本發(fā)明涉及分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及大麥染色體原位雜交(FISH)過程中寡核苷酸的確定與應(yīng)用，本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明提供的寡核苷酸探針對(duì)大麥開展非變性熒光原位雜交(ND-FISH)反應(yīng)體系的建立與對(duì)大麥染色體組鑒定的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高等生物染色體復(fù)結(jié)構(gòu)雜，在不同染色體區(qū)域存在大量的重復(fù)序列，基于這一特性，在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域通常通過標(biāo)記重復(fù)序列用于鑒定染色體。其是通過對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行熒光標(biāo)記標(biāo)記制備探針，使用染色體原位雜交方法分析染色體上探針信號(hào)的分布狀態(tài)，從而區(qū)分基因組與染色體組。此外，通過比較染色體上探針信號(hào)的變化亦是分析染色體行為的普遍做法。進(jìn)一步地，染色體原位雜交方法在染色體工程育種中也起著至關(guān)重要的作用，染色體原位雜交方法是鑒定、區(qū)分特定物種基因組與染色體組最有效、直接的方法之一。

目前，已經(jīng)報(bào)道的大麥亞端粒探針僅有Hv01，其是通過擴(kuò)增大麥基因組亞端粒重復(fù)序列而得到的(Schubert et al.The Plant Journal 1998,14:494)。然而，通過標(biāo)記擴(kuò)增目標(biāo)序列流程復(fù)雜，耗時(shí)費(fèi)力，且受多種因素影響使得標(biāo)記效果往往不理想。尤其是在進(jìn)行大量試驗(yàn)操作時(shí)，這一方法將在很大程度上影響試驗(yàn)進(jìn)程與效果。同時(shí)，通過標(biāo)記擴(kuò)增目標(biāo)序列開展染色體原位雜交實(shí)驗(yàn)的方法需要對(duì)目標(biāo)材料染色體進(jìn)行變性處理，不僅增加了試驗(yàn)流程，同時(shí)在處理過程中易對(duì)載玻片上的染色體位置產(chǎn)生位移。當(dāng)前，ND-FISH技術(shù)逐步興起，替代傳統(tǒng)的FISH試驗(yàn)方法。其可通過設(shè)計(jì)合適的寡合苷酸探針，在不變性的條件下直接對(duì)目標(biāo)材料染色體進(jìn)行標(biāo)記，極大地精簡了實(shí)驗(yàn)步驟、縮短了試驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)保證了試驗(yàn)效果。因此，提供一條能穩(wěn)定標(biāo)記大麥亞端粒區(qū)域的核苷酸探針將有助于解決當(dāng)前原位雜交試驗(yàn)中標(biāo)記大麥亞端粒區(qū)域所面臨的困境。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)上的不足，本發(fā)明提供一種能穩(wěn)定標(biāo)記大麥染色體組的寡核苷酸探針以及該探針結(jié)合其他寡核苷酸探針通過ND-FISH方法鑒定大麥染色體組的應(yīng)用。

基于以上目的，本發(fā)明根據(jù)Schubert et al.(The Plant Journal 1998,14:494)對(duì)大麥染色體亞端粒區(qū)的研究結(jié)果確定引物：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用該引物對(duì)栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物存在如圖1所示的4條較亮條帶。選取其250bp左右條帶回收并構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，其序列長度為113-116bp，說明所回收的核苷酸中存在兩個(gè)前后相連的相似性極高的片段。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)序結(jié)果Baudin 1進(jìn)行序列比對(duì)分析，檢測(cè)出其在一段全長為105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登錄號(hào)為AC256248.1)上存在64個(gè)拷貝。將HV_Mba442-A01分成小片段后反復(fù)在NCBI數(shù)據(jù)庫中與其自身比對(duì)，最終確定一段相對(duì)保守的全長為55bp的核苷酸用于探針制備，其堿基序列為：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’，命名為Oligo-442A01，合成該序列并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記用于制備探針。本發(fā)明提供了上述寡核苷酸探針在ND-FISH方法中對(duì)大麥染色體標(biāo)記方法及染色體組鑒定的應(yīng)用。

本發(fā)明的寡核苷酸探針可用于檢測(cè)大麥材料染色體。

本發(fā)明提供了上述寡核苷酸探針在ND-FISH方法中對(duì)大麥染色體組鑒定的應(yīng)用，是用上述寡核苷酸探針與寡核苷酸探針(AGG)₅組成的探針組合對(duì)大麥染色體開展ND-FISH試驗(yàn)，綜合大麥染色體組的兩種探針信號(hào)位點(diǎn)分布狀況，若在熒光顯微鏡下能將大麥染色體組區(qū)分開，說明寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅的組合能用于鑒定大麥染色體組。

本發(fā)明提供了檢測(cè)大麥材料染色體的寡核苷酸探針，即Oligo-442A01，探針核苷酸序列為：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’。(SEQ ID NO.3)

進(jìn)一步地，提供了Oligo-442A01在檢測(cè)大麥材料染色體的方法。

本發(fā)明提供了Oligo-442A01探針在ND-FISH方法中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了Oligo-442A01探針在大麥種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了Oligo-442A01探針結(jié)合(AGG)₅探針在ND-FISH方法中鑒定大麥材料染色體組的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種寡核苷酸探針Oligo-442A01在ND-FISH方法中檢測(cè)大麥材料染色體的方法，用寡核苷酸探針Oligo-442A01對(duì)大麥材料染色體開展ND-FISH試驗(yàn)，若在熒光顯微鏡下大麥部分區(qū)域表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的信號(hào)，說明寡核苷酸探針Oligo-442A01能用于ND-FISH方法中檢測(cè)大麥材料染色體亞端粒區(qū)域。

其中，所述ND-FISH方法反應(yīng)程序?yàn)椋河诠鈱W(xué)顯微鏡下檢查染色體，選取染色體形態(tài)清晰、分散較好的載玻片，滴加10μl(0.35μl1OD/ml Oligo-442A01探針與9.65μl雜交液)混合雜交液，蓋蓋玻片，置于潮濕的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC緩沖液清洗雜交液兩次，ddH₂O洗1次，滴加10μl DAPI染液，蓋蓋玻片，于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機(jī)拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

本發(fā)明提供了上述方法在大麥細(xì)胞學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種寡核苷酸探針Oligo-442A01與寡核苷酸探針(AGG)₅組合在ND-FISH方法中鑒定大麥材料染色體組的應(yīng)用，用寡核苷酸探針Oligo-442A01與寡核苷酸探針(AGG)₅按一定比例濃度組合對(duì)大麥材料染色體開展ND-FISH試驗(yàn)，綜合大麥染色體組的兩種探針信號(hào)位點(diǎn)分布狀況，若在熒光顯微鏡下能將大麥染色體組區(qū)分開，說明寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅的組合能用于鑒定大麥染色體組。

其中，所述ND-FISH方法反應(yīng)程序?yàn)椋河诠鈱W(xué)顯微鏡下檢查染色體，選取染色體形態(tài)清晰、分散較好的載玻片，滴加10ul(0.35μl 1OD/ml Oligo-442A01探針、0.35μl 1OD/ml(AGG)₅探針與9.30μl雜交液)混合雜交液，蓋蓋玻片，置于潮濕的暗盒中37℃孵育2h，2×SSC緩沖液清洗雜交液兩次，ddH₂O洗1次，滴加10μl DAPI染液，蓋蓋玻片，于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機(jī)拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

本發(fā)明所開發(fā)的ND-FISH方法中對(duì)大麥染色體進(jìn)行標(biāo)記的寡核苷酸探針，直接對(duì)大麥染色體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該探針能顯著地標(biāo)記于大麥染色體亞端粒區(qū)域。該方法不僅具有靈敏度高、檢測(cè)效果較好的特點(diǎn)，同時(shí)還克服了傳統(tǒng)的質(zhì)粒標(biāo)記方法所帶來的流程復(fù)雜、標(biāo)記效果受干擾較大的不足，是一種很好的檢測(cè)大麥染色體亞端粒區(qū)域的寡核苷酸探針。同時(shí)，本發(fā)明提供的ND-FISH方法鑒定大麥染色體組的應(yīng)用具有耗時(shí)短、靈敏度好、檢測(cè)效果好、染色體組易于區(qū)分的特點(diǎn)，是一種較優(yōu)的鑒定大麥染色體組的方法。利用本發(fā)明提供的寡核苷酸探針及鑒定方法，將使后續(xù)研究操作更便捷有效。

附圖說明

圖1為栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027PCR擴(kuò)增凝膠電泳檢測(cè)圖，從左到右依次為Marker、Baudin、CN4027。圖中從100bp-500bp間存在4條較亮條帶，250bp左右條帶為回收條帶。

圖2為栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027擴(kuò)增序列對(duì)比結(jié)果。各材料從涂板中選取24株長勢(shì)較好菌落涂板，再從涂板中挑選3條菌落條帶測(cè)序，Baudin1、Baudin9、Baudin21分別表示材料Baudin第1、9、21條菌落條帶，CN4027 11、CN4027 17、CN4027 19分別表示材料CN4027第11、17、19條菌落條帶。

圖3為寡核苷酸探針Oligo-442A01在ND-FISH體系中對(duì)栽培大麥Baudin(左)、野生大麥CN4027(右)染色體的標(biāo)記效果圖，其中灰色區(qū)域?yàn)镈API標(biāo)記的大麥染色體，亞端粒高亮區(qū)域?yàn)镺ligo-442A01信號(hào)點(diǎn)。

圖4為寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅在ND-FISH體系中對(duì)栽培大麥Baudin(左)、野生大麥CN4027(右)開展原位雜交后染色體的信號(hào)分布圖。其中亞端粒高亮區(qū)域?yàn)镺ligo-442A01信號(hào)點(diǎn)，近著絲粒高亮區(qū)域?yàn)?AGG)₅信號(hào)點(diǎn)。從圖中可發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅信號(hào)組合在大麥材料各染色體組上的信號(hào)分布存在顯著差異，且在兩個(gè)親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的大麥材料中的同一染色體組信號(hào)分布位點(diǎn)相似。說明寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅的組合能有效地區(qū)分大麥染色體組。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所使用的大麥材料：栽培品種Baudin、野生品種CN4027，均來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院。本發(fā)明所使用生化試劑均為市售。本發(fā)明各試劑及配方如下：

DNA提取試劑盒：TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增試劑盒：EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(TaKaRa)。cDNA回收試劑盒：TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(TaKaRa)。質(zhì)粒：pMD^TM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)。感受態(tài)細(xì)胞：Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells(TaKaRa)。瓊脂糖凝膠：采用0.5％瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)gDNA，2.0％瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)cDNA。其具體配方如表1。

表1

LB培養(yǎng)基(pH 7.0)：1％(W/V)tryptone,0.5％(W/V)Yeast Extract,1％(W/V)NaCl。

2×SSC緩沖液：0.3M NaCl,0.03M檸檬酸鈉。

70％甲酰胺變性劑：70％甲酰胺，溶于2×SSC緩沖液中。

雜交液：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

實(shí)施例1 大麥亞端粒重復(fù)序列分析及寡核苷酸探針序列的確定

1、大麥基因組DNA的提取

選取待測(cè)材料Baudin、CN4027幼嫩葉片，采用柱式法(TaKaRa MiniBEST Plant DNA Extraction Kit)提取DNA，提取步驟如下：

a)取150mg新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細(xì)粉迅速加入500μl的Buffer HS I和10μl的50×DTT Buffer混勻，然后加入10μl的RNase A(10mg/ml)，充分振蕩混勻，于56℃水浴中溫育10分鐘。

b)加入62.5μl的Buffer KAC，充分混勻。冰上放置5分鐘，12,000rpm離心5分鐘。取上清，加入與上清液等體積的BufferGB，充分混勻。

c)將Spin Column安置于Collection Tube，溶液移至Spin Column中。將500μl的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

d)將700μl的Buffer WB加入至Spin Column中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

e)將Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm離心2分鐘。

f)將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入預(yù)熱至65℃的40μl Elution Buffer，室溫靜置5分鐘。

g)12,000rpm離心2分鐘洗脫DNA。

h)0.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。

2、PCR擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)(Schubert I,Shi F,Fuchs J,et al.An efficient screening for terminal deletions and translocations of barley chromosomes added to common wheat.The Plant Journal,1998,14:494.)對(duì)大麥染色體亞端粒標(biāo)記探針的研究結(jié)果，參考其公布的引物HvT01，其核苷酸序列如下：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)；

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)。利用該引物對(duì)Baudin、CN4027進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)程序：

擴(kuò)增結(jié)果如圖1。

3、寡核苷酸探針核苷酸序列的確定與探針制備

圖1中存在4條明顯條帶，選擇250bp左右條帶回收，構(gòu)建質(zhì)粒后送樣測(cè)序，結(jié)果如圖2。測(cè)序結(jié)果顯示堿基序列為113-116bp長，說明圖1中存在的間斷條帶極有可能為連續(xù)相接的重復(fù)序列。將B1序列導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)分析，檢測(cè)出其在一段全長為105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登錄號(hào)為AC256248.1)上存在64個(gè)拷貝。將HV_Mba442-A01分成小片段后反復(fù)在NCBI數(shù)據(jù)庫中與其自身比對(duì)，最終確定一段相對(duì)保守的全長為55bp的核苷酸用于探針制備，其在HV_Mba442-A01中存在75個(gè)拷貝，堿基序列為：

5’-CTACTACTCACTGATTTTGGGTCCCGGGGCGATACGAACGTTCGGGGAACTTCGG-3’，將其命名為Oligo-442A01，合成該序列并對(duì)其進(jìn)行及熒光標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記用于制作探針。

預(yù)期本發(fā)明的寡核苷酸探針可便捷快速地用于鑒定大麥染色體亞端粒區(qū)域。

實(shí)施例2 寡核苷酸探針Oligo-442A01在ND-FISH方法中對(duì)大麥染色體標(biāo)記的方法

1、大麥根尖細(xì)胞染色體制片

選取發(fā)芽后根長1-2cm根尖于N₂O中處理4h，醋酸滅活，ddH₂O洗凈，切取分生區(qū)于37℃酶混合液(纖維素酶：果膠酶＝1:1)中酶解37min，吸除酶液后依次用ddH₂O、無水乙醇各洗2次。每1根尖加入20μl乙酸充分?jǐn)嚢柚良?xì)胞呈現(xiàn)懸浮狀，于每張載玻片上滴10μl懸浮液。光學(xué)顯微鏡下檢查染色體，選取染色體形態(tài)清晰、分散較好的載玻片，并做好標(biāo)記4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2、染色體原位雜交

取出載玻片自然晾干，混合雜交液按每張載玻片0.35μl 1OD·ml^-1Oligo-442A01與9.65μl雜交液的比例配置，用移液槍將混合雜交液反復(fù)打勻，吸取10μl混合雜交液滴于干燥的載玻片上，蓋蓋玻片于濕潤暗盒中37℃孵育2h。取出后避光條件下2×SSC洗2次、ddH₂O洗1次，每次5min。自然晾干后每張載玻片滴加10μl DAPI，蓋蓋玻片于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機(jī)拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

結(jié)果如圖3，大麥各染色體亞端粒區(qū)域均存在顯著的信號(hào)點(diǎn)，表明本發(fā)明開發(fā)的寡核苷酸探針Oligo-442A01在ND-FISH試驗(yàn)中對(duì)大麥亞端粒區(qū)域具有顯著地標(biāo)記效果，能夠快捷、準(zhǔn)確地用于檢測(cè)大麥染色體亞端粒區(qū)域。

實(shí)施例3 寡核苷酸探針Oligo-442A01與(AGG)₅在ND-FISH方法中對(duì)大麥染色體組鑒定方法的建立及應(yīng)用

選取實(shí)施例2中制好的載玻片自然晾干，混合雜交液按每張載玻片0.35μl 1OD·ml^-1 Oligo-442A01、0.35μl 1OD·ml^-1(AGG)₅與9.30μl雜交液的比例配置，用移液槍將混合雜交液反復(fù)打勻，吸取10μl混合雜交液滴于干燥的載玻片上，蓋蓋玻片于濕潤暗盒中37℃孵育2h。取出后避光條件下2×SSC洗2次、ddH₂O洗1次，每次5min。自然晾干后每張載玻片滴加10μl DAPI，蓋蓋玻片于OLYMPUS BX63熒光顯微鏡下觀察染色體并使用OLYMPUS DP80CCD相機(jī)拍攝照片。上述雜交液為：5mM Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.15M NaCl,0.015M檸檬酸鈉。

檢測(cè)結(jié)果見圖4，由圖可看出，本發(fā)明提供的寡核苷酸探針Oligo-442A01結(jié)合(AGG)₅的探針組合能有效識(shí)別大麥染色體組。圖中亞端粒區(qū)域高亮區(qū)為寡核苷酸探針Oligo-442A01信號(hào)，近著絲粒區(qū)域高亮區(qū)為寡核苷酸探針(AGG)₅信號(hào)。其特點(diǎn)為：1H染色體短小，長臂與短臂Oligo-442A01信號(hào)較強(qiáng)，(AGG)₅信號(hào)分布于著絲粒附近，且其信號(hào)強(qiáng)度較弱；2H染色體短臂存在明顯的Oligo-442A01信號(hào)，而長臂上不存在Oligo-442A01信號(hào)，(AGG)₅信號(hào)分布于著絲粒附近，且其信號(hào)強(qiáng)度較弱；3H染色體長臂Oligo-442A01信號(hào)較強(qiáng)，(AGG)₅信號(hào)分布于著絲粒附近，且其信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)；4H染色體長臂與短臂Oligo-442A01信號(hào)較強(qiáng)，(AGG)₅信號(hào)分布范圍較廣，主要位于著絲粒附近與短臂區(qū)域，且其信號(hào)強(qiáng)度在所有染色體組中是最強(qiáng)的；5H染色體短臂存在明顯的Oligo-442A01信號(hào)，(AGG)₅信號(hào)分布于著絲粒附近；6H染色體長臂與短臂Oligo-442A01信號(hào)較強(qiáng)，(AGG)₅信號(hào)分布于著絲粒附近，其信號(hào)強(qiáng)度較適中；7H染色體長臂與短臂均存在Oligo-442A01信號(hào)，但其信號(hào)強(qiáng)度最弱，(AGG)₅信號(hào)集中于著絲粒附近，其信號(hào)強(qiáng)度適中。

雖然，上文已經(jīng)用一般性說明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做出一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種原位雜交探針及其對(duì)大麥染色體組鑒定的方法

<130> KHP171110047.2TQ

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaaactcgc attttggcc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagttcccg taaccggccc 20

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 大麥

<400> 3

ctactactca ctgattttgg gtcccggggc gatacgaacg ttcggggaac ttcgg 55