專利名稱：:22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)，具體涉及通過復合擴增，檢測人基因組中21個STR基因座和Amelogenin基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以廣泛用于公安部門日常檢案、DNA數據庫建立、個體識別、親子鑒定以及考古等方面，有助于解決公安部打拐數據庫一子多父母問題和親子鑒定中突變和近親鑒定問題。
背景技術：
：短串聯(lián)重復序列(STR)是目前普遍應用的遺傳標記，由于它具有片段小容易擴增、適宜于檢驗微量或降解檢材、各基因座的擴增條件相似而能夠實現復合擴增等特點，因而采用STR的檢驗系統(tǒng)具有靈敏、準確、快速、信息量大等優(yōu)點，尤其是在建立DNA數據庫方面，STR復合擴增技術具有極大的優(yōu)越性。因此美國FBI選擇了13個STR基因座用于建立DNA數據庫-CODIS(CombinedDNAIndexSystem):CSFIPO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、THOl、TP0X、vWA。這些STR基因座通常被稱為13個核心基因座。正是因為STR基因座具備以上優(yōu)點和應用前景，許多科研機構和公司投入了大量經費對其進行開發(fā)性的研究。國內外已有較多基于STR-PCR技術的熒光檢測技術產品<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>ABIAMPFLSTlfIdentifilerPCR五色CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、THOl、D18S51、D19S433、TPOX、vWA、Amelogenin、D5S818、FGA16ABISinofilermultiplexPCR五色CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、D6S1043、D18S51、D19S433、D12S391、vWA、Amel。genin、D5S818、FGA16專利ZL200510096613.6四色Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、PentaE、CSF1P0、vWA、FGA15AGCU17+1STR熒光檢測試劑盒(專利公開號CN101440410A)五色CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、THOl、D18S51、D19S433、TPOX、vWA、Amelogenin、D5S818、FGA、PentaE、D6S104318為了提供一種新的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)，使其更適合于中國人群在個體識別和親子鑒定等方面的應用，進一步提高系統(tǒng)的累計個體識別力和累積非父排除率，該檢驗系統(tǒng)中必須包含數目更多的、在中國人群中具有高度遺傳多態(tài)性的STR基因座。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)，用于個體識別和親子鑒定。為此，本發(fā)明者對中國人群中STR基因座的遺傳多態(tài)性進行了深入的研究，并以此為依據，開發(fā)了新的STR基因座的5色熒光復合擴增檢驗系統(tǒng)，提供對包括Amelogenin在內的22個基因座的分型結果，提高了系統(tǒng)的累計個體識別力和累積非父排除率。該系統(tǒng)單獨或與其他商品化試劑盒聯(lián)合使用，有助于解決公安部打拐數據庫一子多父母、親子鑒定中突變和近親鑒定問題。本發(fā)明的同時分析人基因組DNA的22個基因座的熒光標記復合擴增系統(tǒng)中，所涉及的22個基因座為Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500。本發(fā)明的熒光標記復合擴增系統(tǒng)還涉及在一個體系中同時擴增22個基因座，將22個基因座分為四組并分別用四種不同的熒光染料FAM、HEX、TAMRA、ROX進行標記。本發(fā)明的熒光標記復合擴增系統(tǒng)優(yōu)選的一種分組及熒光染料標記方式為FAM標記的Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組;HEX標記的D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組；TAMRA標記的D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組；ROX標記的D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組。本發(fā)明所采用的22個基因座分別采用位于該基因座核心重復區(qū)兩側的一對引物進行擴增，其中每對引物中有一條引物的5'端進行熒光染料標記；本發(fā)明還提供用于復合擴增22個基因座的寡核苷酸引物混合物。本發(fā)明的系統(tǒng)中包括每個基因座的等位基因標準物，以確定待檢DNA樣品中各個基因座的基因型；本發(fā)明的系統(tǒng)中包含的用于鑒別DNA樣品性別的基因座是Amelogenin基因座。本發(fā)明的擴增采用聚合酶鏈式反應進行，擴增產物的檢測方法采用多道或單道毛細管電泳。本發(fā)明的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)適用于人的精斑、唾液斑、組織、血痕或血液等檢材來源DNA樣品的檢測分析。為實現本發(fā)明的上述目的，采用如下技術方案—、基因座的確定采用STR分型技術進行個體識別和親子鑒定，一方面是因為STR基因座具有高度多態(tài)性，所用的STR基因座都有較多等位基因，具有較高的非父排除率；但另一方面其突變率也很高，往往會對結果分析(尤其是對親子鑒定樣本中的結果分析)及最后作出判斷帶來許多困難。在實踐中，往往可以發(fā)現一些案例，在檢測的STR基因座中有l(wèi)-2個出現矛盾現象，此時就需要增加檢測的STR基因座數目。根據中山大學伍新堯教授在第二屆"全國親子鑒定理論與實踐研討會"上發(fā)表的《親子鑒定判斷標準和結論表述的推薦意見(討論稿)》對于三聯(lián)體親子鑒定案①最少檢測15個STR基因座，若沒有發(fā)現矛盾基因座，父權指數達10000，可以作出"肯定親生關系"的結論；②若出現1個矛盾基因座，要增加檢測基因座至19個；若發(fā)現有2個矛盾基因座，要增加檢測至28個，沒有新矛盾基因座發(fā)現時，父權指數達10000，可作出"肯定親生關系"的結論；③若發(fā)現有3個矛盾基因座，要增加檢測至35個，沒有新矛盾基因座發(fā)現時，父權指數達10000，可作出"肯定親生關系"的結論；若有4個矛盾STR基因座，則作出"否定親生關系"的結論。對于單親案親子鑒定①至少檢測18個STR基因座，沒有發(fā)現矛盾基因座時，作出"不排除親生關系"的結論；②若發(fā)現有1個矛盾基因座，增加檢測至29個以上；若有2個矛盾基因座，要增加檢測至41個以上，沒有發(fā)現新的矛盾基因座，可作出"不排除親生關系"的結論；③如果出現3個或3個以上矛盾STR基因座，則應作出"否定親生關系"的結論。由上述內容可知，僅檢測13個C0DIS基因座，或只單獨使用現常用的商品化試劑盒(如AGCU17+1STR熒光檢測試劑盒、ABIAMPFLSTlfIdentifiler、PromegaPowerPlex衝16)進行檢測，在許多情況下都是遠遠不夠的。因此，開發(fā)一系列非CODIS基因座的STR分型檢測產品，增加一次性提供所檢測基因座的數目，將有利于親子鑒定和公安部打拐工作的開展。本發(fā)明者對現有文獻報道的CODIS以外的常染色體STR基因座進行深入分析研究。首先優(yōu)選新的高鑒別力基因座，同時考慮到和現常用商品化試劑盒的補充性，對D2S1338、D19S433、PentaE、PentaD、D19S253、D12S391、D6S1043、D1GATA113、D1S1627、D1S1677、D2S441、D2S1776、D3S3053、D3S4529、D4S2364、D4S2408、D5S2500、D6S474、D6S1017、D8S1115、D9S1122、D9S2157、D10S1248、D10S1435、D11S4463、D12ATA63、D14S1434、D17S974、D17S1301、D18S853、D20S482、D20S1082、D22S1045等33個STR基因座在中國人群的遺傳多態(tài)性開展調查研究，對1800多名個體進行基因型檢測，根據各基因座等位基因的分布頻率計算個體識別能力(DP)、雜合度(H)、非父排除率(PE)等數據，最終確立了21個STR基因座的構成D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500，表明這21個STR基因座在人群中具有高度的遺傳多態(tài)性和良好的等位基因頻率分布。將上述21個STR基因座加上用于鑒別人性別的Amelogenin基因座即構成本發(fā)明的復合擴增檢驗系統(tǒng)。該基因座構成突破了現有13個核心基因座的模式，提供了非C0DIS基因座以外的21個基因座的分型結果，是世界上首個完全非CODIS基因座的熒光檢測系統(tǒng)，單獨使用時是目前市場上單管反應提供最多基因座分型結果(21個STR基因座加Amelogenin基因座)的產品，具有更高的累計個體識別力和累積非父排除率；或聯(lián)合現常用商業(yè)化試劑盒使用(如下表)，有助于解決公安部打拐數據庫一子多父母、親子鑒定中突變和近親鑒定的問題。聯(lián)合使用的系統(tǒng)/試劑盒名稱聯(lián)合檢測時提供的STR基因座數目相同的基因座22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)(本專利)AGCU17+1STR熒光檢測試劑盒(專利公開號CN101440410A)37Amelogenin、D19S433ABIAMPFLSTR*Identifiler35Amelogenin、D19S433PromegaPowerPlex②1636AmelogeninAGCUMini-補充基因座28Amelogenin、熒光檢測試劑盒D19S433專利ZL200510096613.635AmelogeninABISinofilermultiplex35AmelogeninSTRtyper-20Gkit39AmelogeninSTRtyper-16GCkit35AmelogeninSTRtyper-10F/Gkit30Amelogenin二、熒光標記復合擴增體系的基因座組合方案設計本研究對熒光染料進行了鑒別、遴選，選用了FAM、HEX、TAMRA、ROX和SIZ五種熒光標記物，構建了5色熒光組合方案。在確定5色熒光組合方案的基礎上，通過大量反復實驗，在國內首次自行設計出基因座組合以及熒光標記的方式。從生產成本、各基因座各引物擴增效率等方面考慮，選擇了藍色7個基因座、綠色6個、黃色5個、紅色4個。采用這種標記組合后，沒有發(fā)現非目的片段以外的擴增峰，這表明各基因座引物序列之間沒有錯配的情況，不會產生和DNA模板在非目標區(qū)域的結合和擴增，即使更換各組的標記熒光素也不會產生非目的擴增峰。以下為其中一種優(yōu)選的產品組合方式Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組，熒光標記物為6-FAM;D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組，熒光標記物為HEX;D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組，熒光標記物為TAMRA;D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組，熒光標記物為R0X。內標選用熒光標記物為SIZ。這種獨創(chuàng)的基因座組合方式使得僅需標記四種熒光就可實現這22個基因座的同時檢測分析。結果表明我們所使用的這種組合和分色方式，能夠滿足分析的要求，各基因座能夠得到正確的分型結果，且峰值相對均衡。在組合方案的基礎上，根據22個基因座的側翼序列進行引物設計，實現22個基因座在同一反應中的復合擴增，同時將全部基因座擴增產物控制在400bp以內而實現高靈敏度，更加適宜于檢驗微量或降解檢材。本發(fā)明在國內首次實現22個基因座同時在單一反應中的復合擴增，并以5色熒光標記進行檢驗。三、熒光標記STR復合擴增體系的優(yōu)化及建立1、基因座之間平衡度的調配隨著復合擴增體系中基因座數目的增加，由于擴增競爭的影響，各基因座的相對平衡控制難度加大，通過多次反復實驗，優(yōu)化引物序列、濃度，終達到平衡。2、復合擴增條件的建立先對22個基因座的單一擴增條件進行優(yōu)化，在成功地建立了單個基因座擴增條件的基礎上，研究22個基因座復合擴增PCR反應條件，通過大量的反復實驗確定了復合擴增中的各個參數，如，循環(huán)參數、退火溫度、緩沖液離子強度、酶量、復合擴增反應體積的變化以及模板DNA量等，使擴增產物達到平衡、特異的要求，建立起復合擴增體系，同時擴增出22個基因座。本發(fā)明的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)良好的應用效果主要表現在下述幾個方面1.系統(tǒng)的靈敏度高本發(fā)明中22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)在DNA模板量為0.12ng的條件下，可檢出全部22個基因座。2、特異性強通過大量反復驗證，本發(fā)明復合擴增結果無22個基因座之外的擴增產物。3.遺傳學調查用22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)對中國漢族群體進行遺傳學調查，結果表明在中國漢族人群中的總體隨機匹配概率為8.3X10—2°，累積非父排除率為0.9999999893，高于現有技術所達到的水平。4.實際應用的效果本發(fā)明中22個基因座的熒光標記復合擴增系統(tǒng)已在國內10個省市的公安單位中測試與試用，結果表明該系統(tǒng)多態(tài)性高，平衡性好，靈敏度高，特異性高，分型結果準確，完全能夠滿足實際案件檢驗、DNA數據庫建設以及親子鑒定的需要。圖1:對無關個體DNA樣品的STR分型結果。[0046]圖2:22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)的等位基因分型標準物。圖3:對實施例2樣品中的STR分型結果。圖4:對實施例3樣品中的STR分型結果。具體實施方式下面的實施例用來進一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。實施例122個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)的復合擴增以及熒光檢測1、22個基因座的分組及熒光標記Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組，熒光標記物為6-FAM;D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組，熒光標記物為HEX;D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組，熒光標記物為TAMRA;D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組，熒光標記物為R0X。內標選用熒光標記物SIZ。2、PCR擴增體系組分—人基因組DNA反應混合物(含2.5XPCR緩沖液、MgCl21.2-3.0raM和r^c，dNTPs200WM4種dNTP)L0054」引物混合物(21+1，含22個基因座的22對引物，濃度范圍在O.1-2uM)熱啟動G-Taq酶(5U/uL)sdH203、擴增熱循環(huán)(1)將PCR擴增管置于熱循環(huán)儀上；(2)選擇下面推薦的程序進行擴增；(3)擴增后的樣品應避光保存；熱循環(huán)儀的擴增程序初始變性熱循環(huán)終延伸保溫10個循環(huán)94°C1分鐘，62°Cl分鐘，72°Cl分鐘60°C4°C20個循環(huán)90°Cl分鐘，60分鐘維持60°Cl分鐘，72°Cl分鐘4、擴增產物在遺傳分析儀上熒光檢測由去離子甲酰胺與系統(tǒng)中分子量內標(AGCUMarkerSIZ-500)組成上樣混合物〔(0.5iiLAGCUMarkerSIZ-500)X(進樣數)+(12yL去離子甲酰胺)X(進樣數)〕。將12.5iiL上樣混合物與liiL擴增產物或系統(tǒng)中等位基因分析標準物(21+lAllelicLadder)混合，避免產生氣泡。95。C變性3分鐘，冰浴3分鐘，并盡快電泳。用遺傳分析儀檢0.12-2ng10,05.0ixL0.5"補足至25.OuL95。c11分鐘測分析。5、分型分析用片段分析軟件GeneM即per分析步驟4中遺傳分析儀檢測收集的數據，將樣品分析數據和21+1AllelicLadder(見附圖2)比較，得到實際樣品的基因分型數據，結果見附圖1。實施例2應用22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)進行親子鑒定(三聯(lián)體)1、收集親子鑒定案件中的血樣本實驗中樣品由XX親子鑒定所提供。2、Chelex-100法提取基因組DNA取0.55iiL全血或13mmX25mm的血斑置于滅菌的1.5mL離心管中，加入lmL超純水，振蕩數秒。置于室溫10分鐘，振蕩數秒。用12，000rpm離心3分鐘。棄上清液，保留足夠上清液蓋沒沉淀，勿攪起沉淀。加入200iiL5%的Chelex-100，振蕩數秒。于56t:保溫30分鐘，振蕩數秒。沸水浴10分鐘，振蕩數秒。用12，000rpm離心5分鐘，上清中為提取得到的人基因組DNA。3、擴增檢測按照實施例1進行PCR擴增、遺傳分析儀檢測并最終獲得分型結果。4、結論由附圖3得到本實驗的親子鑒定父_子_母基因分型如下表1:表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0077]在本例三聯(lián)體親子鑒定中，共檢測21個STR基因座，其中出現1個矛盾基因座(如上表中D19S433的分型結果)，超過"若出現1個矛盾基因座，要增加檢測基因座至19個"的要求，父權指數為84416799，超過10000，可作出"肯定親生關系"的結論。實施例3應用22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)進行親子鑒定(單親)1、收集親子鑒定案件中的血樣本實驗中樣品由黑龍江省公安廳提供。2、Chelex-100法提取基因組DNA按照實施例2，使用Chelex-100法提取基因組DNA。3、擴增檢測按照實施例1進行PCR擴增、遺傳分析儀檢測并最終獲得分型結果。4、結論由附圖4得到本實驗的親子鑒定父_子基因分型如下表2:表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0088]在本例單親親子鑒定中，共檢測21個STR基因座，沒有發(fā)現矛盾基因座，可以作出"不排除親生關系"的結論。實施例4應用22個基因座的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)進行個體識別1、收集血樣本實驗中樣品由XX市公安局提供提供。采集犯罪現場血樣和被害人血樣，采集數名犯罪嫌疑人血樣(本實施例中以3名嫌疑人樣本為例)。[OO92]2、Chelex-100法提取基因組DNA按實施例2中方法提取血樣中的DNA。3、擴增檢測除22個基因座的分組及熒光標記如以下所述之外，其余按照實施例1所述進行PCR擴增、遺傳分析儀檢測并最終獲得分型結果Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組，熒光標記物為HEX;D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組，熒光標記物為6-FAM;D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組，熒光標記物為R0X;D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組，熒光標記物為TAMRA。內標選用熒光標記物SIZ。4、結論本實驗的各人員基因分型如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[0101]在本個體識別案例中，共檢測21個STR基因座，犯罪嫌疑人C的基因型和犯罪現場的血樣基因型完全一致，可以判斷犯罪嫌疑人C在本案中有重大犯罪嫌疑。權利要求一種同時分析人基因組DNA22個基因座的熒光標記復合擴增系統(tǒng)，其特征在于復合擴增分析的22個基因座為Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500。2.如權利要求1所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于所說的22個基因座在一個復合擴增反應體系中同時擴增。3.如權利要求2所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于所述的22個基因座分為四組并分別用四種不同的熒光染料進行標記。4.如權利要求3所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于所述的22個基因座的分組及熒光標記的方式為Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組；D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組；D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組；D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組，使用FAM、HEX、TAMRA、ROX分組標記。5.如權利要求4所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于所述的22個基因座的熒光標記的方式為FAM標記的Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組；HEX標記的D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組；TAMRA標記的D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組；以及ROX標記的D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組。6.如權利要求5所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于所述的22個基因座采用位于該基因座核心重復區(qū)兩側的一對引物擴增，其中每對引物中有一條引物的5'端進行熒光染料標記。7.如權利要求6所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于所述的系統(tǒng)中包括每個基因座所對應的等位基因標準物的混合物，以確定待檢DNA樣品中各個基因座的基因型。8.如權利要求7所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于所述的系統(tǒng)中用于鑒別待檢DNA樣品性別的基因座是Amelogenin基因座。9.如權利要求8所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于其多個基因座的復合擴增采用聚合酶鏈式反應，其擴增產物的檢測方法采用多道或單道毛細管電泳。10.—種同時分析人基因組DNA的方法，其特征在于應用權利要求l-9任一項所述的復合擴增系統(tǒng)來進行DNA樣品分析。11.如權利要求l-9任一項所述的復合擴增系統(tǒng)，其特征在于其適用的DNA樣品來源包括精斑、唾液斑、組織、血痕或血液。專利摘要本發(fā)明涉及一種新的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以同時分析人基因組DNA22個基因座的遺傳多態(tài)性，其中的22個基因座分為4組，共涉及5種顏色的熒光標記。本發(fā)明的熒光標記復合擴增檢驗系統(tǒng)提供用于復合擴增22個基因座的寡核苷酸引物混合物；系統(tǒng)中還包括每個基因座的等位基因標準物，以確定待檢DNA樣品中各個基因座的基因型；系統(tǒng)中包含的用于鑒別DNA樣品性別的基因座是Amelogenin基因座。該系統(tǒng)的檢測結果表明其多態(tài)性高、平衡性好、靈敏度高、特異性高、分型結果準確，完全能夠滿足實際案件檢驗、DNA數據庫建設以及親子鑒定的需要。在中國漢族人群中的總體隨機匹配概率為8.3×10-20，累積非父排除率為0.9999999893。文檔編號C12Q1/68GKCN101698890SQ200910224287公開日2010年4月28日申請日期2009年11月26日發(fā)明者萬慧榮,劉未斌,夏子芳,杜蔚安,湯文文,熊勇華,鄭衛(wèi)國申請人:無錫中德美聯(lián)生物技術有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan