一種提高ssr分子標(biāo)記擴增和檢測效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及SSR分子標(biāo)記檢測應(yīng)用，更具體地， 涉及一種提高SSR分子標(biāo)記擴增和檢測效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳育種、物種親 緣關(guān)系鑒別、基因組作圖、基因定位、基因庫構(gòu)建、基因克隆等許多研宄領(lǐng)域。PCR擴增的檢 測技術(shù)是試驗成功的制約條件，也是技術(shù)難度最大、最復(fù)雜的環(huán)節(jié)。SSR分子標(biāo)記是基于 PCR擴增的分子標(biāo)記，為共顯性標(biāo)記，具有單基因座、等位基因變異多、多態(tài)性豐富、操作簡 單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。目前，SSR分子標(biāo)記已經(jīng)成為重要的遺傳標(biāo)記之一，被廣泛應(yīng)用于植物 指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、分子輔助育種、遺傳多樣性分子、基因定位以及品種純度鑒定等方面。目 前，SSR分子標(biāo)記試驗體系主要包括基因組DNA的提取、SSR標(biāo)記PCR的擴增和PCR產(chǎn)物的電 泳檢測。傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記的PCR擴增程序為：94°C 5min ;94°C 45s，58°C 45s，72°C 50s， 35個循環(huán)；72°C 5min ;時間為大約為2. 5h。
[0003] 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N'_亞甲雙丙烯酰胺（Bis)在催化劑過 硫酸銨和加速劑四甲基乙二胺的作用下聚合而成，它通過改變凝膠總質(zhì)量濃度或單體與交 聯(lián)劑的比例控制空洞大小，能分離、定性及定量分析蛋白質(zhì)、多肽、核酸等高分子化合物。聚 丙烯酰胺凝膠包括非變性聚丙烯酰胺和變性聚丙烯酰胺，非變性聚丙烯酰胺凝膠用于分離 和純化雙鏈DNA片段，變性聚丙烯酰胺凝膠用于分離和純化單鏈DNA片段。SSR標(biāo)記PCR產(chǎn) 物的檢測采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，包括制膠凝膠、預(yù)電泳、上樣、電泳、染色等步 驟，耗時超過4小時。傳統(tǒng)的單次點樣法制備凝膠，預(yù)電泳、電泳、銀染顯色所需實驗試劑耗 費多，操作步驟繁瑣復(fù)雜，費時費工，從而限制了其進行大規(guī)模分子標(biāo)記分析時的效率。如 果采用100孔的電泳孔，那么檢測100個樣品的擴增和電泳過程需要總體耗時超過6小時。 這種檢測效率對于大規(guī)模樣本的基因型檢測顯然時間過長，費用也較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高SSR分子標(biāo)記擴增和檢測效率發(fā)方法，以簡化檢 測步驟、節(jié)約檢測成本，縮短檢測時間，從而提高大規(guī)模SSR分子標(biāo)記分析的工作效率。
[0005] 本發(fā)明提供的一種提高SSR分子標(biāo)記擴增和檢測效率的方法，包括以下步驟： [0006] (1)基因組DNA的提取；
[0007] (2) SSR分子標(biāo)記的PCR擴增；所述PCR擴增包括2個不同的循環(huán)程序；
[0008] (3)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測采用 六次點樣法；所述六次點樣法為同一個加樣孔中分時段先后6次加入不同的PCR產(chǎn)物； [0009] (4)銀染顯色。
[0010]其中，步驟（2)中 PCR擴增方法為：94°C 3min ;94°C 30s，53-62°C 30s，72°C 30s，15個循環(huán)；94°〇2〇8,53-62°〇2〇8,72°〇3〇8,20個循環(huán)；72°〇5111111。
[0011]進一步地，步驟⑵中 PCR 擴增方法為：94 °C 3min ;94 °C 30s，56-60 °C 30s， 72。〇308，15個循環(huán)；941：208,56-601：208,721：308,20個循環(huán) ；721：5111111。
[0012] 在本發(fā)明的實施例中，優(yōu)選地，步驟（2)中PCR擴增方法為：94°C 3min ;94°C 30s， 58。〇3〇8,721：3〇8，15個循環(huán)；941：2〇8,581：2〇8,721：3〇8,20個循環(huán)；721：5111111。
[0013] 本發(fā)明的方法中，步驟（3)在點樣之前的進行預(yù)電泳時間是45-65min，使電泳緩 沖液的溫度達到48-53 °C。
[0014] 優(yōu)選地，步驟（3)中，在點樣之前進行預(yù)電泳，使電泳緩沖液的溫度達到50°C。
[0015] 步驟（3)中電泳條件為2000V，100mA，80W恒功率電泳。
[0016] 步驟⑶所述六次點樣法為在預(yù)電泳結(jié)束后，向點樣孔中加入擴增產(chǎn)物，開始第 一次點樣，電泳5-20min之后進行第二次點樣，電泳時間與第一次相同，之后進行第三次電 泳，電泳時間比第二次縮短lmin，以此類推，至第五次點樣后電泳時間比第4次的電泳時間 縮短lmin ;第六次點樣之后，電泳20-40min，結(jié)束電泳。
[0017] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，電泳時間的可以根據(jù)SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性差異大小 來確定，因此應(yīng)用于本申請的方法中，六次點樣法的第一次點樣的電泳時間，當(dāng)SSR為多態(tài) 性差異大的SSR時選擇15-20min，多態(tài)性差異小時選擇5-8min。在本申請的方法中，六次 點樣法的第六次點樣后電泳時間，也根據(jù)SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性差異大小來確定，多態(tài)性 差異大的SSR時選擇20-30min，多態(tài)性差異小時選擇30-40min，電泳結(jié)束。
[0018] 在本發(fā)明的一個實施例中，由于SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性差異小，故選擇第一次加 樣后的電泳時間為8min，第六次加樣后的電泳時間為30min至電泳結(jié)束。
[0019] 具體地，步驟（3)所述六次點樣法為在預(yù)電泳結(jié)束后，向點樣孔中第一次點樣加 入擴增產(chǎn)物，電泳8min后進行第二次點樣，電泳8min后進行第三次點樣，電泳7min后進行 第四次點樣，電泳6min后進行第五次點樣，電泳5min后進行第六次點樣，電泳30min，結(jié)束 電泳。
[0020] 本發(fā)明提供了上述方法在植物遺傳系譜分析中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明提供了上述方法在高通量植物樣本基因型檢測中的應(yīng)用
[0022] 本發(fā)明通過改進SSR分子標(biāo)記的PCR擴增條件以及聚丙烯酰胺電泳檢測的六次 點樣技術(shù)，極大地縮短了 SSR分子標(biāo)記實驗體系實施的時間，其中，新的PCR擴增方法耗時 為lh 47min，較傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記PCR擴增時間（2h 24min)縮短了 37min;在聚丙烯酰 胺電泳檢測過程中通過六次點樣技術(shù)，較傳統(tǒng)的一次點樣技術(shù)，從制膠凝膠時間，預(yù)電泳時 間、電泳時間和染色時間縮短為傳統(tǒng)電泳時間的五分之一，適用于同時檢測大量樣本的基 因型，制備凝膠和染色試劑的成本也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記檢測方法。本發(fā)明方法 尤其適用于檢測樣本個數(shù)為4位數(shù)以上的大批量樣本，可以極大地縮短檢測所有樣本的總 時間。本發(fā)明對解決植物大量樣本的基因型檢測具有重要的市場價值。
【附圖說明】
[0023] 圖1為SSR分子標(biāo)記ND74六次點樣聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果圖，圖中從左及 右，共64條泳道，A為第一次點樣的電泳結(jié)果，從左及右分別為綜3 (B)、衡白522 (A)的擴增 結(jié)果和編號為1-62的樣本；
[0024] B為第二次點樣的電泳結(jié)果，從左及右為綜3(B)、衡白522(A)的擴增結(jié)果和編號 為63-124的樣本；
[0025] C為第三次點樣的電泳結(jié)果，從左及右為綜3(B)、衡白522(A)的擴增結(jié)果和編號 為125-186的樣本；
[0026] D為第四次點樣的電泳結(jié)果，從左及右為綜3(B)、衡白522(A)的擴增結(jié)果和編號 為187-248的樣本；
[0027] E為第五次點樣的