基酸序列（序列編號28)是 0VA肽(No. 1)的隨機序列。表2中的No. 1、3、4中，從小鼠采集后，在播種到孔板中的脾細胞的 刺激時使用了三元復合體中所含的抗原性肽，然而對于No. 2,使用了氨基酸組成相同而氨 基酸序列不同的0VA肽。另外，表2的IFN應答的列中，"+"表示觀測到IFN- γ的產生，"一"表 示沒有觀測到IFN - γ的誘導。在用具有與向小鼠施用的三元復合體中所用的抗原性肽相 同的氨基酸序列的肽刺激脾細胞的情況下(No. 1、3、4、5)，觀察到抗原性肽特異性的IFN應 答，然而在用具有不同的氨基酸序列的肽刺激脾細胞的情況下(No. 2)，完全觀測不到IFN產 生。由這些結果可知，利用向小鼠施用的三元復合體，誘導出肽特異性的免疫應答。
[0146] [表 2]
[0149]實施例10:利用抗原性肽向SPG的主鏈或側鏈上的葡萄糖殘基的導入的肽/β- 1， 3 -葡聚糖復合體的制備(1)
[0150]對利用了炔烴與疊氮化合物的"點擊反應"（HUsigen反應）的抗原性肽向SPG的主 鏈或側鏈上的葡萄糖殘基的導入進行了研究。將反應流程表示如下。使羰基二咪唑(CDI)和 炔丙胺(PA)與存在于SPG的葡萄糖殘基的6 -位的伯醇反應，借助生成的氨基甲酸酯鍵，選 擇位置地將炔烴導入SPG的主鏈或側鏈葡萄糖殘基上（SPG - PA)。導入SPG的炔烴殘基數(shù)與 葡萄糖殘基數(shù)的比為10~20%，因此可以認為，由于主鏈的葡萄糖殘基周圍的空間位阻，大 部分被導入側鏈的葡萄糖殘基上。使如此得到的SPG衍生物在銅催化劑的存在下，與將C末 端用疊氮基修飾了的抗原性肽(peptide(N3):從GENEDESIGN(株)購入。本實施例中，使用了 疊氮修飾0VA肽。）反應，利用點擊反應，制備出肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體。
[0151][化 3]
[0153] 實施例11:利用借助了共價鍵的抗原性肽向SPG的主鏈或側鏈上的葡萄糖殘基的 導入的肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體的制備(2)
[0154] 對利用了 α，β -不飽和酮與硫醇的邁克爾加成反應的抗原性肽向SPG的主鏈或側 鏈上的葡萄糖殘基的導入進行了研究。將反應流程表示如下。在Ν，Ν-二異丙基乙胺 (DIPEA)的存在下，使羰基二咪唑(CDI)和甲基丙烯酸2-氨基乙酯(ΑΕΜΑ)與存在于SPG的側 鏈的葡萄糖殘基的6 -位的伯醇反應，借助生成的氨基甲酸酯鍵，導入了甲基丙烯酰基 (SPG-AEMA)。其后，使向C末端導入了半胱氨酸的抗原性肽(peptide( - SH):從GENEDESIGN (株)購入。）在三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)的存在下與SPG-ΑΕΜΑ反應，制備出肽/β - 1，3-葡聚糖復合體。
[0155] [化 4]
[0157] 實施例12:基于借助共價鍵在具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖的側鏈上的葡萄糖 殘基上鍵合了抗原性肽的、抗原性肽/CpG/SPG三元復合體的抗原性肽特異性免疫應答的評 價
[0158] 使用與實施例2、5中記載的方法相同的方法，使實施例10、11中制備的肽/β- 1， 3-葡聚糖復合體與CpG DNA-dA40 (S)復合化，制備出抗原性肽/CpG/SPG三元復合體。將其 向C57BL/6小鼠（雄性、7周齡）的皮內施用1次（相當于CpG DNA30yg的量）。從施用起1周后， 從小鼠采集脾細胞后，播種到96孔板中（1.0 X 106細胞/孔），用0VA肽進行刺激（lOyg/mL)， 對是否誘導出抗原特異性的干擾素一 γ (IFN- γ )進行了研究。將所用的抗原性肽的氨基 酸序列及實驗結果(有無對抗原性肽而言特異性的IFN - γ的誘導)表示于下述的表3中。而 且，與實施例9相同，No. 2中所示的氨基酸序列(序列編號28)是0VA肽(No. 1)的隨機序列。表 3中的No. 1、3、4中，在從小鼠采集后，在播種到孔板中的脾細胞的刺激時，使用了三元復合 體中所含的抗原性肽，然而對于No. 2,使用了氨基酸組成相同而氨基酸序列不同的0VA肽。 另外，表3的IFN應答的列中，"+"表示觀測到IFN- γ的產生，"一"表示沒有觀測到IFN- γ 的誘導。與實施例9的結果相同，在用具有與向小鼠施用的三元復合體中所用的抗原性肽相 同的氨基酸序列的肽刺激脾細胞的情況下(No. 1、3、4)，觀測到抗原性肽特異性的IFN應答， 然而在用具有不同的氨基酸序列的肽刺激脾細胞的情況下(No.2)，完全觀測不到IFN產生。 由這些結果可知，利用向小鼠施用的三元復合體，誘導出肽特異性的免疫應答。
[0159] [表 3]
[0161] 而且，本發(fā)明可以不脫離本發(fā)明的廣義的精神和范圍地實現(xiàn)各種實施方式及變 形。另外，上述的實施方式是用于說明本發(fā)明的實施方式，而不是限定本發(fā)明的范圍的實施 方式。即，本發(fā)明的范圍并非由實施方式給出，而是由技術方案的范圍給出。此外，在技術方 案的范圍內及與之同等的發(fā)明的意義的范圍內實施的各種變形被視為本發(fā)明的范圍內。
[0162] 本申請是基于2014年2月6日申請的日本專利申請2014 - 21333號的申請，包括其 說明書、技術方案的范圍、附圖及摘要。上述日本專利申請中的公開全都被作為參照包含在 本說明書中。
【主權項】
1. 一種肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于，含有： 具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖、和 與所述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖化學鍵合了的具有抗原性的肽。2. 根據(jù)權利要求1所述的肽/β- 1，3-葡聚糖復合體，其特征在于， 所述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖是裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然膠的 任意一種。3. -種肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于，含有： 具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖、和 將具有抗原性的肽借助共價鍵與聚核苷酸或聚核苷酸衍生物鍵合了的肽/聚核苷酸綴 合物， 所述肽/聚核苷酸綴合物的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氫鍵與所述具有β-1，3 - 葡聚糖骨架的多糖鍵合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈1根和所述 具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的復合體。4. 根據(jù)權利要求3所述的肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于， 所述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖是裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然膠的 任意一種。5. 根據(jù)權利要求3或4所述的肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于， 所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物是聚脫氧腺苷。6. 根據(jù)權利要求3至5中任一項所述的肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于， 所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物是DNA或RNA的磷酸二酯鍵的至少一部分由磷酸硫酯 基取代了的聚核苷酸衍生物。7. 根據(jù)權利要求6所述的肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于， 在所述DNA或RNA的磷酸二酯鍵中的至少一部分由磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍生 物中，磷酸二酯鍵的50%以上由磷酸硫酯基取代。8. 根據(jù)權利要求3至7中任一項所述的肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于， 構成所述肽/聚核苷酸綴合物的所述具有抗原性的肽與所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生 物借助利用炔烴與疊氮衍生物的環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基與硫醇基的反應、肽C末端的半 胱氨酸殘基的硫醇基與硫醇修飾核酸的硫醇基的反應的任意一種反應生成的共價鍵鍵合。9. 一種肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于，含有： 具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖、和 借助利用炔烴與疊氮衍生物的環(huán)加成反應、馬來酰亞胺基或乙烯砜基與硫醇基的反應 的任意一種反應生成的共價鍵與所述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖的主鏈或側鏈上的 葡萄糖殘基鍵合了的具有抗原性的肽。10. 根據(jù)權利要求8或9所述的肽/β- 1，3 -葡聚糖復合體，其特征在于， 所述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖是裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然膠的 任意一種。11. 一種肽/β-1，3 -葡聚糖復合體，是權利要求1至10中任一項所述的肽/β-1，3-葡 聚糖復合體，其特征在于， 還含有具備具有免疫賦活活性的部分堿基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物， 所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氫鍵與所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的多糖鍵 合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈1根和所述具有β-1，3 -葡聚糖 骨架的多糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的復合體。12. 根據(jù)權利要求11所述的肽/β-1，3-葡聚糖復合體，其特征在于， 所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋結構的復合體的部分是聚 脫氧腺苷。13. 根據(jù)權利要求11或12所述的肽/β-1，3-葡聚糖復合體，其特征在于， 所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋結構的復合體的部分是 DNA或RNA的磷酸二酯鍵的至少一部分由磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍生物。14. 根據(jù)權利要求13所述的肽/β- 1，3-葡聚糖復合體，其特征在于， 在所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋結構的復合體的部分 中，DNA或RNA的磷酸二酯鍵的50%以上由磷酸硫酯基取代。15. -種肽/β-1，3-葡聚糖復合體的制造方法，是制造權利要求8所述的肽/β-1，3 - 葡聚糖復合體的方法，其特征在于， 在螯合劑的存在下進行所述肽/聚核苷酸綴合物的利用液相色譜的分離。16. -種醫(yī)藥組合物，其含有： 具備具有免疫賦活活性的部分堿基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物、和 權利要求1至10中任一項所述的肽/β-1，3-葡聚糖復合體。17. 根據(jù)權利要求16所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于， 所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氫鍵與具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖鍵合，形 成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子鏈1根和所述具有β-1，3 -葡聚糖骨架的 多糖的分子鏈2根構成的三重螺旋結構的聚核苷酸/β-1，3-葡聚糖復合體。18. 根據(jù)權利要求17所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于， 構成所述聚核苷酸/β- 1，3-葡聚糖復合體的所述具有β- 1，3 -葡聚糖骨架的多糖是 裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然膠的任意一種。19. 一種醫(yī)藥組合物，其含有權利要求11至14中任一項所述的肽/β-1，3-葡聚糖復合 體。
【文檔編號】A61K31/7088GK105940012SQ201480073778
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月25日
【發(fā)明人】櫻井和朗, 望月慎, 望月慎一, 森下博美
【申請人】獨立行政法人科學技術振興機構