專(zhuān)利名稱(chēng)：衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP、其合成方法及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP、其合成方法及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是單細(xì)胞、帶鞭毛的真核生物，隸屬于綠藻門(mén)團(tuán)藻目衣藻屬(Chlamydomonas)。衣藻的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，原生質(zhì)膜緊貼著細(xì)胞壁，頂端長(zhǎng)有兩根鞭毛，側(cè)面具有一個(gè)眼點(diǎn)，多數(shù)細(xì)胞還有一個(gè)或多個(gè)液泡，一個(gè)占細(xì)胞總體積近40％的大型杯狀葉綠體。衣藻因其培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)迅速、光合效率高而具有“光合酵母”之稱(chēng)。其生物學(xué)特性為在短時(shí)間內(nèi)獲得大量遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因后代，并進(jìn)行遺傳學(xué)分析提供了便利條件。已經(jīng)成為研究植物光合作用、鞭毛組裝與功能、細(xì)胞周期及節(jié)律、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)與光感受、細(xì)胞識(shí)別等重要生物學(xué)過(guò)程的模式生物體。
現(xiàn)在在對(duì)衣藻細(xì)胞學(xué)定位的研究中用的比較多的熒光標(biāo)記是綠色熒光蛋白GFP，它是存在于水母Aequorea Victoria中的一種238個(gè)氨基酸殘基的單體蛋白質(zhì)，其作為報(bào)告基因已被廣泛用于檢測(cè)特異組織基因表達(dá)和細(xì)胞中蛋白質(zhì)的定位，被稱(chēng)為“有生命”的熒光。近來(lái)紅色熒光蛋白R(shí)FP正在作為一種新型的熒光報(bào)告基因逐漸受到重視。RFP最早是Matz等人報(bào)道珊瑚動(dòng)物能提供各種類(lèi)似GFP的熒光蛋白，并開(kāi)展了一系列的紅色熒光蛋白等色蛋白的研究工作，發(fā)現(xiàn)了一些有應(yīng)用價(jià)值的紅色熒光蛋白。與GRP相比，RFP具有較高的熒光量子產(chǎn)量，較強(qiáng)的抵御光漂白的能力，可忽視的pH敏感性，pH范圍4.5～12，而所有明亮的GFP突變體比RFP更容易在酸性條件下猝滅。目前對(duì)珊瑚和海葵紅熒光蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究已獲得重要進(jìn)展，主要集中于對(duì)DsRed的研究。在探明DsRed結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，針對(duì)野生型DsRed存在生色團(tuán)成熟慢和溶解性差的缺陷，用隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了DsRed的單聚體mRFP6，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為583nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為607nm。這種單體突變種不僅成熟時(shí)間比野生型快10～15倍，而且其結(jié)構(gòu)小，更容易與靶蛋白進(jìn)行融合，且不會(huì)影響目標(biāo)蛋白的定位和功能。目前，mRFP多見(jiàn)于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)，但是還未有在衣藻中成功表達(dá)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一個(gè)在衣藻中高效表達(dá)的紅色熒光蛋白基因CrmRFP。
本發(fā)明的目的之二在于提供上述紅色熒光蛋白基因CrmRFP的合成方法。
本發(fā)明的目的之三在于提供上述紅色熒光蛋白基因CrmRFP的真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP，其特征在于該基因具有SEQ NO 23所示的核苷酸序列序列。
一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP的合成方法，其特征在于該方法具有如下步驟a)比對(duì)衣藻密碼子使用頻率表，找出紅色熒光蛋白mRFP衣藻使用頻率較低的八個(gè)密碼子，通過(guò)同義突變，使用頻率較高的密碼子把這八個(gè)使用頻率較低的密碼子替換掉；b)根據(jù)上述的八個(gè)使用頻率較高的密碼子設(shè)計(jì)引物，所述引物為

C.借助重疊延伸法，通過(guò)五輪15次PCR反應(yīng)得到改造之后的全長(zhǎng)mRFP，命名為CrmRFP，具體反應(yīng)順序?yàn)榈谝惠喴栽假|(zhì)粒pSETbmRFP為模板 第一輪8個(gè)PCR反應(yīng)分別得到203bp、81bp、177bp、63bp、66bp、60bp、122bp以及57bp的目的片斷?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。
第二輪(9)以反應(yīng)(2)和反應(yīng)(3)的目的片斷為模板 (10)以反應(yīng)(5)和反應(yīng)(6)的目的片斷為模板 (11)以反應(yīng)(7)和反應(yīng)(8)的目的片斷為模板
第二輪3個(gè)PCR反應(yīng)分別得到238bp、106bp以及159bp的目的片斷?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。
第三輪(12)以反應(yīng)(1)和反應(yīng)(9)的目的片斷為模板 (13)以反應(yīng)(4)和反應(yīng)(10)的目的片斷為模板 第三輪2個(gè)PCR反應(yīng)分別得到421bp以及149bp的目的片斷。回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
第四輪(14)以反應(yīng)(11)和反應(yīng)(13)的目的片斷為模板 第四輪1個(gè)PCR反應(yīng)得到308bp的目的片斷?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。
第五輪(15)以反應(yīng)(12)和反應(yīng)(14)的目的片斷為模板 第五輪1個(gè)PCR反應(yīng)得到709bp的改造之后的全長(zhǎng)CrmRFP片段，并在其5’端加上了BamHI酶切位點(diǎn)，3’端加上了EcoRI酶切位點(diǎn)，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP的真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于該方法是a.設(shè)計(jì)引物，從質(zhì)粒pKL25上擴(kuò)增出一段含有RBCS2啟動(dòng)子、抗zeocin基因Ble以及核定位信號(hào)肽的BleNu片段，并在其5’加上酶切位點(diǎn)HindIII，3’加上酶切位點(diǎn)EcoRI和KpnI；上游引物5’CCCAAGCTTGCCAGAAGGAGCGCAGCCAA 3’下游引物5’CGGGGTACCCCGCCGGAATTCCGCGGCCCTCGATGCCG 3’b.回收純化RBCBleNu片段，用HindIII和KpnI酶切后與同樣用HindIII和KpnI酶切回收的pKL25載體連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pbleNu；c.設(shè)計(jì)引物，從質(zhì)粒pSETbCrmRFP上擴(kuò)增出CrmRFP片段，5’端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端加上NotI和KpnI酶切位點(diǎn)
上游引物5’CCGGAATTCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3’下游引物5’CGGGGTACCATAAGAATGCGGCCGCGGCGCCGGTGGAGTGGC 3’d.回收純化CrmRFP片段，用EcoRI和KpnI雙酶切，插入質(zhì)粒pbleNu的EcoRI/KpnI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pbleNuCrmRFP。
衣藻有較強(qiáng)的密碼子使用偏好性，外源DNA轉(zhuǎn)入衣藻后往往不表達(dá)或表達(dá)很弱，不適合的密碼子會(huì)使mRNA在加工過(guò)程中被錯(cuò)誤的剪切與拼接。本發(fā)明把未經(jīng)改造的原有mRFP轉(zhuǎn)入衣藻后，沒(méi)能檢測(cè)到紅色熒光。比對(duì)了衣藻密碼子使用頻率表(www.bio.net/bionet/mm/chlamy/1993-September/000063.html)，發(fā)現(xiàn)原有mRFP的某些密碼在衣藻中使用頻率很低。據(jù)此，本發(fā)明對(duì)紅色熒光蛋白mRFP基因中衣藻使用頻率偏低的八個(gè)密碼子進(jìn)行了修改，從而實(shí)現(xiàn)了mRFP在衣藻中的成功高效表達(dá)。本發(fā)明為衣藻的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究提供了另外一個(gè)重要的熒光蛋白標(biāo)記。同時(shí)，為在衣藻中同時(shí)使用雙(多)色熒光標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。


圖1為mRFP密碼改造示意圖，其中，I～V一～五輪PCR反應(yīng)，(1)～(15)1～15次PCR反應(yīng)圖2為mRFP在E.col中表達(dá)情況圖3為衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP在E.col中的表達(dá)情況圖4為衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因轉(zhuǎn)化載體pRBCbleNumRFP的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖5為重組質(zhì)粒pRBCbleNuCrmRFP的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6為衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因轉(zhuǎn)化子PCR鑒定，Mmarker，1空白水對(duì)照，2質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，3野生型cc124對(duì)照，4mRFP轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)，5CrmRFP轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)圖7為衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因轉(zhuǎn)化子RT-PCR鑒定，Mmarker，1mRFP轉(zhuǎn)化子RT-PCR檢測(cè)，2CrmRFP轉(zhuǎn)化子RT-PCR檢測(cè)，3空白水對(duì)照，4質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D8為mRFP在衣藻中的表達(dá)情況，帶有核定位信號(hào)肽的mRFP在衣藻細(xì)胞核里看不到熒光，只有葉綠體發(fā)出的自發(fā)熒光 圖9為衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP在衣藻中的表達(dá)情況，帶有核定位信號(hào)肽的CrmRFP在衣藻細(xì)胞核里發(fā)出紅色熒光(→)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP的合成
1.比對(duì)衣藻密碼子使用頻率表，找出紅色熒光蛋白mRFP衣藻使用頻率較低的八個(gè)密碼子，通過(guò)同義突變，使用頻率較高的密碼子把這八個(gè)使用頻率較低的密碼子替換掉，參見(jiàn)表1。
表1需修改的mRFP密碼子表

2. 根據(jù)這八個(gè)使用頻率較高的密碼子設(shè)計(jì)引物，參見(jiàn)表2表2引物列表

3.借助重疊延伸法，通過(guò)五輪15次PCR反應(yīng)得到改造之后的全長(zhǎng)mRFP，命名為CrmRFP，具體反應(yīng)順序?yàn)閰⒁?jiàn)圖1第一輪以原始質(zhì)粒pSETbmRFP為模板 第一輪8個(gè)PCR反應(yīng)分別得到203bp、81bp、177bp、63bp、66bp、60bp、122bp以及57bp的目的片斷?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。
第二輪(9)以反應(yīng)(2)和反應(yīng)(3)的目的片斷為模板 (10)以反應(yīng)(5)和反應(yīng)(6)的目的片斷為模板 (11)以反應(yīng)(7)和反應(yīng)(8)的目的片斷為模板
第二輪3個(gè)PCR反應(yīng)分別得到238bp、106bp以及159bp的目的片斷?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。
第三輪(12)以反應(yīng)(1)和反應(yīng)(9)的目的片斷為模板 (13)以反應(yīng)(4)和反應(yīng)(10)的目的片斷為模板 第三輪2個(gè)PCR反應(yīng)分別得到421bp以及149bp的目的片斷。回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
第四輪(14)以反應(yīng)(11)和反應(yīng)(13)的目的片斷為模板 第四輪1個(gè)PCR反應(yīng)得到308bp的目的片斷?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。
第五輪(15)以反應(yīng)(12)和反應(yīng)(14)的目的片斷為模板 第五輪1個(gè)PCR反應(yīng)得到709bp的改造之后的全長(zhǎng)CrmRFP片段，并在其5’端加上了BamHI酶切位點(diǎn)，3’端加上了EcoRI酶切位點(diǎn)。回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)測(cè)序核苷酸序列正確。
實(shí)例二構(gòu)建原核表達(dá)載體pSETbCrmRFP將CrmRFP片段用EcoRI和BamHI上酶切，插入原核表達(dá)載體pSETb，構(gòu)成重組質(zhì)粒pSETbCrmRFP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)mrfp的八個(gè)密碼子被修改后，在大腸桿菌中不能有效表達(dá)。參見(jiàn)圖3
實(shí)例三構(gòu)建含有核定位信號(hào)肽的CrmRFP真核表達(dá)載體pRBCbleNuCrmRFP及其負(fù)對(duì)照pRBCbleNumRFP的結(jié)構(gòu)示意圖，參見(jiàn)圖3、圖4。載體構(gòu)建具體步驟如下1.設(shè)計(jì)引物，從質(zhì)粒pKL25上擴(kuò)增出一段含有RBCS2啟動(dòng)子、抗zeocin基因Ble以及核定位信號(hào)肽的BleNu片段，并在其5’加上酶切位點(diǎn)HindIII，3’加上酶切位點(diǎn)EcoRI和KpnI。
上游引物5’CCCAAGCTTGCCAGAAGGAGCGCAGCCAA 3’下游引物5’CGGGGTACCCCGCCGGAATTCCGCGGCCCTCGATGCCG 3’2.回收純化RBCBleNu片段，用HindIII和KpnI酶切后與同樣用HindIII和KpnI酶切回收的pKL25載體連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pbleNu。
3.設(shè)計(jì)引物，從質(zhì)粒pSETbCrmRFP上擴(kuò)增出CrmRFP片段，5’端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端加上NotI和KpnI酶切位點(diǎn)上游引物5’CCGGAATTCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3’下游引物5’CGGGGTACCATAAGAATGCGGCCGCGGCGCCGGTGGAGTGGC 3’回收純化CrmRFP片段，用EcoRI和KpnI雙酶切，插入質(zhì)粒pbleNu的EcoRI/KpnI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pbleNuCrmRFP。
4.用NotI和KpnI對(duì)重組質(zhì)粒pbleNuCrmRFP進(jìn)行雙酶切，與同樣用NotI和KpnI酶切pKL25得到的含有RBCS2終止子的小片段相連，得到pRBCbleNuCrmRFP。
5.設(shè)計(jì)引物，從mRFP原始載體pSETbmRFP上擴(kuò)增出mRFP，并在其5’端加上酶切位點(diǎn)EcoRI，3’加上酶切位點(diǎn)NotI。
上游引物5’CCGGAATTCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3’下游引物5’ATAAGAATGCGGCCGCGGCGCCGGTGGAGTGGC 3’6.回收純化mRFP片段，用EcoRI和NotI雙酶切，替換掉pRBCbleNuCrmRFP上的CrmRFP，得到重組質(zhì)粒pRBCbleNumRFP，作為本實(shí)驗(yàn)的負(fù)對(duì)照。
實(shí)例四電擊轉(zhuǎn)化野生型衣藻cc124，顯微鏡觀察1.電擊轉(zhuǎn)化野生型衣藻cc124收集細(xì)胞，終濃度約為108個(gè)/ml.加入終濃度5ug/ml用Kpn I線性化的質(zhì)粒和200ug/ml的鮭精DNA，混合均勻，電擊。電擊后樣品用30ml液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞涂布于含2μg/ml zeocin的TAP培養(yǎng)基平板上，二周后，平板上長(zhǎng)出抗性轉(zhuǎn)化藻株單藻落。
2.PCR檢測(cè)提取約50ng衣藻轉(zhuǎn)化藻株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物為3Leu(+)和7Val(-)。PCR檢測(cè)圖，參見(jiàn)圖5可以說(shuō)明質(zhì)粒pRBCbleNuCrmRFP及負(fù)對(duì)照pRBCbleNumRFP已成功轉(zhuǎn)入衣藻細(xì)胞。
3.RT-PCR檢測(cè)提取適量的總RNA，除去DNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取1ul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物為3 Leu(+)和7Val(-)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，參見(jiàn)圖6、圖7顯示CrmRFP以及mRFP都已轉(zhuǎn)錄。
4.顯微鏡觀察將轉(zhuǎn)化子置于激光共聚焦顯微鏡LSM 5 PASCAL ZEISS(ex583nm；em607nm)下觀察，轉(zhuǎn)有CrmRFP的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中，大部分細(xì)胞紅色熒光都清晰可見(jiàn)。核定位信號(hào)肽將CrmRFP帶到了衣藻細(xì)胞核里，在細(xì)胞的前端靠近鞭毛基部的地方發(fā)出紅色熒光參見(jiàn)圖9。而帶有核定位信號(hào)肽的負(fù)對(duì)照mRFP在同樣的位置則看不到有紅色熒光，只有呈杯狀的葉綠體發(fā)出的自發(fā)熒光，參見(jiàn)圖8。
因此，本發(fā)明通過(guò)對(duì)紅色熒光蛋白mRFP基因中衣藻使用頻率偏低的八個(gè)密碼子的改造，從而實(shí)現(xiàn)了mRFP在衣藻中的成功高效表達(dá)。為進(jìn)一步研究衣藻蛋白質(zhì)定位、移動(dòng)及相互關(guān)系提供了又一種熒光標(biāo)記，為實(shí)現(xiàn)衣藻多熒光同時(shí)標(biāo)記提供可能。
序列表<110>上海大學(xué)<120>衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP、其合成方法及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
<160>23<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1
CGCGGATCCA TGGCCTCCTC CGAGGACGTG ATCAAGGAG 39<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2ATCCTGTCCC CCCAGTTCCA GT 22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3CTGGAACTGG GGGGACAGGA T 21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4CCCCGACTAC CTGAAGCTGT CC 22<210>5
<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5GGACAGCTTC AGGTAGTCGG GG 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6GACGGCCCCG TGATGCAGAA GA 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7TCTTCTGCAT CACGGGGCCG TC 22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8TCCACCGAGC GCATGTACCC CG 22<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9CGGGGTACAT GCGCTCGGTG GA 22<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10GATCAAGATG CGCCTGAAGCT GA23<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11TCAGCTTCAG GCGCATCTTG ATC23
<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12GACGCCGAGG TGAAGACCAC CT 22<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>13AGGTGGTCTT CACCTCGGCG TC 22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>14ACCATCGTGG AGCAGTACGA GC 22<210>15
<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>15GCTCGTACTG CTCCACGATG GT 22<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>16CCGGAATTCT TAGGCGCCGG TGGAGTGG 28<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>17CCCAAGCTTGCCAGAAGGA GCGCAGCCAA 31<210>18<211>29<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>18CGGGGTACCC CGCCGGAATT CCGCGGCCC TCGATGCCG29<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>19CCGGAATTCA TGGCCTCCTC CGAGGACGT29<210>20<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>20CGGGGTACCA TAAGAATGCG GCCGCGGCGC CGGTGGAGTG GC 42<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>21CCGGAATTCA TGGCCTCCTC CGAGGACGT 29<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>22ATAAGAATGC GGCCGCGGCG CCGGTGGAGT GGC 23<210>23<211>678<212>DNA<213>萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)<220>
<221>
<222>
<400>231 ATGGCCTCCT CCGAGGACGT GATCAAGGAG TTCATGCGCT TCAAGGTGCG51 CATGGAGGGC TCCGTGAACG GCCACGAGTT CGAGATCGAG GGCGAGGGCG101 AGGGCCGCCC CTACGAGGGC ACCCAGACCG CCAAGCTGAA GGTGACCAAG151 GGCGGCCCCC TGCCCTTCGC CTGGGACATC CTGTCCCCCC AGTTCCAGTA201 CGGCTCCAAG GCCTACGTGA AGCACCCCGC CGACATCCCC GACTACCTGA251 AGCTGTCCTT CCCCGAGGGC TTCAAGTGGG AGCGCGTGAT GAACTTCGAG301 GACGGCGGCG TGGTGACCGT GACCCAGGAC TCCTCCCTGC AGGACGGCGA351 GTTCATCTAC AAGGTGAAGC TGCGCGGCAC CAACTTCCCC TCCGACGGCC401 CCGTGATGCA GAAGAAGACC ATGGGCTGGG AGGCCTCCAC CGAGCGCATG451 TACCCCGAGG ACGGCGCCCT GAAGGGCGAG ATCAAGATGC GCCTGAAGCT501 GAAGGACGGC GGCCACTACG ACGCCGAGGT GAAGACCACC TACATGGCCA551 AGAAGCCCGT GCAGCTGCCC GGCGCCTACA AGACCGACAT CAAGCTGGAC601 ATCACCTCCC ACAACGAGGA CTACACCATC GTGGAGCAGT ACGAGCGCGC651 CGAGGGCCGC CACTCCACCG GCGCCTAA
權(quán)利要求
1.一種衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP，其特征在于該基因具有SEQ NO 23所示的核苷酸序列序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP的合成方法，其特征在于該方法具有如下步驟a.比對(duì)衣藻密碼子使用頻率表，找出紅色熒光蛋白mRFP衣藻使用頻率較低的八個(gè)密碼子，通過(guò)同義突變，使用頻率較高的密碼子把這八個(gè)使用頻率較低的密碼子替換掉；b.根據(jù)上述的八個(gè)使用頻率較高的密碼子設(shè)計(jì)引物，所述引物為
`C.借助重疊延伸法，通過(guò)五輪15次PCR反應(yīng)得到改造之后的全長(zhǎng)mRFP，命名為CrmRFP，具體反應(yīng)順序?yàn)榈谝惠喴栽假|(zhì)粒pSETbmRFP為模板(1)
(2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 第一輪8個(gè)PCR反應(yīng)分別得到203bp、81bp、177bp、63bp、66bp、60bp、122bp以及57bp的目的片斷。回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。第二輪(9)以反應(yīng)(2)和反應(yīng)(3)的目的片斷為模板 (10)以反應(yīng)(5)和反應(yīng)(6)的目的片斷為模板 (11)以反應(yīng)(7)和反應(yīng)(8)的目的片斷為模板 第二輪3個(gè)PCR反應(yīng)分別得到238bp、106bp以及159bp的目的片斷?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。第三輪(12)以反應(yīng)(1)和反應(yīng)(9)的目的片斷為模板 (13)以反應(yīng)(4)和反應(yīng)(10)的目的片斷為模板 第三輪2個(gè)PCR反應(yīng)分別得到421bp以及149bp的目的片斷?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。第四輪(14)以反應(yīng)(11)和反應(yīng)(13)的目的片斷為模板 第四輪1個(gè)PCR反應(yīng)得到308bp的目的片斷。回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。第五輪(15)以反應(yīng)(12)和反應(yīng)(14)的目的片斷為模板 第五輪1個(gè)PCR反應(yīng)得到709bp的改造之后的全長(zhǎng)CrmRFP片段，并在其5’端加上了BamHI酶切位點(diǎn)，3’端加上了EcoRI酶切位點(diǎn)，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP的真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于該方法是a.設(shè)計(jì)引物，從質(zhì)粒pKL25上擴(kuò)增出一段含有RBCS2啟動(dòng)子、抗zeocin基因Ble以及核定位信號(hào)肽的BleNu片段，并在其5’加上酶切位點(diǎn)HindIII，3’加上酶切位點(diǎn)EcoRI和KpnI；上游引物5’CCCAAGCTTGCCAGAAGGAGCGCAGCCAA 3’下游引物5’CGGGGTACCCCGCCGGAATTCCGCGGCCCTCGATGCCG 3’b.回收純化RBCBleNu片段，用HindIII和KpnI酶切后與同樣用HindIII和KpnI酶切回收的pKL25載體連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pbleNu；c.設(shè)計(jì)引物，從質(zhì)粒pSETbCrmRFP上擴(kuò)增出CrmRFP片段，5’端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端加上NotI和KpnI酶切位點(diǎn)上游引物5’CCGGAATTCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3’下游引物5’CGGGGTACCATAAGAATGCGGCCGCGGCGCCGGTGGAGTGGC 3’d.回收純化CrmRFP片段，用EcoRI和KpnI雙酶切，插入質(zhì)粒pbleNu的EcoRI/KpnI之間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pbleNuCrmRFP。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP、其合成方法及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的衣藻紅色熒光標(biāo)記蛋白基因CrmRFP具有SEQ NO23所示的核苷酸序列序列。其合成方法為比對(duì)衣藻密碼子使用頻率表，找出紅色熒光蛋白mRFP衣藻使用頻率較低的八個(gè)密碼子，通過(guò)同義突變，使用頻率較高的密碼子把這八個(gè)使用頻率較低的密碼子替換掉；根據(jù)上述的八個(gè)使用頻率較高的密碼子設(shè)計(jì)引物，借助重疊延伸法，通過(guò)五輪15次PCR反應(yīng)得到改造之后的全長(zhǎng)mRFP，命名為CrmRFP。本發(fā)明為衣藻的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究提供了另外一個(gè)重要的熒光蛋白標(biāo)記。同時(shí)，為在衣藻中同時(shí)使用雙(多)色熒光標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1844388SQ20061002620
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者宋任濤, 許政暟, 薛芳 申請(qǐng)人:上海大學(xué)