專利名稱：檢測(cè)不同基質(zhì)中藥中玉米赤酶烯酮毒素及其代謝物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定不同基質(zhì)中藥中玉米赤酶烯酮毒素及其代謝物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法，特別是涉及高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定，光譜及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法確證中藥中玉米赤霉烯酮毒素和α-玉米赤霉烯醇毒素的方法。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，又稱F_2毒素，是由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌及串珠鐮刀菌等產(chǎn)生一種雌激素類真菌毒素。由于鐮刀菌為土壤習(xí)居菌，很多中藥易受到鐮刀菌的侵染，是很多根和根莖類藥材根腐病的主要致病菌，而且部分鐮刀菌為產(chǎn)毒菌，可產(chǎn)生玉米赤霉烯酮毒素，而在植物體內(nèi)，ZEN代謝產(chǎn)生其他一些產(chǎn)物，主要是α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol，α-Z0L)。因此，很有必要對(duì)中藥中玉米赤霉烯酮毒素及其代謝物 α -玉米赤霉烯醇進(jìn)行研究，建立毒素的檢測(cè)方法，制訂其合理的限量標(biāo)準(zhǔn)，以保證中藥的安全有效。^N主要污染玉米、高粱、小麥、大麥等糧谷類作物及其制品如飼料等。借助被污染的乳制品、肉制品等動(dòng)物源性食品，ZEN及其代謝產(chǎn)物可以進(jìn)入人體，給人類的健康造成威脅。^N對(duì)動(dòng)物及人類危害主要表現(xiàn)在影響和破壞生長(zhǎng)發(fā)育及生殖系統(tǒng)方面，人畜誤食含有該毒素的食物后，會(huì)引起雌性激素中毒癥，造成生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。此外，ZEN對(duì)肝臟系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)均有很大的危害，并且有引發(fā)腫瘤的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
到目前為止，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的方法大多僅限于對(duì)食品、農(nóng)產(chǎn)品以及飼料中^Ν， α -ZOL毒素的分析，對(duì)中藥中^Ν，α -ZOL毒素的分析，目前還是空白。因此對(duì)中藥中^Ν， α-ZOL毒素測(cè)定方法的建立研究迫在眉睫。現(xiàn)有的測(cè)定食品、農(nóng)產(chǎn)品以及飼料中的觀隊(duì) α-ZOL毒素的方法，由于樣品基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，干擾較小，一般都較容易測(cè)定。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)不足，選擇了適用于中藥中ΖΕΝ，α -ZOL毒素的提取、凈化方法，優(yōu)化了液相，液質(zhì)的色譜條件，保證樣品處理快捷簡(jiǎn)便，含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，故采用該方法能更加準(zhǔn)確的對(duì)不同基質(zhì)中藥中的ΖΕΝ，α -ZOL毒素進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明是通過采用高效液相色譜熒光，紫外檢測(cè)法測(cè)定中藥中的觀N，α -ZOL毒素的方法，同時(shí)建立了不同基質(zhì)中ΖΕΝ，α -ZOL毒素的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用確證法。具體的不同基質(zhì)中藥中玉米赤酶烯酮毒素及其代謝物α -玉米赤霉烯醇毒素測(cè)定的方法，可以通過以下步驟實(shí)現(xiàn)儀器、藥品及材料儀器Hitachi L-2130高效液相色譜系統(tǒng)，日本Hitachi公司；
Hitachi L-2485 熒光檢測(cè)器，日本 Hitachi 公司；Shimadzu LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)，日本Shimadzu公司；Shimadzu SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器，日本Shimadzu公司；高效液相色譜儀(日本島津公司)；API4000三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀；Qilinbeier 旋渦混合器；Heraeus Multifuge X3R 低溫高速離心機(jī)。CX-250HP型超聲波清洗器，北京醫(yī)療設(shè)備二廠；ZD-9556型水平搖床，太倉(cāng)市科教儀器廠；WH-861型旋渦混合器，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司Zearala testTM HPLC 免疫親和柱，美國(guó) VICAM 公司；GF/A型玻璃微纖維濾紙，英國(guó)WHATMAN公司。Ultimate" XB-C18 色譜柱，Welch Materials 公司；對(duì)照品玉米赤霉烯酮毒素(ZON)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自以色列!^ermentek公司，純度彡99% ； α -玉米赤酶烯酮(α-ZOL)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司，純度彡99% ；色譜分析用乙腈、甲醇均為為色譜純，B&J公司；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。樣品所測(cè)樣品分別購(gòu)自江西樟樹、江蘇鎮(zhèn)江、海南，浙江，河北，北京以及貴州遵義，所有樣品均為市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買而來(lái)，低溫干燥后備用。1、用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥中的^N* α-ZOL毒素a.色譜條件色譜柱為UltimateK XB-C18色譜柱(5 μ m，25(toimX4. 6謹(jǐn))；流動(dòng)相為水-乙腈 (50 50，V/V)；流速lmL/min ；柱溫25°C;發(fā)射波長(zhǎng)274nm，激發(fā)波長(zhǎng)440nm;進(jìn)樣量20yL。b.溶液配制對(duì)照品溶液的制備精密稱取ZON和α-ZOL標(biāo)準(zhǔn)品適量，加乙腈分別制成含量為 50 μ g/mL的溶液；PBS緩沖溶液的配制稱取8. Og氯化鈉、1. 2g磷酸氫二鈉、0. 2g磷酸二氫鉀、0. 2g 氯化鉀溶于900ml水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，用水定容至1000ml。c.樣品溶液的制備樣品提取準(zhǔn)確稱取樣品12. 5g于三角錐形瓶中，加入1. 25g氯化鈉及50ml甲醇水(V V 80 20)，搖床振搖lh，過濾，取IOml濾液加入IOml PBS溶液稀釋，用玻璃
纖維濾紙過濾至濾液澄清，濾液備用。樣品凈化吸取上述濾液IOml于玻璃注射器中，6ml/min過免疫親和柱至2_3ml 空氣通過免疫親和柱，以IOml水淋洗免疫親和柱，棄去流出液，并使2-3ml空氣通過免疫親和柱。準(zhǔn)確加入1.5ml甲醇洗脫，流速慢，收集全部洗脫液于玻璃試管中，用0.45μπι的一次性針頭過濾器過濾后進(jìn)樣分析d.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定。
2、用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定中藥中ZON和α -ZOL的含量、光譜圖確證陽(yáng)性結(jié)果；a.色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，水-乙腈(50 50，V/V)為流動(dòng)相，柱溫25 °C，檢測(cè)波長(zhǎng)236nm ；b.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液20 μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。3、采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行確證。a.液相條件色譜柱為 Phenomenex Gemini 3u C18 IlOA column (20mm*2. 00mm, 3micron)。流動(dòng)相A為水(含0. 甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.1%甲酸)。流速為0.5mL/min，洗脫梯度為 0. Olmin 10% B,0. 6min 10% B, 1. 3min 95% B, 2. 5min 95% B, 2. 51min 10% B,4min 10B%，結(jié)束。b.質(zhì)譜條件采用ESI電離源，負(fù)離子掃描，MRM檢測(cè)模式，三個(gè)離子對(duì)監(jiān)測(cè)。 ZON, m/z 317. 0 — 272. 9 碰撞電壓為-28eV，m/z 317. 0 — 174. 8 碰撞電壓為 _34eV，m/ ζ 317. 0 — 131. 0 碰撞電壓為-40eV ； α -ZOL, m/z319. 0 — 274. 9 碰撞電壓為-30eV，m/z 319. 0 — 159. 9 5並撞電壓為-44eV，m/z 319. 0 — 130. 0 5並撞電壓為-46eV.c.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和上述陽(yáng)性樣品溶液10 μ L，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，測(cè)定。經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，確認(rèn)方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為不同基質(zhì)中藥中玉米赤霉烯酮毒素的測(cè)定方法。本發(fā)明提供了中藥中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定；中藥中玉米赤霉烯酮毒素的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法，并采用光譜圖確證了實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性結(jié)果；中藥中的陽(yáng)性結(jié)果的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果確證。結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可作為不同基質(zhì)中藥中玉米赤霉烯酮毒素的測(cè)定方法。1、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥中的^N和α -ZOL毒素；(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線禾口 α-ZOL 混標(biāo)溶液，稀釋得到不同濃度(0. 01、0. 02、0. 05、0. 10、0. 20、
0. 40,0. 8、1、2. 5μ g/mL)的混標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣，獲得的色譜峰峰面積㈧對(duì)ZEN和α -ZOL 的質(zhì)量濃度(C-μ g/mL)作回歸，得到α -ZOL熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線為A = 721647C+5578. 7，r = 0. 9999，線性范圍為0. 01-2. 5μ g/mL ；得到ZEN熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線為=A = 2*10eC_13664，r = 0. 9999，線性范圍為0. 01-2. 5 μ g/mL。見表1和表2
表1 α -ZOL熒光線性關(guān)系考察結(jié)果_對(duì)照品濃度C ( μ g/mL)峰面積A (均值)0. 010. 020. 050. 100. 20
18203 30076 44013 84894 139224
0. 40277263
0. 80584039
1725178
2. 51813285
表2 ZEN熒光線性關(guān)系考察結(jié)果
對(duì)照品濃度C(yg/mL)峰面積A (均值)
0. 0122930
0. 0241397
0. 0572345
0. 10115157
0. 20292014
0. 40580019
0. 6875230
2. 53807020
(2)最低檢出限和定量限
根據(jù)信噪比S/N ≥ 3為該物質(zhì)的最低檢出限，α-ZOL毒素?zé)晒獾淖畹蜋z出限為 2. 5 μg/kg, ZEN毒素?zé)晒獾淖畹蜋z測(cè)限為4 μ g/kg ；根據(jù)信噪比S/N彡10為該物質(zhì)的最低定量限，α -ZOL毒素?zé)晒獾淖畹投肯逓?. 5 μ g/kg，ZEN毒素?zé)晒獾淖畹投肯逓?. 5 μ g/kg.
(3)日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)
精密吸取同一混標(biāo)溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算ZEN和α -ZOL的峰面積值及RSD，結(jié)果見表3。
表3熒光日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.檢測(cè)不同基質(zhì)中藥中玉米赤酶烯酮毒素(ZON)及其代謝物α-玉米赤霉烯醇毒素 (α-ZOL)的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)、用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥中ZON和a-ZOL的含量；(2)、用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定中藥中ZON和a-ZOL的含量、光譜圖確證陽(yáng)性結(jié)果；(3)、采用HPLC-ESI-MS/MS對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行確證。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的不同基質(zhì)中藥中ZON和a-ZOL的檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定中藥中的ZEN和a-ZOL毒素a.色譜條件色譜柱為UltimateK XB-C18色譜柱(5 μ m，250mmX4. 6mm)；流動(dòng)相為水-乙腈 (50 50，V/V)；流速lmL/min ；柱溫25°C;發(fā)射波長(zhǎng)274nm，激發(fā)波長(zhǎng)440nm;進(jìn)樣量20yL。b.溶液配制對(duì)照品溶液的制備精密稱取ZON和α-ZOL標(biāo)準(zhǔn)品適量，加乙腈分別制成含量為 50 μ g/mL的溶液；PBS緩沖溶液的配制稱取8. Og氯化鈉、1. 2g磷酸氫二鈉、0. 2g磷酸二氫鉀、0. 2g氯化鉀溶于900ml水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 0，用水定容至1000ml。c.樣品溶液的制備樣品提取準(zhǔn)確稱取樣品12. 5g于三角錐形瓶中，加入1.25g氯化鈉及50ml甲醇水 (V V 80 20)，搖床振搖lh，過濾，取IOml濾液加入IOml PBS溶液稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，濾液備用。樣品凈化吸取上述濾液IOml于玻璃注射器中，6ml/min過免疫親和柱至2_3ml空氣通過免疫親和柱，以IOml水淋洗免疫親和柱，棄去流出液，并使2-3ml空氣通過免疫親和柱。準(zhǔn)確加入1.5ml甲醇洗脫，流速慢，收集全部洗脫液于玻璃試管中，用0.45μπι的一次性針頭過濾器過濾后進(jìn)樣分析。d.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定。(2)用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定中藥中ZON和α-ZOL的含量、光譜圖確證陽(yáng)性結(jié)果；a.色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，水-乙腈(50 50，V/V)為流動(dòng)相， 柱溫25 °C，檢測(cè)波長(zhǎng)236nm;b.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和樣品溶液20μ L，注入液相色譜儀，測(cè)定。(3)采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行確證。a.液相條件色譜柱為 Phenomenex Gemini 3u C18 IlOA column (20mnpi<2· 00mm, 3micron)。流動(dòng)相 A為水(含0. 甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0. 甲酸)。流速為0.5mL/min，洗脫梯度為 0. Olmin 10% B,0. 6min 10% B, 1. 3min 95% B, 2. 5min 95% B, 2. 51min 10% B,4min 10B%，結(jié)束。b.質(zhì)譜條件采用ESI電離源，負(fù)離子掃描，MRM檢測(cè)模式，三個(gè)離子對(duì)監(jiān)測(cè)。Ζ0Ν， m/z 317. 0 — 272. 9 碰撞電壓為 _28eV，m/z 317. 0 — 174. 8 碰撞電壓為 _34eV，m/z.317. 0 — 131. 0 碰撞電壓為-40eV ； α -ZOL, m/z319. 0 — 274. 9 碰撞電壓為 _30eV，m/z 319. 0 — 159. 9 碰撞電壓為-UeY, m/z 319. 0 — 130. 0 碰撞電壓為 _46eV。c.測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品和上述陽(yáng)性樣品溶液10 μ L，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，測(cè)定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)不同基質(zhì)中藥中ZON和α-ZOL的方法，其特征在于樣品制備過程中a.提取溶劑采用甲醇水(80 20，V/V)混合溶液；b.提取方式為高速勻質(zhì)提取:3min；c.稀釋溶液采用pH7.0的PBS緩沖溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)不同基質(zhì)中藥中ZON和α-ZOL的方法，其特征在于a.液相色譜法中采用乙腈-水(50 50, V/V)作為流動(dòng)相；b.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中采用水(含0.1%甲酸)和乙腈(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相；c.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中采用ESI電離源，負(fù)離子掃描，MRM檢測(cè)模式。
全文摘要
關(guān)于檢測(cè)不同基質(zhì)中藥中玉米赤霉烯酮毒素及其代謝物α-玉米赤霉烯醇毒素的方法，包括中藥樣品的提取，純化及檢測(cè)，所述的樣品采用甲醇-水(80∶20，V/V)提取，pH7.0吐溫-PBS緩沖溶液稀釋，玻璃纖維膜過濾，免疫親和柱凈化。所述測(cè)定方法包括高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定，光譜及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法確證。液相色譜條件為流動(dòng)相比例乙腈∶水(50∶50，V/V)，熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)270nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm；二極管整列檢測(cè)器波長(zhǎng)236nm。液質(zhì)條件流動(dòng)相A為水(含0.1％甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.1％甲酸)。流速為0.5mL/min，洗脫梯度為0.01min 10％B，0.6min 10％B，1.3min 95％B，2.5min 95％B，2.51min 10％B，4min 10B％，結(jié)束。質(zhì)譜條件為采用ESI電離源，負(fù)離子掃描，MRM檢測(cè)模式。本發(fā)明具有準(zhǔn)確，精密，可靠等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102590363SQ20111000080
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者楊美華, 申紅紅 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所