專(zhuān)利名稱(chēng)：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPQ是莽草酸途徑的關(guān)鍵酶。近年來(lái)，由于除草劑草甘膦的廣泛使用，及其非選擇性的特點(diǎn)，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦基因作物成為熱點(diǎn)。 CP4-EPSPS作為該類(lèi)備選基因，已成功應(yīng)用于多種商業(yè)化抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物。中國(guó)政府對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性極為關(guān)注，并制定了有關(guān)法規(guī)。但由于我們目前未開(kāi)展轉(zhuǎn)基因抗除草劑草甘膦方面的研究，也沒(méi)有建立對(duì)國(guó)外進(jìn)口植物是否為轉(zhuǎn)基因抗除草劑商品進(jìn)行檢測(cè)的體系，所以還待開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因EPSPS蛋白的檢測(cè)方法。免疫檢測(cè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于毒素、殺蟲(chóng)劑、炸藥等的環(huán)境污染和危險(xiǎn)物的檢測(cè)，與其他檢測(cè)系統(tǒng)相比，免疫檢測(cè)方法具有快速、廉價(jià)、簡(jiǎn)便、靈敏和特異的優(yōu)點(diǎn)，可便攜進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。免疫檢測(cè)試劑盒可以快速檢測(cè)某一特定物質(zhì)的含量，但要將免疫分析法應(yīng)用到檢測(cè)轉(zhuǎn)基因EPSPS蛋白， 必須制備相應(yīng)的抗原和抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原的方法。本發(fā)明所提供的制備5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原的方法，包括如下步驟(1)將載體蛋白與雙功能試劑進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物I ；所述雙功能試劑選自 4-馬來(lái)酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基4-[p-馬來(lái)酰亞胺苯基]丁酸鹽或 Ν-[ε-馬來(lái)酰亞胺乙?；鮙硫代琥珀酰亞胺酯；(2)將所述步驟(1)得到的反應(yīng)產(chǎn)物I與序列表中序列1所示的多肽進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物II，即得到5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原。所述步驟(1)中所述載體蛋白與所述雙功能試劑的投料摩爾比為1 10-1 20 或 1 10 或 1 15 或 1 20 ；所述步驟⑵中所述反應(yīng)產(chǎn)物I與所述多肽的投料摩爾比為1 10-1 20或 1 10 或 1 15 或 1 20。所述步驟(1)中所述反應(yīng)的溫度為20°c-25°c或20°C或23°C或25°C，所述反應(yīng)的時(shí)間為lh"3h或Ih或或3h。所述步驟(2)中所述反應(yīng)的溫度為20°c-25°c或20°C或23°C或25°C，所述反應(yīng)的時(shí)間為10h-20h或IOh或15h或20h。所述步驟(1)中所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
所述步驟(1)中在得到所述反應(yīng)產(chǎn)物I之后，還包括以下步驟將所述反應(yīng)產(chǎn)物I進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，用0. OlM PH7. 5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫， 收集OD278為1. 5-3. 0的洗脫液，即得到純化的反應(yīng)產(chǎn)物I ；所述凝膠過(guò)濾層析的介質(zhì)為 Sephadex G_250所述步驟O)中還包括將所述反應(yīng)產(chǎn)物II進(jìn)行透析，得到純化的反應(yīng)產(chǎn)物II的步驟。根據(jù)所述方法制備得到的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。由所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原制備得到的抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原和/或所述抗體在鑒別轉(zhuǎn) 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的制備EPSPS多肽抗原的方法能夠方便、快捷地獲得EPSPS多肽抗原，且合成步驟簡(jiǎn)潔明了、合成成本低，效果好。用本發(fā)明方法制備的EPSPS多肽抗原進(jìn)行免疫得到的抗體的特異性好、最低檢測(cè)限值低。因此，本發(fā)明所提供的制備EPSPS多肽抗原的方法以及由該方法獲得的EPSPS多肽抗原，將在EPSPS蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)中有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。4-馬來(lái)酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯(購(gòu)自Sigma公司，商品目錄號(hào)為S9381)； 羊抗鼠IgG-HRP(購(gòu)自Jackson公司，商品目錄號(hào)為79556)；弗氏完全佐劑(購(gòu)自Sigma 公司，商品目錄號(hào)為F5881)；弗氏不完全佐劑(購(gòu)自Sigma公司，商品目錄號(hào)為F5506)； EDTA(購(gòu)自Sigma公司，商品目錄號(hào)為E6758)；牛血清白蛋(購(gòu)自Sigma公司，商品目錄號(hào)為A7906)；卵清白蛋白(購(gòu)自Sigma公司，商品目錄號(hào)為A5503)；其余NaCl、Na2C03和甘油等常規(guī)試劑均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。實(shí)施例1、制備5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的多肽抗原一、多肽-牛血清白蛋白(多肽-BSA)抗原的制備方法I1、EPSPS蛋白抗原多肽的選擇(1)從Genbank中查找到農(nóng)桿菌CP4-EPSPS蛋白的氨基酸序列，相應(yīng)編碼基因的 Genbank 號(hào)為 Q9R4E4。(2)將上述步驟(1)得到的蛋白序列進(jìn)行ΑΝΤΗΕΡ0Τ軟件分析，選取具有親水性、抗原性、可及性和特異二級(jí)結(jié)構(gòu)的抗原表位，確定擬合成的多肽序列。2、多肽片段的合成上述步驟1所得到擬合成多肽片段采用固相合成法合成，實(shí)測(cè)分子量為1701. 81， 其氨基酸序列如序列表中序列1所示。3、多肽與載體蛋白連接
(1)稱(chēng)取牛血清白蛋(BSA) 12. 3mg,充分溶解于1. OmL 0. OlM PH7. 5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，得到溶液I。(2)向上述步驟(1)得到的溶液I中加入0. ISmg 4_馬來(lái)酰亞胺基丁酸_N_琥珀酰亞胺酯(GMBS)，20°C攪拌反應(yīng)lh，得到含有BSA與GMBS的偶聯(lián)產(chǎn)物的溶液II。GMBS的加入量是過(guò)量的，即BSA與GMBS的投料摩爾比為1 10。(3)將上述步驟(2)所得到溶液II進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，層析介質(zhì)為kphadex G-25，洗脫液為0. OlM PH7. 5磷酸鹽緩沖液，流速控制為50mL/h，用1. 5ml離心管收集過(guò)濾液，在278nm紫外線(xiàn)下測(cè)吸光值，收集第一個(gè)峰的7-9管濾液(OD278為1. 5-3. 0)于反應(yīng)杯， 得到含有純化的BSA與GMBS的偶聯(lián)產(chǎn)物的溶液III。(4)向上述步驟(3)所得到的溶液III中加入3. ^ig上述步驟2合成得到的多肽， 20°C攪拌反應(yīng)10h，得到含有多肽與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的溶液IV。BSA-GMBS偶聯(lián)產(chǎn)物與多肽的投料摩爾比為1 10。(5)將上述步驟(4)所得到的溶液IV置于透析袋中，用0. 01M, PH7. 5磷酸鹽緩沖液(PBQ透析2天，每天換3次透析液，得到純化的多肽與載體蛋白的偶聯(lián)物，即得到5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的多肽抗原。(6)將上述步驟(5)的透析產(chǎn)物分裝，置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜霾襟E中0. 01M, PH7. 5磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制方法如下將8. Og NaCUO. 2g KH2PO4 和 2. 96g Na2HPO4 · 12H20，溶解于蒸餾水中，再用蒸餾水定容至1000mL。方法II1、EPSPS蛋白抗原多肽的選擇與方法I相同。2、多肽片段的合成與方法I相同。3、多肽與載體蛋白連接(1)與方法I相同。(2)向上述步驟(1)得到的溶液I中加入1. Omg琥珀酰亞胺基4_(p_馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸鹽(SMPB)，23°C攪拌反應(yīng)池，得到含有BSA與SMPB的偶聯(lián)產(chǎn)物的溶液II。SMPB 的加入量是過(guò)量的，即BSA與SMPB的投料摩爾比為1 15。(3)與方法I相同。(4)向上述步驟(3)所得到的溶液III中加入5. Img上述步驟2合成得到的多肽， 23°C攪拌反應(yīng)15h，得到含有多肽與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的溶液IV。BSA-SMPB偶聯(lián)產(chǎn)物與多肽的投料摩爾比為1 15。(5)與方法I相同。(6)與方法I相同。方法III1、EPSPS蛋白抗原多肽的選擇與方法I相同。2、多肽片段的合成
5
與方法I相同。3、多肽與載體蛋白連接(1)與方法I相同。(2)向上述步驟⑴得到的溶液I中加入1. 53mg Ν_[ ε -馬來(lái)酰亞胺乙?；鮙硫代琥珀酰亞胺酯(Sulf0-EMCS)，25°C攪拌反應(yīng)3h，得到含有BSA與Sulf0-EMCS的偶聯(lián)產(chǎn)物的溶液II。Sulfo-EMCS的加入量是過(guò)量的，即BSA與Sulfo-EMCS的投料摩爾比為1 20。(3)與方法I相同。(4)向上述步驟(3)所得到的溶液III中加入6. 8mg上述步驟2合成得到的多肽， 25°C攪拌反應(yīng)20h，得到含有多肽與載體蛋白偶聯(lián)產(chǎn)物的溶液IV。BSA-Sulfo-EMCS偶聯(lián)產(chǎn)物與多肽的投料摩爾比為1 20。(5)與方法I相同。(6)與方法I相同。二、多肽-卵清白蛋白(多肽-OVA)抗原的制備方法與實(shí)驗(yàn)一中方法I所述多肽-牛血清白蛋白抗原的制備方法相同，不同的是所用的載體蛋白為卵清白蛋白(OVA)。實(shí)施例2、EPSPS多肽抗原的應(yīng)用一、利用多肽-牛血清白蛋白抗原制備抗體(1)取6-8周齡的Bal b/C小白鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。(2)基礎(chǔ)免疫用PBS將上述實(shí)施例1中方法I制備的多肽-牛血清白蛋白抗原稀釋為lmg/ml的溶液，取Iml抗原溶液用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，然后加入Iml的弗氏完全佐劑，充分乳化，直到滴入水中不擴(kuò)散。將乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射Bal b/C小鼠，注射劑量為0. Img抗原/只。(3)加強(qiáng)免疫基礎(chǔ)免疫3周后，取Iml上述稀釋好的多肽-牛血清白蛋白抗原溶液，用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，然后加入Iml弗氏不完全佐劑，充分乳化，直到滴入水中不擴(kuò)散。將乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射Bal b/C小鼠，注射劑量為0. Img抗原/只。按照上述方法每隔2周加強(qiáng)免疫一次，共4次，并從第三次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，每次免疫后第5天，從小鼠眼眶采血，測(cè)定抗體效價(jià)，待效價(jià)大于1 8000后，采血，分離出多肽-牛血清白蛋白抗血清，即得到抗體。二、抗體效果檢測(cè)下述實(shí)驗(yàn)中所用的各種緩沖液如下(1)包被緩沖液0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液；0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液的配制方法如下分別稱(chēng)取1. 5g Na2CO3和2. 93g NaHCO3，用蒸餾水充分溶解后，用蒸餾水定容至 1000mL。(2)磷酸鹽緩沖液含有質(zhì)量百分含量為0. 9%的NaCl的0. 1Μ、ρΗ7. 5磷酸鹽緩沖液。所述磷酸鹽緩沖液的配制方法如下分別稱(chēng)取8. Og NaCUO. 2g KH2PO4 和 2. 96g Na2HPO4 · 12H20，用蒸餾水充分溶解后，
6用蒸餾水定容至1000mL。(3)樣品稀釋液PBSTG 每IL樣品稀釋液中含有8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12Η20、1· OmL Tween-20 和 Ig 明膠，其余為水。(4)檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液含有0. OlM檸檬酸三鈉和0. 03M Na2HPO4的pH5. 5 的水溶液。(5)底物緩沖液將20. Omg鄰苯二胺(OPD)溶解于10. OmL檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中，然后加入4μ L體積百分含量為30%的H2A得到的溶液。(6)終止緩沖液2. OM的硫酸水溶液。(7)洗滌液每 IL 洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 ·12Η2 和 1. OmL Tween-20，其余為水。(一 )抗體抑制實(shí)驗(yàn)1、多肽-卵清白蛋白包被抗原溶液的配制將上述實(shí)施例1制備的多肽-卵清白蛋白抗原完全解凍后，用上述包被緩沖液按 1 1000、1 2000、1 4000、1 8000、1 16000 進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)琒卩抗原稀釋為 lug/mL、 0. 5ug/mL、0. 25ug/mL、0. 125ug/mL、0. 0625ug/mL。2、多肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制(1)稱(chēng)取IOmg多肽(由上述實(shí)施例1制備得到)，充分溶解于IOML PBS和甘油 (PBS和甘油的體積比為1 1)組成的混合液中，得到濃度為lmg/mL的多肽溶液。(2)用樣品稀釋液將上述步驟(1)的多肽溶液配成濃度為500ng/mL的多肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 3、多肽-牛血清白蛋白抗血清稀釋液的配制將上述步驟一制備的多肽-牛血清白蛋白抗血清用樣品稀釋液按1 1000、 1 2000、1 4000、1 8000、1 16000 進(jìn)行梯度稀釋。4、將羊抗鼠IgG-HRP用由PBS和甘油(PBS和甘油的體積比為1 1)組成的混合液稀釋成0. lmg/mL，保存于-20°C冰箱中。使用時(shí)用樣品稀釋液按1 1000稀釋。5、抗原、抗體的棋盤(pán)格實(shí)驗(yàn)(1)包被原的包被將上述步驟1制備的不同濃度的包被抗原溶液加入到酶標(biāo)板中，每孔100μ 1，37°C溫育3小時(shí)；倒去酶標(biāo)板中的溶液，用洗滌液洗板4次，甩干；(2)在步驟(1)的酶標(biāo)板中加入上述步驟2制備的多肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液(實(shí)驗(yàn)孔)，每孔50 μ L，對(duì)照孔中不添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液而加入50 μ L樣品稀釋液；(3)分別向上述實(shí)驗(yàn)孔和對(duì)照孔中加入上述步驟3制備的不同濃度的抗血清稀釋液，每孔50 μ L ；37°C溫育30分鐘；倒掉酶標(biāo)板中的溶液，用洗滌液洗板4次，甩干；(4)在實(shí)驗(yàn)孔和對(duì)照孔中分別加入100 μ L用樣品稀釋液稀釋的IgG-HRP，37°C溫育30分鐘；用洗滌液洗板4次，倒掉酶標(biāo)板中的溶液，甩干；(5)向?qū)嶒?yàn)孔和對(duì)照孔中分別加入100 μ L底物緩沖液，37°C溫育15分鐘后，再向每孔中加入50 μ L終止緩沖液終止反應(yīng)；(6)在492nm下測(cè)定吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，結(jié)果如表1所示。表1抗原和抗體棋盤(pán)格實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.制備5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原的方法，包括如下步驟(1)將載體蛋白與雙功能試劑進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物I；所述雙功能試劑選自4-馬來(lái)酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基4-[p-馬來(lái)酰亞胺苯基]丁酸鹽或 Ν-[ε-馬來(lái)酰亞胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亞胺酯；(2)將所述步驟⑴得到的反應(yīng)產(chǎn)物I與序列表中序列1所示的多肽進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物II，即得到5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中所述載體蛋白與所述雙功能試劑的投料摩爾比為1 10-1 20；所述步驟0)中所述反應(yīng)產(chǎn)物I與所述多肽的投料摩爾比為1 10-1 20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中所述反應(yīng)的溫度為 200C _25°C，所述反應(yīng)的時(shí)間為lh-3h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中所述反應(yīng)的溫度為20°C _25°C，所述反應(yīng)的時(shí)間為10h-20h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中在得到所述反應(yīng)產(chǎn)物I之后，還包括以下步驟將所述反應(yīng)產(chǎn)物I進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，用0. OlM PH7. 5磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集 OD278為1. 5-3. 0的洗脫液，即得到純化的反應(yīng)產(chǎn)物I ；所述凝膠過(guò)濾層析的介質(zhì)為kphadex G-250
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟O)中還包括將所述反應(yīng)產(chǎn)物II進(jìn)行透析，得到純化的反應(yīng)產(chǎn)物II的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法制備得到的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原。
9.由權(quán)利要求8所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原制備得到的抗體。
10.權(quán)利要求8所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原和/或權(quán)利要求 9所述的抗體在鑒別轉(zhuǎn)5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的多肽抗原及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的制備5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的多肽抗原的方法，包括如下步驟(1)將載體蛋白與雙功能試劑進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物I；所述雙功能試劑選自4-馬來(lái)酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基4-[p-馬來(lái)酰亞胺苯基]丁酸鹽或N-[ε-馬來(lái)酰亞胺乙?；鮙硫代琥珀酰亞胺酯；(2)將所述步驟(1)得到的反應(yīng)產(chǎn)物I與序列表中序列1所示的多肽進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物II，即得到5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原。本發(fā)明所提供的制備EPSPS多肽抗原的方法以及由該方法獲得的EPSPS多肽抗原，將在EPSPS蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)中有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102492671SQ20111037838
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者南鐵貴, 孫碩, 曹振, 王保民, 王敏, 譚桂玉, 趙洪偉, 高巍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)