專利名稱：一種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，具體是涉及一種21 號(hào)染色體倍性檢測(cè)的雙色熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)體外共擴(kuò)增PCR試劑盒，屬于分子生物學(xué) 檢測(cè)診斷領(lǐng)域。
技術(shù)背景唐氏綜合征(Down Syndrome, DS)，又稱為先天愚型，是活產(chǎn)胎兒中最常見的染色體 異常綜合征之一，其發(fā)病率約為1/600—1/800。 DS的體征非常多樣，通常涉及多種組織 器官的異常，但其最突出、最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)為精神發(fā)育遲滯。該病的主要臨床特征為 嚴(yán)重智力低下，且智力低下的表型隨年齡增長逐漸明顯，動(dòng)作發(fā)育和性發(fā)育遲緩，基本 無生活自理能力。具有獨(dú)特的面部和身體畸形、先天性心臟病、消化道畸形等，白血病 的發(fā)病率也比人群平均發(fā)病率高10—30倍。患者的平均壽命在30歲左右。DS絕大多數(shù)都是偶發(fā)的，每個(gè)孕婦都有生患兒的可能，發(fā)病無明顯的種族差異和家族 聚積現(xiàn)象。世界各地大量群體調(diào)查的結(jié)果表明種族之間發(fā)病率幾乎相同，唐氏綜合征的每 個(gè)體細(xì)胞中21號(hào)染色體為3條，而其它常染色體為2條，淋巴母細(xì)胞或羊水脫落細(xì)胞體 外培養(yǎng)和染色體制備觀察是其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的常規(guī)方法，該方法雖然準(zhǔn)確度高，但技'術(shù)復(fù)雜 耗時(shí)長，不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高通量檢測(cè)。由于唐氏綜合征患者21號(hào)染色體上的單拷貝基 因劑量是其它常染色體上的單拷貝基因劑量的1.5倍，而DSCR是唐氏綜合征發(fā)病的關(guān)鍵 單拷貝區(qū)段，因此可以選擇21號(hào)染色體上的單拷貝基因如DSCR1和常染色體上的單拷貝 基因如GAPDH基因，通過熒光定量PCR技術(shù)來檢測(cè)出它們的相對(duì)拷貝數(shù)的比值來判斷21 號(hào)染色體的倍性，從而能從微量DNA標(biāo)本中檢測(cè)出唐氏綜合征。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的能夠?qū)μ禺怐NA (基因)拷貝數(shù)進(jìn)行精確 定量的最先進(jìn)的基因劑量定量新技術(shù)。其基本原理是在PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入TaqMan 探針(特異寡核苷酸探針)，該探針的5 '端標(biāo)記了一條熒光報(bào)告基團(tuán)(R)， 3'端標(biāo)記了一
條熒光淬滅基團(tuán)(Q)。當(dāng)這條探針處于完整狀態(tài)或者沒有反應(yīng)時(shí)，R所產(chǎn)生的一部分熒光 將被Q吸收或淬滅。在PCR反應(yīng)過程中，該探針可與PCR目標(biāo)基因特異性雜交，然后被Taq DNA聚合酶的5'外切活性降解，使R和Q分離，游離的R發(fā)出熒光信號(hào)被檢測(cè)。隨著PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，游離的R與PCR產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的增加。因此，根據(jù)每個(gè)循環(huán)后R產(chǎn)生的熒光信 號(hào)的強(qiáng)度，即可實(shí)時(shí)測(cè)量出PCR反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量。如果同時(shí)使用拷貝數(shù)已知的DNA標(biāo)準(zhǔn)品 做標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可對(duì)所檢測(cè)的標(biāo)本的耙DNA做精確定量。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于建立一種操作簡(jiǎn)便，能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)唐氏綜合征患者的雙色熒光定 量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案是該種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒，含有擴(kuò)增21 號(hào)染色體特異單拷貝區(qū)段DSCR和16號(hào)染色體特異單拷貝區(qū)段GAPDH體外擴(kuò)增的熒光定量 PCR試劑，其特征在于，首先根據(jù)21號(hào)染色體特異DSCR區(qū)段序列和16號(hào)染色體上的GAPDH 基因序列分別合成其特異引物和雙色Taqroan熒光探針，然后將0.1-0. 5咖ol/L DSCR和 GAPDH特異的引物、雙色熒光Taqman探針加入同一個(gè)PCR擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系中，在多色實(shí) 時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行96。C預(yù)變性2 min后，再94。C變性10 sec， 52—56。C復(fù)性30 sec，60-7(TC延伸40sec，共45個(gè)循環(huán)，并在延伸時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，使兩對(duì)引物分別同時(shí) 引導(dǎo)新鏈合成，實(shí)現(xiàn)兩對(duì)引物的共擴(kuò)增和其拷貝數(shù)的定量檢測(cè)。上述DSCR和GAPDH特異引物和雙色Taqman熒光探針，其特征在于，其序列分別為 DSCR上游引物5， -CAGAAATCCCAGTTC ATGTTGCT-3， ; DSCR下游引物5， -CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT-3, ; DSCR TaqMan探針5， -[FAM]CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC[TAMRA]-3， ; GAPDH上游引物5， -etc cct ctt tct ttg cag caa t-3， ; GAPDH下 游引物5， 一cag etc tea tac cat gag tec t—3， ； GAPDH TaqMan探針5， —[HE幻ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA]-3，。所用擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系，其特征在于，是由引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、 模板DNA、 Mg++、 PCR反應(yīng)緩沖液、超純水等組成的，各個(gè)成分的濃度含量分別如下DSCR 和GAPDH特異的引物、雙色熒光Taqman探針各0.1-0. 5umol/L、Taq DNA聚合酶1-3U/50ul、 dNTPs底物0. 1-0. 5腦ol/L、模板DNA若干、\^++1. 5-3. 5 mmol/L、反應(yīng)緩沖液0. 5-1. 5XPCR， 其中1XPCR反應(yīng)緩沖液包括50咖ol/L KC1、 10 mmol/L Tris.HCl PH8. 3、 0.01%明膠。該種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒實(shí)現(xiàn)兩對(duì)引物的共擴(kuò)增的同時(shí)通過檢 測(cè)擴(kuò)增過程中由于降解Taqrnan探針獲得的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，獲得各自的擴(kuò)增曲線圖，進(jìn) 而得出各個(gè)基因的Ct值。根據(jù)樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用以下公式計(jì)算分別計(jì)算DSCR 區(qū)段序列和16號(hào)染色體上的GAPDH基因序列含量Nx = No * Y "° —"x;其中Nx為樣 本x的靶基因的起始拷貝數(shù)，Y為擴(kuò)增效率，相當(dāng)于Ct值減少1個(gè)循環(huán)對(duì)應(yīng)的模板DNA的 增加的倍數(shù)，由公式Y(jié)40"" (ACt ^靶DNA每稀釋10倍，平均增加的Ct值數(shù))計(jì)算獲得；CtX為擴(kuò)增管X的靶基因的Ct值；CtO為標(biāo)準(zhǔn)曲線上靶基因拷貝數(shù)為No時(shí)的Ct值；No為起始拷貝數(shù)。根據(jù)以下公式計(jì)算二者的比值R: R= Nd/ Ng,其中Nd為DSCR拷貝數(shù)， Ng為GAPDH拷貝數(shù)；最后根據(jù)二者的比值R判斷21號(hào)染色體的倍性。該種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒與其它檢測(cè)21號(hào)染色體倍性的方法相 比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、操作簡(jiǎn)便快速,可以在2-3小時(shí)內(nèi)獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果；2、閉管 檢測(cè)，不會(huì)造成擴(kuò)增產(chǎn)物污染；3、自動(dòng)化程度高，人工成本低，還可以高通量檢測(cè)，每次可 以檢測(cè)90個(gè)以上標(biāo)本；4、需要的檢測(cè)樣本材料微量,每個(gè)反應(yīng)僅需要待檢DNA 50-100 ng， 便于取材。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:1.引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列設(shè)計(jì)DSCR的引物如下 上游弓I物DSCRF: 5 ， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 ，； 下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，； TaqMan探針DSCRTM: 5, - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 擴(kuò)增產(chǎn)物96bp,在基因中的位置如下cacgcgacga ggacgcattc caaatcatac tcacgggagg aatcttttac 34812197 tgtggaggtg gctggtcacg acttcttcgg aggtggcagc cgagatcggg 34812147 gtggc|agaa￡t tcccagttca tgttgct|cag aagagaat|ca aggccgtgtc(:(.'c"gUet aatgctgcac accagttact gttcatggca cccgggaatg34812097 34812047根據(jù)genebank中[gi: 32891804]設(shè)計(jì)內(nèi)對(duì)照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，； 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HEX] ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 擴(kuò)增產(chǎn)物112bp，在基因中的位置如下gggtgtgaac catgagaagt atgacaacag cctcaagatc atcaggtgag 6516648 ga鄉(xiāng)caggg cccgtggaga agcggccagc ctggcaccct atggacacgc 6516698tcccctgact tgcgccccgc tccctctttc tttgcagcaa tgcctc|ctgc| 6516748buiiccaat'L gcttagcacc cctggccaag gtcatccatg acaactttgg 6516798tatcgtgga]a ggactcatgg tatgagagct g!gggaatggg actgaggctc 65168482. 雙色熒光定量PCR反應(yīng)混合50 ul反應(yīng)體系，內(nèi)含兩引物各10 pmol，各探針10 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， IX PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2u， Mg+十終濃度2鵬ol/L，然后在FTC2000實(shí)時(shí)熒 光定量PCR儀上96。C下預(yù)變性2 min，然后94。C變性10 sec, 52。C復(fù)性30 see, 60。C延伸 40 sec，共45個(gè)循環(huán)，并在60。C延伸時(shí)照相。每一個(gè)標(biāo)本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。3. 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以比較和得出兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率。4. 結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 85±0. 27，而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1. 06±0.176，用2—M"方法計(jì)算換成拷貝數(shù)的差異約為1/1. 58 1. 43，兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)施例2:1. 引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列設(shè)計(jì)DSCR的引物如下 上游引物DSCRF:5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3'; 下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，； TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根據(jù)genebank中[gi: 32891804]設(shè)計(jì)內(nèi)對(duì)照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下:上游弓l物GAPDF:5， _ctccctctttctttgcagcaat_3，； 下游弓I物GAPDR:5， -cagctctc由ccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 引物探針和擴(kuò)增產(chǎn)物在基因中的位置同實(shí)施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應(yīng)混合50 ul反應(yīng)體系，內(nèi)含兩引物各15 pmol，各探針15 pmol,患者或正常人DNA 50-100 ng， IX PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg++終濃度3 mmol/L，然后在FTC2000實(shí)時(shí)熒 光定量PCR儀上96。C下預(yù)變性2 min,然后94。C變性10 sec, 56。C復(fù)性30 sec， 6(TC延伸 40.sec，共45個(gè)循環(huán)，并在60。C延伸時(shí)照相。每一個(gè)標(biāo)本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。3. 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以比較和得出兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率。4. 結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 88±0. 29，而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1. 16±0. 17，用2-AA"方法計(jì)算換成拷貝數(shù)的差異約為1/1. 61 1. 53， 兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)施例31.引物和探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列設(shè)計(jì)DSCR的引物如下
上游引物DSCRF:5， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3，； 下游引物DSCRR: 5 ， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 ，； TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根據(jù)genebank中[gi: 32891804]設(shè)計(jì)內(nèi)對(duì)照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，； 下游弓(物GAPDR:5' -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3,; 引物探針和擴(kuò)增產(chǎn)物在基因中的位置同實(shí)施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應(yīng)混合50 ul反應(yīng)體系，內(nèi)含兩引物各15 pmol，各探針15 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1 X PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2 u'， Mg+十終濃度3 mmol/L,然后在FTC2000實(shí)時(shí) 熒光定量PCR儀上96'C下預(yù)變性2 min，然后94。C變性10 sec， 53。C復(fù)性30 sec， 60。C延 伸40 sec，共45個(gè)循環(huán)，并在60'C延伸時(shí)照相。每一個(gè)標(biāo)本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。3. 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以比較和得出兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率。4. 結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明唐氏綜合征患者的GATOH與DSCR1的差值為1. 78±0. 27,而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1. 05±0. 25，用2—^"方法計(jì)算換成拷貝數(shù)的差異約為1/1. 51 1. 43, 兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)施例41.引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)genebank中DSCR1 [gi:7768679]的序列設(shè)計(jì)DSCR的引物如下上游引物DSCRF:5' -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3，；下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，；TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CMGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，； 根據(jù)genebank中[gi: 32891804]設(shè)計(jì)內(nèi)對(duì)照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的弓l物如下上游弓i物GAPDF:5' -ctccctctttctttgcagcaat-3'; 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，； 引物探針和擴(kuò)增產(chǎn)物在基因中的位置同實(shí)施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應(yīng)混合50 ul反應(yīng)體系，內(nèi)含兩引物各15 pmol，各探針15 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1.5 X PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg+十終濃度3 mmol/L,然后在FTC2000實(shí) 時(shí)熒光定量PCR儀上96。C下預(yù)變性2 min，然后94。C變性10 sec， 53。C復(fù)性30 sec, 60。C 延伸40 sec,共45個(gè)循環(huán)，并在6(TC延伸時(shí)照相。每一個(gè)標(biāo)本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。3. 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以比較和得出兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率。4. 結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 69±0.15，而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1.02±0. 12，用2—A^方法計(jì)算換成拷貝數(shù)的差異約為l/1.53: 1.46， 兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)施例51.引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)genebank中DSCR1 [gi: 7768679]的序列設(shè)計(jì)DSCR的引物如下上游引物DSCRF: 5 ， -CAGAAATCCCAGTTCATGTTGCT-3 ，；下游引物DSCRR:5， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3，；TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，；根據(jù)genebank中[gi: 32891804]設(shè)計(jì)內(nèi)對(duì)照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下上游弓l物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3'; 下游弓l物GAPDR:5， -cagctctcataccatgagtcct-3，； TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3'; 引物探針和擴(kuò)增產(chǎn)物在基因中的位置同實(shí)施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應(yīng)混合50 ul反應(yīng)體系，內(nèi)含兩引物各25 pmol，各探針25 pmol,患者或正常人DNA 50-100 ng, 1 X PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶2 u， Mg十+終濃度2. 5咖ol/L,然后在FTC2000實(shí) 時(shí)熒光定量PCR儀上96'C下預(yù)變性2 min，然后94。C變性10 sec, 53。C復(fù)性30 see, 60。C 延伸40 sec，共45個(gè)循環(huán)，并在6(TC延伸時(shí)照相。每一個(gè)標(biāo)本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。3. 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以比較和得出兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率。4. 結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 85±0. 22,而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1. 24±0. 32，用2_^"方法計(jì)算換成拷貝數(shù)的差異約為1/1. 55: 1. 48，兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)施例61.引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)genebank中DSCR1 [gi :7768679]的序列設(shè)計(jì)DSCR的引物如下-上游引物DSCRF:5， -CAGMATCCCAGTTCATGTTGCT-3，；下游引物DSCRR: 5 ， -CATTCCCGGGTGCCATGAACAGT-3 ，；TaqMan探針DSCRTM: 5 ， - [FAM] CAAGGCCGTGTCCCCTTGTTC [TAMRA] -3 ，；根據(jù)genebank中[gi: 32891804]設(shè)計(jì)內(nèi)對(duì)照GAPDH [ glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油醛脫氫酶]的引物如下上游引物GAPDF:5， -ctccctctttctttgcagcaat-3，；
下游弓l物GAPDR:5' -cagctctcataccatgagtcct-3'; TaqMan探針GAPDTM:5， -[HE幻ctgcaccaccaactgcttagc [TAMRA]-3，；引物探針和擴(kuò)增產(chǎn)物在基因中的位置同實(shí)施例1。2. 雙色熒光定量PCR反應(yīng)混合50 ul反應(yīng)體系，內(nèi)含兩引物各20 pmol,各探針20 pmol，患者或正常人DNA 50-100 ng， 1 X PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶1. 5 u， Mg十+終濃度2. 5 mmol/L，然后在FTC2000 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上96。C下預(yù)變性2 min，然后94。C變性10 sec， 56。C復(fù)性30 sec, 60 。C延伸40 sec，共45個(gè)循環(huán)，并在60'C延伸時(shí)照相。每一個(gè)標(biāo)本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。3. 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線將DNA模板10倍、100倍、1000倍、10000倍等比稀釋做DSCR1和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn) 曲線，以比較和得出兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率。4. 結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明唐氏綜合征患者的GAPDH與DSCR1的差值為1. 75±0. 28，而正常人的GAPDH 與DSCR1的差值為1, 15±0. 12，用2—A^方法計(jì)算換成拷貝數(shù)的差異約為l/1.65: 1.55, 兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
權(quán)利要求
1、一種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒，含有擴(kuò)增21號(hào)染色體特異單拷貝區(qū)段DSCR和16號(hào)染色體特異單拷貝區(qū)段GAPDH體外擴(kuò)增的熒光定量PCR試劑，其特征在于，首先根據(jù)21號(hào)染色體特異的DSCR區(qū)段序列和16號(hào)染色體上的GAPDH基因序列分別合成其特異引物和雙色Taqman熒光探針，然后將0.1-0.5umol/L DSCR和GAPDH特異的引物、雙色熒光Taqman探針加入同一個(gè)PCR擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系中，在多色實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行96℃預(yù)變性2min后，再94℃變性10sec，52-56℃復(fù)性30sec，60-70℃延伸40sec，共45個(gè)循環(huán)，并在延伸時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，使兩對(duì)引物分別同時(shí)引導(dǎo)新鏈合成，實(shí)現(xiàn)兩對(duì)引物的共擴(kuò)增和其拷貝數(shù)的定量檢測(cè)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒，其特征在 于，所述DSCR和GAPDH特異引物和雙色Taqman熒光探針的序列分別為DSCR上游引物 5， -CAG AAA TCC CAG TTC ATG TTG CT-3， ; DSCR下游引物5， -CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT-3， ; DSCR TaqMan探針5， -[FAM]CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC[TAMRA]-3，; GAPDH上游引物5， -etc cct ctt tct ttg cag caa t-3， ; GAPDH下游引物5' -cag etc tea tac cat gag tec t-3， ； GAPDH TaqMan探針5， -[HEX] ctg cac cac caa ctg ctt age [TAMRA]-3，。
3、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒，其特征在 于，擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系中，各個(gè)成分及其濃度含量分別如下DSCR和GAPDH特異的引物、 雙色熒光Taqman探針各0.1-0. 5咖ol/L、 Taq DNA聚合酶1-3U/50ul、 dNTPs底物0.1-0. 5 ,1/L、模板DNA若干、Mg++1.5-3.5 ,1/L、反應(yīng)緩沖液0. 5-1. 5XPCR，其中1XPCR反 應(yīng)緩沖液包括50 mmol/L KCl、 10咖ol/L Tris.HCl PH8. 3、 0. 01%明膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙色熒光定量共擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒，首先根據(jù)21號(hào)染色體特異DSCR區(qū)段序列和16號(hào)染色體上的GAPDH基因序列分別合成其特異引物和雙色Taqman探針，然后在同一擴(kuò)增緩沖反應(yīng)體系中，經(jīng)過45個(gè)PCR循環(huán)，使兩對(duì)引物分別同時(shí)引導(dǎo)新鏈合成，實(shí)現(xiàn)兩對(duì)引物的共擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增過程中由于降解Taqman探針獲得的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化情況，獲得各自的擴(kuò)增曲線圖，進(jìn)而得出各個(gè)基因的Ct值。從而計(jì)算它們的拷貝數(shù)比值，再根據(jù)兩個(gè)基因拷貝數(shù)的比值進(jìn)一步判斷21號(hào)染色體的倍性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101105454SQ200710014390
公開日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者夏慶杰, 林 楊 申請(qǐng)人:山東亞大藥業(yè)有限公司