一種雞傳染性支氣管炎病毒ibv-k136、利用其制備的單克隆抗體細胞株3d5、單克隆抗體 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗體工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株雞傳染性支氣管炎病毒IBV-K136、 利用其制備的單克隆抗體細胞株3D5、單克隆抗體及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性支氣管炎（Avian Infectious Bronchitis，IB)是一種急性、高度傳染 性的病毒性呼吸道疾病由雞傳染性支氣管炎病毒引起。以病雞咳嗽、氣管啰音、打噴嚏為特 征，雛雞最易感。盡管廣泛使用傳染性支氣管炎弱毒疫苗和滅活疫苗，但由于該病血清型較 多，型與型之間的交叉保護較弱以及新型毒株的不斷出現(xiàn)，導致其防治較困難，嚴重威脅了 我國養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。
[0003] 雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis virus，IBV)為冠狀病毒科冠狀 病毒屬，其基因組為不分節(jié)段單股正鏈RNA，本身具有感染性?；蚪M全長27nt左右（不同 毒株略有不同），共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白（S)、核衣殼蛋白（N)和膜蛋白（M)， 其中S基因是IBV抗原變異最主要的基因，在病毒血清學分類中起重要作用。N基因是IBV 的最保守的基因，在IBV鑒別診斷中起重要作用。
[0004] 針對IBV的檢測方法目前主要有：病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)、PCR 檢測、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)等方法。其中以間接ELISA和PCR檢測方法較為快速準確。間 接ELISA方法具有檢測成本低，靈敏度高，特異性好，適合大量樣品等特點。但目前所建立 的ELISA方法主要針對IBV抗體，針對IBV抗原的檢測方法極少，該技術(shù)瓶頸有待突破。而 要實現(xiàn)針對IBV抗原的檢測方法，則需要性能優(yōu)異的雞傳染性支氣管炎病毒單克隆抗體作 為基礎(chǔ)，相應的，就必須建立生產(chǎn)上述單抗的細胞株作，而能否構(gòu)建適宜的細胞株又有賴于 有效的方法及病毒毒株的特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一株適用于感染生物后制備單克隆抗 體雜交瘤細胞株的雞傳染性支氣管炎病毒，同時提供一種利用上述毒株制備的雞傳染性支 氣管炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株、該抗體以及該抗體的應用。
[0006] 為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis virus) IBV-K136,其保藏 編號為 CCTCC N0.V201320。
[0008] 上述一種雞傳染性支氣管炎病毒IBV-K136可以用于制備雞傳染性支氣管炎病毒 抗體。
[0009] 上述一種雞傳染性支氣管炎病毒IBV-K136可以用于制備雞傳染性支氣管炎病毒 單克隆抗體細胞株。
[0010] 利用上述一種雞傳染性支氣管炎病毒IBV-K136制備的一種雞傳染性支氣管炎病 毒單克隆抗體細胞株3D5 (雜交瘤細胞株3D5)，其保藏編號為CCTCC C2014155。
[0011] -種雞傳染性支氣管炎病毒單克隆抗體，上述細胞株3D5制備的。
[0012] 該單克隆抗體可以用于制備雞傳染性支氣管炎病毒檢測試劑盒或雞傳染性支氣 管炎病毒檢測試紙。
[0013] 優(yōu)選的，所述試劑盒對雞傳染性支氣管炎病毒的檢測方法可以是ELISA法。
[0014] 優(yōu)選的，所述試紙對雞傳染性支氣管炎病毒的檢測方法可以是膠體金法。
[0015] 在以上技術(shù)方案中，保藏編號為CCTCC NO. V201320和CCTCC C2014155兩種生 物材料的保藏單位均為"中國典型培養(yǎng)物保藏中心"，其地址為"湖北省武漢市武昌區(qū)八一 路299號武漢大學校內(nèi)"，其中CCTCC NO. V201320的保藏日期為2013年6月28日，CCTCC C2014155的保藏日期為2014年9月4日。
[0016] 在以上技術(shù)方案中，IBV-K136毒株為地方流行的腎型傳染性支氣管炎病毒毒株、 是通過篩選獲得，以該毒株為抗原擴增后進行動物免疫，將免疫血清與骨髓瘤細胞融合篩 選出雜交瘤細胞，利用該方法篩選出性能優(yōu)異的雞傳染性支氣管炎病毒單克隆抗體細胞株 3D5,再對細胞株3D5進行培養(yǎng)以大量表達單克隆抗體。利用上述流程制備的單抗效價高、 抗原抗體反應速度快、特異性強，尤其適用于進一步制備雞傳染性支氣管炎病毒抗原診斷 試劑盒，相應的檢測方法可以是雙抗夾心ELISA法或膠體金法等。
【具體實施方式】
[0017] 以下實施例中的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實施例中所用到的 實驗材料，若無特殊說明，均為自常規(guī)渠道（如普通生化試劑商店）購買得到。
[0018] 以下實施例中的生物材料來源如下：
[0019] IBV-K136株：2013年6月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏號 為 CCTCC NO. V201320。
[0020] SPF雞胚：購自山東省六一農(nóng)場有限責任公司。
[0021] 雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒（M41株）、雞傳染性支氣管炎病毒（Gray 株）、禽流感病毒亞型、雞傳染性法氏囊病毒、雞減蛋綜合征病毒和禽白血病病毒均購自 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0022] 實施例1 (單抗細胞株3D5的篩選以及單抗的制備）
[0023] 1.1抗原的制備
[0024] 將雞傳染性支氣管炎病毒K136株接種于10日齡SPF雞胚，6天后無菌收獲雞胚 尿囊液。將尿囊液差速離心具體方法如下：取-20°C凍存的病毒液融化后，5000g，4°C離心 30min，棄沉淀取上清液，再14000g，4°C離心20min，棄雜蛋白，取上清液。然后進行超速離 心：將上一步得到的上清液以66100g(TYPE60Ti，BeckmanL8-M)4°C離心1. 5h，棄上清，沉淀 加入 2mLTEN 緩沖液（50mM Tris-HCL、50mM NaCL、5mM Na2EDTA、PH7. 4)，并在無菌條件下降 沉淀吹打使其分散、溶解。放入_70°C冰箱備用。
[0025] 取少量濃縮后的病毒蛋白進行不同程度稀釋，用紫外分光光度計測定病毒的0D26(i 和〇〇28。值，使0D值在0. 3-0. 7間，再用公式"蛋白濃度=1. 450D28Q-0. 740D26Q"計算出稀釋 后的濃度，最后乘以稀釋倍數(shù)，獲得純化病毒含量。
[0026] 1. 2動物免疫
[0027] 取適量的病毒液與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下分點注射6周齡BALB/ c小鼠，每只0.2ml ;2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐劑乳化的抗原再各免疫一 次；6周后取相同劑量抗原腹腔注射，不加佐劑；3天后融合。
[0028] 1. 3 融合
[0029] 將加強免疫后3天的小鼠，眼眶采血作為陽性血清，頸脫臼將小鼠致死，無菌打開 腹腔取出脾臟，用研磨棒擠壓，使脾細胞充分釋放，制成脾細胞懸液。選擇生長狀態(tài)良好的 骨髓瘤細胞（SP2/0細胞）和制備好的脾淋巴細胞按1:5混合在一支融合管中，lOOOrpm離 心lOmin，棄上清。將融合管置于手掌中，