專利名稱：定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于測(cè)量供體一受體的相互作用及其能量共振轉(zhuǎn)移效率的測(cè)量方法?？勺鳛樯铩⑨t(yī)學(xué)、光學(xué)、物理、化學(xué)等學(xué)科類的科研與檢測(cè)。
長(zhǎng)期以來有一種需要，即如何定量測(cè)量供體受體間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率，達(dá)到定量監(jiān)測(cè)供體受體間的相互作用和構(gòu)形變化的目的。
目前，國(guó)內(nèi)尚還沒有該方面的研究。
國(guó)外已有定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法和專利。例如，美國(guó)專利No.762245，摩洛哥1991年9月19日申請(qǐng)；No.065585，日本1998年4月24日申請(qǐng)；No.684268，日本1996年7月17日申請(qǐng)。這些方法和專利或者不能完全消除串?dāng)_(Cros-talk)和濃度的影響，或者因要使用的濾光片和測(cè)量的數(shù)據(jù)太多，而不能滿足生物醫(yī)學(xué)研究的需要。利用測(cè)量熒光強(qiáng)度研究熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率時(shí)的主要問題有(1)供體發(fā)射譜與受體發(fā)射譜的串?dāng)_(Cross-talk)使實(shí)際測(cè)量時(shí)很難或不可能將它們分開；(2)熒光共振能量轉(zhuǎn)移成分與非熒光共振能量轉(zhuǎn)移成分混在一起；(3)供體和受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度與供體和受體的濃度有關(guān)，但是其定量關(guān)系卻很難確定。
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題和不足，提出的一種能快速定量檢測(cè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的測(cè)量方法。
本發(fā)明所說的定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，其適用條件為(1)供體和受體的發(fā)射譜形狀與熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率無關(guān)，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移只改變供體和受體熒光發(fā)射譜的強(qiáng)弱而不改變其形狀，或熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)供體發(fā)射譜形狀的影響很小以致可被忽略；(2)激發(fā)光源只選擇性地激發(fā)供體而不激發(fā)受體或者對(duì)受體激發(fā)較小以致可被忽略。
本發(fā)明所說的定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，利用對(duì)供體和受體兩個(gè)通道的有關(guān)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，并通過對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)的處理后而得出其熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率和供體受體間的距離。兩個(gè)通道性質(zhì)的要求(1)第一個(gè)通道(簡(jiǎn)稱CH1)必須包括部分或全部供體熒光發(fā)射譜；(2)第二個(gè)通道(簡(jiǎn)稱CH2)必須包括部分或全部受體熒光發(fā)射譜；(3)激發(fā)光不在兩個(gè)通道的光譜范圍；(4)兩個(gè)通道的探測(cè)譜范圍不能完全相同。
本發(fā)明中定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的通用公式為φAE1-E=Ratio•Kd1-Kd2Ka2-Ratio•Ka1---(a)]]>E=R06r6+R06---(b)]]>式中，E是熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，Ratio是兩個(gè)探測(cè)通道的熒光強(qiáng)度的比值，φA是受體的能量量子產(chǎn)生額，R0是Frster臨界距離，r是供體與受體之間的距離，Kd1和Kd2分別是兩個(gè)通道中供體發(fā)射熒光強(qiáng)度與供體發(fā)射的全部熒光強(qiáng)度的比值，Ka1和Ka2分別是兩個(gè)通道中受體發(fā)射熒光強(qiáng)度與受體發(fā)射的全部熒光強(qiáng)度的比值。Kd1,Kd2,Ka1和Ka2由供體發(fā)射譜spd(λ)和受體的發(fā)射譜spa(λ)及兩個(gè)通道的帶通性質(zhì)計(jì)算得到，而與樣品的構(gòu)形和動(dòng)態(tài)性質(zhì)無關(guān)。其計(jì)算公式為Kd1=∫CH1spd(λ)dλ∫-∞+∞spd(λ)dλ,Kd2=∫CH2spd(λ)dλ∫-∞+∞spd(λ)dλ,Ka1=∫CH1spa(λ)dλ∫-∞+∞spa(λ)dλ,Ka2=∫CH2spa(λ)dλ∫-∞+∞spa(λ)dλ]]>當(dāng)受體的能量量子產(chǎn)生額φA已知時(shí)，只要測(cè)量出Ratio，代入(a)式，既可計(jì)算得到熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E。
本發(fā)明所說的定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率方法的步驟為(1)根據(jù)供體受體的發(fā)射譜選擇適當(dāng)?shù)臑V光片，所說的濾光片應(yīng)滿足以上所說的兩個(gè)通道性質(zhì)的要求；(2)根據(jù)供體和受體的發(fā)射譜及選擇的濾光片計(jì)算得到系數(shù)Kd1,Kd2,Ka1和Ka2；(3)用激發(fā)光選擇性地激發(fā)供體；(4)測(cè)量?jī)蓚€(gè)通道的熒光強(qiáng)度，并由此計(jì)算得到第二通道與第一通道的熒光光強(qiáng)比值Ratio；(5)將Ratio代入公式(a)計(jì)算得到熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E；(6)將E代入公式(b)計(jì)算得到供體受體間的距離r。
本發(fā)明所說的定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法具有簡(jiǎn)單易行特點(diǎn)。只要對(duì)兩個(gè)通道中的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量，利用取得的數(shù)據(jù)即可計(jì)算出其熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率和供體、受體間的距離。
本發(fā)明的實(shí)施實(shí)例1．完整供體-受體對(duì)的實(shí)施實(shí)例選擇Cameleon(簡(jiǎn)稱“YC2.1”)供體-受體對(duì)，它的供體和受體連接在一起的，其供體(Cyan)和受體(Yellow)的發(fā)射譜見

圖1所示。Miyawaki用432納米的激發(fā)光在體外激發(fā)完整的YC2.1，并分別測(cè)量了在零鈣(-Ca2+)和飽和鈣(+Ca2+)情況下的熒光發(fā)射譜，如圖2所示。在圖2中，實(shí)線表示完整YC2.1在飽和鈣時(shí)的發(fā)射譜，而虛線表示完整YC2.1在零鈣時(shí)的發(fā)射譜，圖1中480DF30表示第一個(gè)通道，535DF25表示第二個(gè)通道。根據(jù)測(cè)量的供體-受體對(duì)的熒光發(fā)射譜sp(λ)可由下式得到Ratio。Ratio=∫CH2h1(λ)sp(λ)dλ∫CH1h2(λ)sp(λ)dλ---(c)]]>其中h1(λ)和h2(λ)分別表示第一個(gè)通道和第二個(gè)通道的帶通性質(zhì)。
對(duì)零鈣有Ratio=2.2358,Kd1=0.3589,Kd2=0.2540,Ka1=0.0027,Ka2=0.7341。Frster臨界距離R0取50，受體能量量子產(chǎn)生額φA取0.71，則由(a)式和(b)式計(jì)算得到常量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E=51.49％，供體與受體間的距離r=49.5083。
2．分離供體-受體對(duì)的實(shí)施實(shí)例供體和受體是兩個(gè)獨(dú)立的標(biāo)記物。分離的Cameleon(YC2.1)的結(jié)構(gòu)見圖3所示，供體ECFP與CaM結(jié)合在一起，受體EYFP-V68L/Q69K與M13結(jié)合在一起。Miyawaki測(cè)量了分離YC2.1在幾種不同CaM濃度時(shí)的熒光發(fā)射譜(見圖3)。按照本專利所說的方法計(jì)算了分離YC2.1的Ratio,E和r。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)通道帶通性質(zhì)是476/40，第二個(gè)通道帶通性質(zhì)是535/60時(shí)，計(jì)算結(jié)果為加入0μM的CaM時(shí)，比值Ratio、熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E及r分別為3.0721,59.01％和47.0537；加入1μM的CaM時(shí)，比值Ratio、熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E及r分別為1.6676,32.37％和56.5333；加入8μM的CaM時(shí)，比值Ratio、熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E及r分別為1.2031,14.02和67.6460；加入100mM的EGTA時(shí)，比值Ratio、熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E及r分別為1.14，10.7％和72.2。
權(quán)利要求
1.一種定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，利用對(duì)供體和受體兩個(gè)通道的有關(guān)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，并通過對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)的處理后而得出其熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率和供體受體間的距離；其特征在于，對(duì)兩個(gè)通道性質(zhì)要求(1)第一個(gè)通道必須包括部分或全部供體熒光發(fā)射譜；(2)第二個(gè)通道必須包括部分或全部受體熒光發(fā)射譜；(3)激發(fā)光不在兩個(gè)通道的光譜范圍；(4)兩個(gè)通道的探測(cè)譜范圍不能完全相同；所說的定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率方法的步驟為(1)根據(jù)供體和受體的發(fā)射譜選擇適當(dāng)?shù)臑V光片，所說的濾光片應(yīng)滿足以上所說的兩個(gè)通道性質(zhì)的要求；(2)根據(jù)供體和受體的發(fā)射譜以及選擇的濾光片計(jì)算得到系數(shù)Kd1,Kd2,Ka1和Ka2；(3)用激發(fā)光選擇性地激發(fā)供體；(4)測(cè)量?jī)蓚€(gè)通道的熒光強(qiáng)度，并由此計(jì)算得到第二通道與第一通道的熒光光強(qiáng)比值Ratio；(5)將Ratio代入公式(a)計(jì)算得到熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率E；(6)將E代入公式(b)計(jì)算得到供體受體間的距離r。
2.按照權(quán)利要求1所說的定量測(cè)量熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的方法，其特征在于，所說的計(jì)算公式(a)為φAE1-E=Ratio•Kd1-Kd2Ka2-Ratio•Ka1]]>。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種可作為生物、醫(yī)學(xué)、光學(xué)、物理、化學(xué)等學(xué)科類的科研與檢測(cè),測(cè)量供體－受體的相互作用及其能量共振轉(zhuǎn)移效率的測(cè)量方法。1)根據(jù)供體受體的發(fā)射譜選擇適當(dāng)?shù)臑V光片;2)根據(jù)供體受體的發(fā)射譜計(jì)算得到系數(shù)K
文檔編號(hào)G01N21/64GK1321883SQ00114550
公開日2001年11月14日 申請(qǐng)日期2000年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月28日
發(fā)明者曾紹群, 陳同生, 駱清銘 申請(qǐng)人:華中理工大學(xué)