一種重組單純皰疹病毒的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒純化技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及到重組單純皰瘆病毒的純化方法，
【背景技術(shù)】
[0002]由I型單純皰瘆病毒(HSV-1)改造而來的重組單純皰瘆病毒(mtHSV)是一種溶瘤病毒，這種病毒能特異性的特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，在腫瘤內(nèi)注射mtHSV的動物實驗和臨床I期實驗中均顯示良好的安全性及對膠質(zhì)瘤、宮頸癌及黑色素瘤、橫紋肌肉瘤抗瘤效應(yīng)。目前HSV-1變異缺失病毒G207通過I期臨床試驗，在惡性膠質(zhì)瘤患者中使用后，發(fā)現(xiàn)延長了患者生存時間，初步證明其安全性和有效性。然而長期以來，仍然缺乏高效簡便低成本的純化方法。目前常規(guī)的主要有純化病毒的方法主要有沉淀法、離心法、透析法和親和層析法等，其中超速離心法是應(yīng)用最廣泛的一種方法。沉淀法和透析法純化效果不佳，親和層析法和氯化銫平衡密度梯度離心的純化效果理想，但其價格昂貴，費用較高，不易推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是針對目前常規(guī)的純化病毒的方法上述之不足，而提供一種重組單純皰瘆病毒的非連續(xù)蔗糖密度梯度離心純化方法。
本發(fā)明包括如下步驟:
(I).將在Vero細(xì)胞中擴增得到的重組單純皰瘆病毒上清液中加入5%的PEG8000，4°C攪拌6個小時或過夜，4°C 13500g離心2小時；
(II).沉淀用TNMC緩沖液溶解，并在溶液中加入η-十二烷基-β -D-麥芽苷促進(jìn)沉淀的溶解；
(III).制備蔗糖密度梯度，將濃縮的mtHSV溶液加于蔗糖密度梯度頂層，37500 g離心力在4°C離心18小時；
(IV).將離心管底部刺穿，按一定體積量等體積收集，收集10管，取每管收集液的一部分做蛋白質(zhì)電泳染色和Western blotting鑒定分析，將經(jīng)鑒定分析確定了的病毒含量和純度高的收集管凍存于_80°C或液氮罐中。
步驟(II)中 TNMC 緩沖液配方為 50 mM Tris.HCL100 mM NaCLlO mM CaCl2, ImM MgCl2。
η-十二烷基-β -D-麥芽苷的終濃度為20mM
步驟(III)中蔗糖密度梯度為5%，20%，25%，27.5%，30%，35%。
本發(fā)明所涉及到的試劑溶液配方如下:
磷酸鹽緩沖液(PBS):
1.4 mM KH2PO48 mM Na2HPO4140 mM NaCl
2.7 mM KCl,pH 7.4 病毒生長液:
5OOmL MEM Medium100U/mL青霉素lOOPg/mL鏈霉素)
0.2%牛血清白蛋白組分V 25mM HEPES緩沖液 2Pg/mLTPCK-胰酶十二烷基麥芽苷存儲液:
200 mM η-十二烷基-β-D-麥芽苷(10% W/V 十二烷基麥芽苷)(Anatrace D310S) 蛋白酶抑制劑存儲液(1000 X):1 M溶于丙酮的苯甲基磺酰氟(PMSF) (Sigma L7626)
I mg/mL 亮抑酶肽(Sigma L2884)
1mg/mL 胃酶抑素(Sigma P4265)
蔗糖溶液:
向6個15 mL的聚丙稀離心管(Corning)中分別加入1.5g，2g，2.5g，2.75，3g和3.5g的蔗糖。
再向每個管中加入10 mL 50 mM Tris.HCl pH7.5，I mM EDTA，0.05%十二烷基麥芽苷。 將管子蓋緊，放置在混懸儀上混合大約20分鐘直到所有蔗糖溶解。
2X SDS上樣緩沖液:
20%甘油
4% SDS
100 mM Tris pH 6.8
0.002%溴酚藍(lán)
100 mM 二硫蘇糖醇以下內(nèi)容，為詳細(xì)的方案:
1.病毒增殖
將80%-90%細(xì)胞密度的Vero細(xì)胞用10 mL的無菌移液管吸取6mL PBS分別清洗細(xì)胞3遍；每瓶細(xì)胞瓶中加I mL mtHSV病毒接種液，放置于37°C吸附I個小時；加入病毒生長液維持液于細(xì)胞瓶中，放37 °C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至75-100%細(xì)胞出現(xiàn)CPE病變時進(jìn)行收獲，收獲之前可以將細(xì)胞放于_70°C冰箱，凍融2?3次，4°C 6000g離心20分鐘，去掉沉淀，收集病毒上清。
I1.病毒濃縮
上清液中加入5%的PEG8000，4°C攪拌6個小時或過夜，4°C 13500g離心2小時；沉淀用TNMC緩沖液溶解，并在溶液中加入η-十二烷基-β -D-麥芽苷到其濃度為20mM，促進(jìn)沉淀的溶解，最后使其待離心純化病毒樣品終體積為濃縮前的1%。
II1.非連續(xù)蔗糖密度梯度離心
非連續(xù)蔗糖密度梯度的制備是用密度紙下而上逐級遞減的蔗糖分層堆積而成，制備非連續(xù)密度梯度所需的蔗糖溶液濃度為15%，20%，25%，27.5%，30%，35%。這個梯度能很好的分離純化mtHSV。具體制備方法見附圖1。 15-35%蔗糖梯度制備的裝法方法:在V部分介紹了蔗糖溶液的制備，蔗糖梯度制備是將密度低的蔗糖溶液壓放在密度高的蔗糖溶液上這樣逐級分層堆積而成，因此最底部的第一層應(yīng)該放置35%的蔗糖溶液，附圖1是制備的示意圖。首先現(xiàn)將貝克曼異質(zhì)同晶聚合物離心管垂直固定在管架上，將黃槍頭(200 μ L)安置于藍(lán)槍頭(1000 μ L)末端，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整以確保它們結(jié)合緊密以及黃槍頭末端可以接觸到離心管內(nèi)壁?，F(xiàn)在將35%蔗糖溶液灌入藍(lán)槍頭里面，在重力的作用下35%蔗糖溶液將緩慢而穩(wěn)定的流入到離心管中。具體體積可以根據(jù)實際需求做適當(dāng)調(diào)整。注意:如果溶液沒有從槍頭中流出可以向藍(lán)槍頭施加一定大力壓力，方法就是輕輕敲打藍(lán)槍頭的闊端。35%蔗糖溶液流完后，立即將30%蔗糖溶液灌入到藍(lán)槍頭中，使其流入到離心管并覆蓋在35%蔗糖溶液上。依照此方法依次將27.5%，25%，20%，15%的溶液加入到離心管中。最后將步驟II準(zhǔn)備好的濃縮的病毒樣品溶液小心加入到最離心管的最上層。
蔗糖梯度灌注完后肉眼可以看到不連續(xù)的分層，在頂層加入了樣品溶液后應(yīng)將離心管非常小心的放置在轉(zhuǎn)子里，轉(zhuǎn)子型號是貝克曼SW50.1型轉(zhuǎn)子，于4°C，37500rpm(RCFav132000g)離心16.5小時，離心機加速度和減速度均為7。
離心結(jié)束后應(yīng)立即從轉(zhuǎn)子中取出離心管，要非常小心的拿離心管，千萬不能打亂蔗糖密度層。
將離心管垂直用固定支架放置牢固，準(zhǔn)備開始分部收集，用細(xì)小的針在離心管最底部扎一個很小的洞，使蔗糖溶液能夠按大約每秒鐘一滴的速度從管底流出，用EP管，分層收集到6管中。取每管收集