一種重組單純皰疹病毒的中試生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及重組單純皰瘆病毒制劑中試生產(chǎn)工藝，屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在基因治療和疫苗開(kāi)發(fā)等研宄領(lǐng)域，重組病毒制劑由于具其自身獨(dú)有的諸多優(yōu)勢(shì)一直是廣大科研工作者研宄的熱點(diǎn)問(wèn)題。任何一種重組病毒制劑，在進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)和投入臨床使用前，都必須進(jìn)行中試生產(chǎn)研宄，以確保該病毒制劑較大產(chǎn)量產(chǎn)出的可行性以滿足市場(chǎng)需要。
[0003]對(duì)于病毒制劑的中試生產(chǎn)研宄，動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)和工藝無(wú)疑處于至關(guān)重要的位置。細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)(large-scale culture technology)是指在人工條件下(設(shè)定pH、溫度、溶氧等)所謂動(dòng)物，在細(xì)胞生物反應(yīng)器(b1reactor)中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。20世界60-70年代，就已創(chuàng)立了可用于大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)和中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。近十?dāng)?shù)年來(lái)，由于人類對(duì)生長(zhǎng)激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細(xì)胞介素等生物制品的需求猛增，以傳統(tǒng)的生物化學(xué)技術(shù)從動(dòng)物組織獲取生物制品已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足這一需求。隨著細(xì)胞培養(yǎng)的原理與方法日臻完善，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)趨于成熟。在過(guò)去幾十年來(lái)，該技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器(B1reactor)進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)核心問(wèn)題是難以產(chǎn)業(yè)化或者說(shuō)是規(guī)?；a(chǎn):一是在工藝生產(chǎn)時(shí)不能大規(guī)模制備產(chǎn)品；二是非批量生產(chǎn)容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性；三是難以對(duì)同批生產(chǎn)進(jìn)行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，特別是培養(yǎng)表達(dá)特異性蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以便獲得大量有用的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方法，已不能滿足所需細(xì)胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。因而必須為工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)創(chuàng)一種新的技術(shù)方法。自70年代以來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器有很大的發(fā)展，種類越來(lái)越多，規(guī)模越來(lái)越大，較常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器有空氣提升反應(yīng)器，中空纖維管反應(yīng)器，無(wú)泡攪拌反應(yīng)器及籃式生物反應(yīng)器等。八十年代以來(lái)，人們逐漸開(kāi)始以生物反應(yīng)器培養(yǎng)代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。動(dòng)物細(xì)胞是一種無(wú)細(xì)胞壁的真核細(xì)胞，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境十分敏感。采用傳統(tǒng)的生物化工技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)，除了要滿足培養(yǎng)過(guò)程必需的營(yíng)養(yǎng)要求外，有必要建立合理的控制模型，進(jìn)行pH和溶氧的最佳控制。細(xì)胞生物反應(yīng)器可通過(guò)微機(jī)有序地定量地控制加入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi)的空氣、氧氣、氮?dú)夂投趸妓姆N氣體的流量，使其保持最佳的比例來(lái)控制細(xì)胞培養(yǎng)液中的PH值和溶氧水平，使系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)，以滿足動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)PH值和溶解氧的需要。如為提高或達(dá)到一定的溶氧水平可改變通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中氧氣和氮?dú)獾谋壤齺?lái)實(shí)現(xiàn)控制溶氧值的目的。采用二氧化碳/碳酸氫鈉(C02/NaHC03)緩沖液系統(tǒng)來(lái)控制培養(yǎng)液的pH值是一種較好的方法。現(xiàn)在，由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全有效的，因此人們對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的態(tài)度已經(jīng)發(fā)生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥物和疫苗，尤其是那些相對(duì)較大、較復(fù)雜或糖基化(glycosylated)的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是首選的生產(chǎn)方式。60年代初，英國(guó)AVRI研宄所在貼壁細(xì)胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，從最初的200ml和800ml玻璃容器開(kāi)始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養(yǎng)規(guī)模。使用的是基于Eagle’s配方的培養(yǎng)基，補(bǔ)充5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后，Wellcome (現(xiàn)為Cooper動(dòng)物保健)集團(tuán)分布于歐洲、非洲和南美洲8個(gè)國(guó)家的生產(chǎn)廠商，應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗，已掌握了5000L的細(xì)胞罐大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)?，F(xiàn)有的病毒制劑的中試生產(chǎn)工藝有的可操作性和可控性不夠強(qiáng)，有的生產(chǎn)成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有的病毒制劑的中試生產(chǎn)工藝有的可操作性和可控性不夠強(qiáng)，有的生產(chǎn)成本較高之不足，而提供一種穩(wěn)定、高效的重組單純皰瘆病毒制劑的中試生產(chǎn)工藝。
[0005]本發(fā)明的方法為:
1.本發(fā)明中所用的微載體為納米T12，為本實(shí)驗(yàn)室制備。
[0006]2.本發(fā)明中所用的細(xì)胞為Ve1細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)。
[0007]3.微載體的水化和消毒:稱一定量的微載體放入容器中，按每克微載體加50?10ml的比例，加入無(wú)Ca2 +和Mg2 +的磷酸緩沖液(PBS)，室溫下放置應(yīng)不少于3小時(shí)，并不時(shí)輕微攪動(dòng)，然后再用新鮮PBS洗一次。將經(jīng)水化后的微載體用70%酒精浸泡消毒，再用無(wú)菌的PBS漂洗一至二次。
4.采用生物反應(yīng)器逐級(jí)放大培養(yǎng)。
[0008]5.細(xì)胞用T25規(guī)格的方瓶進(jìn)行培養(yǎng)，以1: 3.5進(jìn)行傳代。
[0009]6.CelliGen生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體濃度5 g/ L，細(xì)胞接種密度1.1 XlO6cells/ ml，控制溶氧為40 %空氣飽和度、攪拌速度50 r/ min、溫度36值7.0。
7.使用中空纖維濾膜(0.Sum )超濾進(jìn)行病毒純化，回收率保持在70%左右。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明工藝由于采用了先進(jìn)的生物反應(yīng)器作為細(xì)胞孵育系統(tǒng)，并進(jìn)行了在微載體懸浮條件下培養(yǎng)細(xì)胞，先進(jìn)的工藝保證了高病毒產(chǎn)量和制劑的生物活性和穩(wěn)定性。
[0011]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn):在本發(fā)明中，由于采用了第二代生物反應(yīng)器進(jìn)行懸浮培養(yǎng)方式等一系列先進(jìn)和嚴(yán)格的生產(chǎn)工藝，保證了高純度、高得率和高生物活性的重組單純皰瘆病毒制劑的獲得，為重組皰瘆病毒作為基因治療載體及臨床應(yīng)用提供了應(yīng)用前景。可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，滿足商品化需求。該發(fā)明工藝的可操作性和可控性較強(qiáng)。該發(fā)明工藝充分保證了較高的產(chǎn)品生物活性。生產(chǎn)成本較低。
[0012]生產(chǎn)效率高效。對(duì)環(huán)境污染較小。應(yīng)用本發(fā)明所制備的單純重組皰瘆病毒純度高、病毒產(chǎn)量大。
【附圖說(shuō)明】
[0013]附圖1:Vero細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施實(shí)例I
(I)建立重組單純皰瘆病毒包裝細(xì)胞種子細(xì)胞庫(kù)及工作細(xì)胞庫(kù)。
[0015]用高通量細(xì)胞篩選儀重組單純皰瘆病毒種子細(xì)胞庫(kù)中生長(zhǎng)速度較快、細(xì)胞均一性較好且病毒顆粒產(chǎn)量較高的單克隆Vero細(xì)胞。該種子細(xì)胞庫(kù)經(jīng)三代穩(wěn)定培養(yǎng)后建成工作細(xì)胞庫(kù)。
[0016](2)單克隆重組皰瘆病毒的獲取
用空斑形成實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)病毒滴度，以確保獲得