一種可去除隨機整合的位點特異性整合載體及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可去除隨機整合的位點特異性整合載體及其構(gòu)建方法和應用，包括pUC?ori、attB序列和多克隆位點MCS，在attB序列上下游分別設有第一loxP序列和第一rox序列，CMV啟動子連接在第一loxP序列的上游，負篩選基因與第一rox序列相連接，負篩選基因下游還連接有內(nèi)核糖體結(jié)合位點IRES2，IRES2下游為熒光標記基因，熒光標記基因下游為MCS，MCS上下游分別設有第二rox序列和第二loxP序列，并且分別與第一rox序列和第一loxP序列方向相同，MCS下游為正篩選元件。本發(fā)明為在細胞篩選中提供剔除隨機整合重組細胞而直接篩選出假attP位點特異整合的重組細胞的新的應用。
【專利說明】一種可去除隨機整合的位點特異性整合載體及其構(gòu)建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及一種位點特異性整合的表達載體，特別涉及一種可去除隨機整合的位點特異性整合載體及其構(gòu)建方法和應用。
【背景技術】
[0002]轉(zhuǎn)基因動物的研究現(xiàn)在正是科學研究中的熱點。然而，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術仍然存在一定弊端:外源基因的隨機插入帶來的位置效應，即外源基因隨機插入到與細胞重要生命活動相關的基因內(nèi)部引起其異常表達，或者外源基因插入異染色質(zhì)區(qū)造成外源基因表達沉默。
[0003]近年來，鏈霉菌噬菌體(pC31整合酶因為其可以介導帶有attB位點的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒在哺乳動物基因組假attP位點整合，而且該整合具有單向整合、無需外界化學能源和輔助因子、勝任大片段基因有效整合、外源基因可長期高效表達等特點[Calos MP.The φ€31integrase system for gene therapy.Curr Gene Ther,2006,6 (6):633 - 645.],已經(jīng)越來越多的用于轉(zhuǎn)基因研究。而有關假attP位點在基因組分布規(guī)律方面的研究表明，假attP位點多位于基因間或基因內(nèi)含子內(nèi)，整合很少發(fā)生在基因的外顯子中[ThyagarajanB, Liu Y, Shin S, Lakshmipathy U, Scheyhing K, Xue H, EllerstlOITl C, Strehl R, HyllnerJj Rao MS, Chesnut JD.Creation of engineered human embryonic stem cell linesusing (pC3 I integrase.Stem Cells, 2008，26 (I): 119 - 126.] 0 而且，整合位點不偏好于轉(zhuǎn)錄起始位點[Chalberg TWj Portlock JLj Olivares EC, Thyagarajan B, Kirby PJ，HillmanRTj Hoelters J，Calos MP.1ntegration specificity of phage CpC3 I integrase in thehuman genome.J Mol Biol，2006，357 (I): 28 - 48.]，從這方面來講，(pC31 整合酶介導的整合潛在的安全隱患較隨機插入和病毒載體系統(tǒng)要小的多。
[0004]然而，(pC31整合酶介導的整合反應中也存在不同程度的隨機整合事件[Thyagarajanj B.，01 ivares, E.C.，HoIlis，R.P.，Ginsburg，D.S.&Calos，Μ.P.Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phagephiC31integrase.Molecular and cellular biology21，3926-3934，]，這些隨機整合大大降低了 q>C31整合酶介導的位點特異性整合準確性，并且為該方法的安全性帶來不確定的隱患；而常規(guī)方法只能通過PCR等分子生物學手段鑒定，并人為地舍棄cpC31整合酶介導的整合反應中存在隨機整合的重組細胞，此方法費時費力。
[0005]體細胞核移植技術作為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的有效有段，其突出優(yōu)點是將基因轉(zhuǎn)移提前到體細胞培養(yǎng)階段，可以有效的提高轉(zhuǎn)基因動物的出生率和控制生產(chǎn)成本[M.B.Wheelerand E.M.Walters.Transgenic technology and applications in swine.Theriogenology2001，56 (8): 1345-1369]，但是核供體細胞的準備一般需要經(jīng)過藥物篩選，而最終轉(zhuǎn)基因細胞中抗生素篩選標記的殘留，對轉(zhuǎn)基因動物安全及環(huán)境安全造成了潛在的威脅，而其余載體骨架來源于細菌成分，宿主往往通過表觀遺傳學修飾(如甲基化)使轉(zhuǎn)基因表達不穩(wěn)定甚至沉默。隨著人們對生物安全性的關注，載體骨架序列(被稱為“垃圾DNA”)和選擇標記基因的安全性已成為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全性評價的重要對象之一。鑒于此，一種有效的篩選假attP位點整合重組細胞并切除包含篩選標記及載體骨架的系統(tǒng)迫切的需要用于轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)過程中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明解決的問題在于提供一種可去除隨機整合的位點特異性整合載體及其構(gòu)建方法和應用，克服現(xiàn)有基因整合和篩選方面存在的缺陷，剔除cpC31整合酶介導的整合反應中隨機整合重組細胞而直接篩選出假attP位點特異整合的重組細胞，為體細胞核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚提供無載體骨架和篩選標記的核供體細胞，提高轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的安全性。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn):
[0008]—種可去除隨機整合的位點特異性整合載體,包括pUC or1、attB序列和多克隆位點MCS，在attB序列上下游分別設有第一 1xP序列和第一 rox序列，CMV啟動子連接在第一 1xP序列的上游,負篩選基因與第一 rox序列相連接,負篩選基因下游還連接有內(nèi)核糖體結(jié)合位點IRES2，IRES2下游為熒光標記基因，熒光標記基因下游為MCS，MCS上下游分別設有第二 rox序列和第二 1xP序列，并且分別與第一 rox序列和第一 1xP序列方向相同，MCS下游為正篩選元件。
[0009]所述的多克隆位點MCS包括以下限制性內(nèi)切酶識別位點:Pvu1、SpeI, AscI, PacI和 AgeI。
[0010]所述的負篩選基因的開放閱讀框為HSVtk開放閱讀框，負篩選基因與第一 rox序列之間還通過linker相連 接，熒光標記基因的開放閱讀框為AcGFPl-Nuc開放閱讀框，其終止子為Sv40終止子；正篩選元件為KanR/neoR表達元件。
[0011]所述的第一 1xP序列、attB序列、第一 rox序列、linker和tk負篩選基因在CMV啟動子作用下融合表達loxP-attB-rox-linker-tk ;突光標記基因在CMV啟動子作用下轉(zhuǎn)錄后由IRES2募集核糖體翻譯滅光指不蛋白；所述的CMV啟動子為組成型Pcmv IE啟動子。
[0012]所述的loxP-attB-rox-linker-tk融合基因，根據(jù)linker不同分為三種:LAR-Nul1-tk,LAR- (Gly4Ser)3_tk 和 LAR_P2A_tk。
[0013]所述的第一 1xP序列、attB序列和第一 rox序列連接之后的序列如SEQ.1D.N0.1所示；
[0014]所述的第二 rox序列、MCS和第二 1xP序列連接之后的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0015]一種可去除隨機整合的位點特異性整合載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0016]I)通過SOE-PCR方法，克隆獲得如SEQ.1D.N0.1所示的兩端含有HindIII和SalI酶切位點及第一 1xP序列和第一 rox序列的attB序列，得到LAR序列；
[0017]2)用HindII I/Sal I雙酶切LAR序列克隆入pGEM_3Z載體獲得pGEM-LAR載體
[0018]3)退火合成帶有Sall/BamHI粘性末端的linker序列，分別克隆入Sall/BamHI雙酶切的 pGEM-LAR 載體分別獲得 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR- (Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 載體；
[0019]4)分別 NcoI 單酶切 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR- (Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 載體，回收300bp左右片段，分別克隆入pORF-HSVtk載體，分別獲得pLARNtk，pLARGtk和pLARPtk 載體；
[0020]5)通過SOE-PCR方法，克隆獲得兩端含有NotI酶切位點及第二 1xP序列的MCS，克隆入 pIRES2-AcGFPl-Nuc 載體獲得 pIAN-MCSL ；
[0021]6)通過PCR獲得兩端帶有PvuI和SpeI酶切位點的SV40終止子和第二 rox序列，克隆入PIAN-MCS載體中獲得PIAN-RMCSL ；
[0022]7) NheI 單酶切 pLARNtk，pLARGtk 和 pLARPtk 載體，回收 1500bp 左右片段，分別克隆入 pIAN-RMCSL 載體，獲得 pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和pLARPtk-1AN-RMCSL。
[0023]所述的可去除隨機整合的位點特異性整合載體在哺乳動物細胞篩選中提供剔除隨機整合重組細胞而直接篩選出假attP位點特異整合的重組細胞的應用。
[0024]可去除隨機整合的位點特異性整合載體在進行細胞轉(zhuǎn)染之后，進行藥物篩選，獲得表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的重組細胞；然后對其進行Cre重組剪切1xP序列和Dre重組剪切rox序列的處理，獲得假attP位點特異整合的無抗生素篩選標記無質(zhì)粒骨架的重組細胞。
[0025]所述的Cre重組剪切1xP序列和Dre重組剪切rox序列的處理為:
[0026]對藥物篩選后的重組細胞進行包含Cre元件和Dre元件的表達載體的轉(zhuǎn)染,或者將其在含有連接有穿膜肽的Cre重組酶和Dre重組酶的環(huán)境中進行孵育。
[0027]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果:`[0028]1、本發(fā)明提供的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，在進行細胞轉(zhuǎn)染后，在鏈霉菌噬菌體(pC31整合酶介導下，大部分能夠位點特異性地整合到真核細胞基因組內(nèi)假attP位點，其分布偏向于基因間或基因內(nèi)含子內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域，避免了質(zhì)粒隨機插入引起的基因表達沉默和其他安全隱患，從而使得轉(zhuǎn)基因持續(xù)高效表達。
[0029]2、本發(fā)明提供的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，由于正負篩選標記的設計，能夠通過G418和GCV進行藥物篩選，獲得既具有G418抗性(提示穩(wěn)定整合)又不表達HSVtk (提示無隨機整合事件)的陽性細胞克隆，并且輔以熒光指示蛋白提示瞬時轉(zhuǎn)染效率和排除對GCV藥物不敏感的隨機整合重組細胞。
[0030]3、本發(fā)明提供的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，在篩選獲取陽性的重組細胞后，通過對Cre重組剪切1xP和Dre重組剪切rox，去除兩個同向1xP之間的CMV啟動子、正篩選元件及其他載體骨架，并且去除兩個rox之間的負篩選標記和熒光指示蛋白，從而獲得無質(zhì)粒骨架和篩選標記的假attP位點整合的轉(zhuǎn)基因重組體，排除了篩選標記對轉(zhuǎn)基因動物安全和環(huán)境安全的影響，也避免了由于載體骨架在宿主細胞體內(nèi)引起的轉(zhuǎn)基因沉默或表達不穩(wěn)定。
[0031 ] 4、本發(fā)明提供的可去除隨機整合的位點特異性整合載體,針對載體整合位點、轉(zhuǎn)基因表達水平、篩選標記和載體骨架殘留等問題，可應用于為體細胞核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚提供無載體骨架和篩選標記的核供體細胞，從而建立一種無載體骨架和篩選標記的轉(zhuǎn)基因動物安全培育體系，可用于開展動物轉(zhuǎn)基因研究?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0032]圖1為載體pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL構(gòu)建的凝膠電泳檢測圖；
[0033]圖2 為 pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL 載體中不同 linker 的測序結(jié)果；
[0034]圖3為本發(fā)明載體系統(tǒng)構(gòu)成圖；
[0035]圖4 為 Western Blotting 檢測不同 pLAR-linker-1AN-RMCSL 表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞后tk融合蛋白的表達情況；
[0036]圖5為免疫染色法檢測不同pLAR-linker-1AN-RMCSL表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞后tk融合蛋白的表達及亞細胞定位情況。
[0037]圖6為不同pLAR-linker-1AN-RMCSL表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞后tk融合蛋白對不同GCV濃度的細胞毒性檢測。
【具體實施方式】
[0038]本發(fā)明提供的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，該載體系統(tǒng)能夠在鏈霉菌噬菌體(pC31整合酶的介導下，位點特異性地整合到真核細胞基因組內(nèi)假attP位點，從而使得轉(zhuǎn)基因持續(xù)高效表達，解決載體整合位點、轉(zhuǎn)基因表達水平的問題；然后經(jīng)藥物正負篩選得到剔除了隨機整合事件參與的陽性細胞后，在Cre和Dre重組剪切的作用下切除篩選標記和其他載體骨架，最終得到無篩選標記和載體骨架的轉(zhuǎn)基因細胞，用于體細胞核移植，生產(chǎn)無篩選標記和載體骨架的轉(zhuǎn)基因動物，從而提高轉(zhuǎn)基因動物安全性，為開展動物轉(zhuǎn)基因研究提供有價值的技術平臺。下面結(jié)合具體的載體的構(gòu)建和檢測對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0039]一種可去除隨機整合的位點特異性整合載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0040]I)通過SOE-PCR方法，克隆獲得如SEQ.1D.N0.1所示的兩端含有HindIII和SalI酶切位點及第一 1xP序列和第一 rox序列的attB序列，命名為LAR ;具體操作為:
[0041 ] 將引物LAR_F1和LAR_R1通過退火合成片段LARl ；
[0042]以載體pARNG (參見見專利ZL201110259942.8—“一種基于假attP位點整合的通用型表達載體及其構(gòu)建方法和應用”)為模板，通過引物LAR_F2和LAR_R2擴增獲得300bp左右片段LAR2 (見圖Ι-a，泳道I)；
[0043]以LARl和LAR2為模板，通過弓丨物LAR_F1和LAR_R2擴增得到381bp的LAR片段(見圖Ι-a，泳道2)
[0044]LAR Fl:ccaagcttcc atggtagcta gcataacttc gtatagcata cattatacgaagttatagg ；
[0045]LAR Rl:ggtggcccta taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgctagctaccatggaag c ；
[0046]LAR F2:ttatagggcc accatgcccg ccgtgaccg ；
[0047]LAR R2:cgacgtcgac taactttaaa taattggcat tatttaaagt taagatgtaggtcacggtc ；
[0048]2)用HindII I/Sal I雙酶切LAR序列和pGEM_3Z載體，凝膠回收LAR片段和載體骨架片段，4°C過夜連接，得到重組載體pGEM-LAR ；
[0049]酶切鑒定如圖Ι-b所示，其中泳道I為Hindlll/Sall雙酶切pGEM_3Z載體(陰性對照)，只有一條2743bp的條帶，而泳道2為Hindlll/Sall雙酶切pGEM-LAR重組載體，可切出2743bp (pGEM-3Z載體骨架)和381bp (LAR片段)兩條帶。
[0050]3)退火合成帶有Sall/BamHI粘性末端的3種linker序列，分別克隆入Sall/BamHI 雙酶切的 pGEM-LAR 載體獲得 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR-(Gly4Ser)3 和PGEM-LAR-P2A載體；測序結(jié)果如圖2所示。
[0051]其中，Null的 linker 序列為 ccatgg ；
[0052](Gly4Ser) 3 的 linker 序列為 ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggttcc ;
[0053]P2A 的 linker 序列為 ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggAggagaaccctggaccc ；
[0054]4) NcoI 單酶切 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR-(Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 載體，回收400bp左右片段，分別克隆入pORF-HSVtk載體，獲得pLARNtk，pLARGtk和pLARPtk載體；
[0055]酶切鑒定結(jié)果如圖Ι-c所示:泳道I為NcoI單酶切pORF-HSVtk載體(陰性對照)，只得到一條4373bp條帶，泳道2-4分別為NcoI單酶切p LARNtk, pLARGtk和pLARPtk重組載體，分別得到4373bp和400bp左右兩條帶。
[0056]5)通過SOE-PCR方法，克隆獲得兩端含有NotI酶切位點及第二 1xP序列的MCS，克隆入pIRES2-AcGFPl-Nuc載體獲得pIAN-MCSL ;具體操作如下: [0057]將引物MCS_F1和MCS_R1通過SOE-PCR的方法合成片段MCSl (圖l_d，86bp);該步驟SOE-PCR所用的模板為引物本身，如MCS_F1/MCS_R1本身既是引物也是模板，由于這兩對引物有15_20bp的反向互補序列，退火時互補序列結(jié)合，PCR時在Taq酶作用下延伸補齊片段，形成下一輪SOE-PCR的模板；
[0058]以片段MCSI為模板，MCS_F I和MCS_R2為引物，通過SOE-PCR的方法合成片段MCS (127bp,圖Ι-d)，其序列具體如SEQ.1D.N0.2所示，其中LoxP序列為ataacttcgtatagcataca ttatacgaag ttat ；
[0059]MCS Fl:ataagaatgc ggccgctcgc gatcgcgact agactagtct agttg ；
[0060]MCS Rl:cgaagttatc gaccggtagc ccttaattaa ggttggcgcg ccaactagactagtctagtc gcgat ；
[0061]MCS R2:atagtttagc ggccgcataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttatcgaccggt ；
[0062]6)通過PCR獲得兩端帶有PvuI和SpeI酶切位點的SV40終止子和第二 rox序列，克隆入PIAN-MCSL載體中獲得PIAN-RMCSL ；
[0063]雙酶切鑒定結(jié)果如圖Ι-e所示:泳道I為Pvul/Spel雙酶切pIAN-MCSL載體，只得到5524bp —條帶；泳道2為Pvul/Spel雙酶切pIAN-RMCSL重組載體，得到5524bp和280bp兩條帶。
[0064]7) NheI 單酶切 pLARNtk，pLARGtk 和 pLARPtk 載體，回收 1500bp 左右片段，分別克隆入 pIAN-RMCSL 載體，獲得 pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和pLARPtk-1AN-RMCSL 重組載體；
[0065]雙酶切鑒定結(jié)果如圖l_f所示，泳道I為NheI單酶切pIAN-RMCSL載體(陰性對照)，只得到一條5804bp的條帶；泳道2-4為NheI單酶切pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和 pLARPtk-1AN-RMCSL 重組載體，分別得到 5804bp 和 1500bp 的兩條帶。
[0066]所構(gòu)建的通用型表達載體pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL載體，其構(gòu)成圖如圖3所示，包括pUC or1、attB序列和多克隆位點MCS，在attB序列上下游分別設有第一 1xP序列和第一 rox序列，CMV啟動子連接在第一 1xP序列的上游，負篩選基因與第一 rox序列相連接，負篩選基因下游還連接有內(nèi)核糖體結(jié)合位點IRES2, IRES2下游為熒光標記基因，熒光標記基因下游為MCS，MCS上下游分別設有第二 rox序列和第二 1xP序列，并且分別與第一 rox序列和第一 1xP序列方向相同，MCS下游為正篩選元件。
[0067]其中pUC ori是質(zhì)粒的復制原點，為了質(zhì)粒能在細菌里復制擴增，來源于pEGFP-Cl載體；attB序列在鏈霉菌噬菌體(pC31整合酶的介導下可與真核細胞基因組中假attP位點(pseudo attP)發(fā)生同源重組,從而使得載體pARNG位點特異性地整合入真核細胞基因組中的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，有利于轉(zhuǎn)基因持續(xù)高效表達；多克隆位點MCS包含5個稀有的限制性內(nèi)切酶識別位點，用于目的基因元件的克隆；
[0068]CMV組成型啟動子(來源于pIRES2_AcGFPl_Nuc載體)與attB序列相連接，attB序列下游插入兩個同向的rox兀件，rox序列之間為linker-tk-1RES2-AcGFPl-Nuc_SV40polyA元件，兩個rox元件下游設有多克隆位點MCS，MCS下游為兩個同向的LoxP元件，兩個LoxP元件之間包含KanR/neoR表達元件、pUC ori和CMV啟動子。
[0069]表達載體pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL整合到真核細胞之后，經(jīng)過G418藥物篩選，獲得具有G418抗性的陽性細胞克隆，其中:位點特異性整合的重組細胞由于attB位點發(fā)生斷裂，TK基因(負篩選標記)不表達，因此在GCV藥物篩選下依然存活；而隨機整合的重組細胞attB位點不發(fā) 生斷裂，TK基因在CMV啟動子作用下持續(xù)表達，隨機整合重組細胞在GCV藥物篩選壓力下細胞死亡。在獲得位點特異性整合的重組細胞后，用Cre重組酶和Dre重組酶處理陽性細胞克隆，去除兩個同向LoxP之間的TK篩選標記、綠色熒光蛋白基因和兩個rox序列之間的neo篩選標記、CMV啟動子和其他載體骨架。
[0070]所述的第一 1xP序列、attB序列和第一 rox序列連接之后的序列如SEQ.1D.N0.1所示；
[0071]所述的第二 rox序列、MCS和第二 1xP序列連接之后的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0072]下面說明所構(gòu)建的pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL載體在篩選位點特異性整合的無抗生素篩選標記的轉(zhuǎn)基因細胞的應用，具體包括通過細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、熒光篩選的操作。
[0073]1、基于瞬時轉(zhuǎn)染細胞，對tk融合蛋白表達的檢測
[0074]I)宿主細胞的準備
[0075]將HEK293細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，將接種細胞的6孔培養(yǎng)板放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中。待細胞生長至70%-90%匯合率時進行轉(zhuǎn)染。
[0076]2)轉(zhuǎn)染復合物的準備
[0077]a.準備6個1.5mL無菌離心管,分別加入200 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基；
[0078]b.向離心管中分別加入pIRES2-AcGFPl_Nuc質(zhì)粒載體(2 μ g，陰性對照)、pORF-HSVtk-1AN 質(zhì)粒載體(2 μ g,將 HSV-1tk 開放閱讀框克隆入 pIRES2-AcGFPl_Nuc 載體)、pLARNtk-1AN-RMCSL 質(zhì)粒載體(2 μ g)、pLARGtk-1AN-RMCSL 質(zhì)粒載體(2 μ g)和pLARPtk-1AN-RMCSL 質(zhì)粒載體(2 μ g)；[0079]c.短暫輕柔渦旋(不超過10s);
[0080]d.分別加入 8 μ I X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent ；
[0081]e.短暫輕柔渦旋；
[0082]f.室溫(15°C _25tO 孵育 15_30min。
[0083]3)將轉(zhuǎn)染復合物依次逐滴加入6孔培養(yǎng)板的細胞中，分別標記IAN、HSVtk,LARNtk、LARGtk 和 LARPtk ；
[0084]4)孵育細胞36h后，將進行了不同重組方案的重組細胞進行以下檢測:
[0085]a、將重組的細胞分別用于Western Blotting檢測。收集各組細胞于ImL預冷的PBS溶液中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清，60 μ I Western及IP細胞裂解液(碧云天)重懸細胞，加入 cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche)調(diào)整至工作濃度，冰上裂解30min，將全蛋白加入上樣緩沖液，100°C變性5min，12%的SDS-PAGE凝膠電泳，然后將樣品通過半干法從SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，一抗4°C過夜孵育，洗滌，二抗孵育2.5h，洗滌后使用eECL Western Blot Kit高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒曝光。
[0086]檢測HSV-ltk: 一抗:Goat polyclonal antibody against HSV-1thymidinekinase (Santa Cruz 公司)；二抗:HRP_labeled Donkey Ant1-Goat IgG (H+L)(碧云天)。
[0087]檢測GAPDH:—抗:Rabbit polyclonal antibody against GAPDH(Sigma 公司)；二抗:HRP_labeled goat ant1-rabbit IgG (H+L)(碧云天)。
[0088]Western Blotting 檢測結(jié)果如圖 4 所不:以 Goat polyclonal antibody againstHSV-1thymidine kinase作為一抗進行We`stern blotting檢測，陰性對照IAN中未檢測到任何條帶；陽性對照HSVtk和樣品LARPtk中均檢測到大小約為40kDa的條帶；LARNtk和LARGtk中檢測到大小約為55kDa的條帶，同時檢測到較低分子量的條帶，可能為融合蛋白降解產(chǎn)物(用星狀符號標記)；GAPDH作為Western blot蛋白質(zhì)標準化的內(nèi)參。
[0089]b、將重組的細胞用于免疫熒光染色，PBS清洗三次，選用免疫染色固定液(碧云天)室溫固定IOmin, PBS振洗三次,每次5min ;用免疫染色封閉液(含Triton X-100,碧云天)室溫封閉60min,PBS振洗5min ;加入稀釋成工作濃度的Goat polyclonal antibody againstHSV-1thymidine kinase 一抗,4°C過夜孵育,次日用PBS振洗三次,每次5min ;加入稀釋成工作濃度的含有Cy3標記的驢抗山羊IgG(H+L)抗體(碧云天)，常溫避光孵育60min，孵育結(jié)束后用PBS振洗三次，每次5min ;加入稀釋成工作濃度的DAPI復染細胞核，常溫避光孵育5min，孵育結(jié)束后去除染色液，PBS清洗后熒光顯微鏡下觀察各種tk融合蛋白的細胞亞定位情況。
[0090]結(jié)果如圖5所示:陰性對照IAN中檢測不到任何熒光信號；陽性對照HSVtk中檢測到HSV-1tk基因的表達，野生型HSV-1tk主要分布于細胞質(zhì)中；樣品LARNtk、LARGtk和LARPtk中均檢測到tk融合蛋白表達，且tk融合蛋白主要分布于細胞質(zhì)中；此外，樣品LARNtk、LARGtk和LARPtk中均可觀察到綠色熒光蛋白(AcGFP1-Nuc)表達，主要分布于細胞核。
[0091]以上檢測結(jié)果證明:
[0092]將pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL (pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 或pLARPtk-1AN-RMCSL)轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，tk融合蛋白表達，且主要分布于細胞質(zhì)中。
[0093]C、將轉(zhuǎn)染后的細胞中表達綠色熒光蛋白(AcGFP1-Nuc)的重組細胞通過BDFACSAria流式細胞儀(BD公司)分選出來，并以5.0XlO3細胞/孔的密度接種于96孔板，然后加入不同濃度(0，0.01, 0.1, I, 10, and20 μ g/mL)的GCV。4天后，按照WST-1細胞增殖與毒性檢測試劑盒(碧云天)說明檢測不同tk融合蛋白對GCV的敏感程度。
[0094]結(jié)果如圖6所示:轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFPl_Nuc空載體的重組細胞對GCV不敏感，即便在10 μ g/mL高濃度的GCV作用4天后只顯示出2.76%的細胞死亡率；而轉(zhuǎn)染pORF-HSVtk-1AN、pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和 pLARPtk-1AN-RMCSL 載體的重組細胞在10 μ g/mL高濃度的GCV作用下，均顯示出細胞毒性，GCV處理4天后后幾乎所有細胞死亡；。而當GCV作用濃度減小到0.1 μ g/mL時，LARPtk組中有51.1±4.0%細胞死亡，細胞死亡率顯著高于 LARNtk (28.5 ±7.7%, P=0.001)和 LARGtk 組(34.8 ±4.5%, P=0.032)，提示其對GCV更為敏感。
[0095]3、去除隨機整合的位點特異性整合的轉(zhuǎn)基因細胞的篩選:
[0096]待細胞生長至70%_90%匯合率，使用電穿孔轉(zhuǎn)染方法對HEK293細胞進行pLARNtk-1AN-RMCSL 質(zhì)粒載體、pLARGtk-1AN-RMCSL 質(zhì)粒載體和 pLARPtk-1AN-RMCSL 質(zhì)粒載體分別同phiC31整合酶mRNA共轉(zhuǎn)染。[0097]由于通用型表達載體pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和pLARPtk-1AN-RMCSL包含G418抗性基因neoR，穩(wěn)定整合到基因組上的neoR基因的陽性細胞能夠在含有一定濃度G418的培養(yǎng)液中存活下來，而為轉(zhuǎn)染的正常細胞會被該藥物殺死。
[0098]通用型表達載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞24h后在含血清的DMEM細胞培養(yǎng)液中添加終濃度為最小致死濃度(400 μ g/ml)的G418進行篩選；以未轉(zhuǎn)染的HEK293成纖維細胞為陰性對照，其細胞培養(yǎng)液加有同樣濃度的G418。轉(zhuǎn)染細胞G418篩選12d后，對照組的細胞全部死亡；對表現(xiàn)為G418抗性的轉(zhuǎn)染陽性重組細胞在熒光顯微鏡下進行觀測，觀察熒光指示蛋白AcGFP1-Nuc是否表達。
[0099]由于attB序列連接在CMV啟動子和tk融合蛋白-1RES2-AcGFPl_Nuc閱讀框之間，因此由phiC31整合酶介導的位點特異性整合會導致attB序列斷裂，從而使得tk融合蛋白以及AcGFPl-Nuc熒光蛋白不表達，即只發(fā)生位點特異性整合的重組細胞對GCV藥物不敏感和在熒光顯微鏡下檢測不到綠色熒光；而整合反應中涉及的隨機整合則不會影響CMV-tk融合蛋白-1RES2-AcGFPl-Nuc表達，從而導致涉及隨機整合的重組細胞會在熒光顯微鏡下可檢測到綠色熒光并在GCV藥物作用下產(chǎn)生細胞毒性而死亡。
[0100]根據(jù)這一特性，設計兩種篩選方法:
[0101]a.G418 (400 ~600 μ g/mL)單一藥物篩選；
[0102]b.G418 (400 ~600 μ g/mL)和 GCV (I ~10 μ g/mL)正負雙篩選。
[0103]G418單一藥物篩選可得到熒光蛋白表達(GFP+)和熒光蛋白不表達(GFP-)的單克隆，而G418和GCV正負雙篩選只得到GFP-的單克隆。通過計數(shù)，可見:
[0104]表1不同pLAR-linker-tk-1AN-RMCSL載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞后形成克隆數(shù)對比
[0105]
【權利要求】
1.一種可去除隨機整合的位點特異性整合載體，其特征在于，包括pUC or1、attB序列和多克隆位點MCS，在attB序列上下游分別設有第一 1xP序列和第一 rox序列，CMV啟動子連接在第一 1xP序列的上游，負篩選基因與第一 rox序列相連接，負篩選基因下游還連接有內(nèi)核糖體結(jié)合位點IRES2，IRES2下游為熒光標記基因，熒光標記基因下游為MCS，MCS上下游分別設有第二 rox序列和第二 1xP序列，并且分別與第一 rox序列和第一 1xP序列方向相同，MCS下游為正篩選元件。
2.如權利要求1所述的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，其特征在于，所述的多克隆位點MCS包括以下限制性內(nèi)切酶識別位點:Pvu1、Spel、Asc1、PacI和Agel。
3.如權利要求1所述的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，其特征在于，所述的負篩選基因的開放閱讀框為HSVtk開放閱讀框，負篩選基因與第一 rox序列之間還通過linker相連接，熒光標記基因的開放閱讀框為AcGFPl-Nuc開放閱讀框，其終止子為Sv40終止子；正篩選元件為KanR/neoR表達元件。
4.如權利要求1或3所述的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，其特征在于，第一1xP序列、attB序列、第一 rox序列、I inker和tk負篩選基因在CMV啟動子作用下融合表達loxP-attB-rox-linker-tk ;突光標記基因在CMV啟動子作用下轉(zhuǎn)錄后由IRES2募集核糖體翻譯突光指示蛋白；所述的CMV啟動子為組成型Pcmv IE啟動子。
5.如權利要求3所述的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，其特征在于，所述的 loxP-attB-rox-1 inker-tk 融合基因，根據(jù) linker 不同分為三種:LAR-Null_tk、LAR-(Gly4Ser)3_tk 和 LAR_P2A_tk。
6.如權利要求1所述的可去除隨機整合的位點特異性整合載體，其特征在于，所述的第一 1xP序列、attB序列和第一 rox序列連接之后的序列如SEQ.1D.N0.1所示；· 所述的第二 rox序列、MCS和第二 1xP序列連接之后的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
7.—種可去除隨機整合的位點特異性整合載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)通過SOE-PCR方法，克隆獲得如SEQ.1D.N0.1所示的兩端含有HindIII和SalI酶切位點及第一 1xP序列和第一 rox序列的attB序列，得到LAR序列； 2)用Hindlll/Sall雙酶切LAR序列克隆入pGEM_3Z載體獲得pGEM_LAR載體 3)退火合成帶有Sall/BamHI粘性末端的linker序列，分別克隆入Sall/BamHI雙酶切的 pGEM-LAR 載體分別獲得 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR-(Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 載體； 4)分別NcoI 單酶切 pGEM-LAR-Null、pGEM-LAR-(Gly4Ser) 3 和 pGEM_LAR_P2A 載體，回收300bp左右片段，分別克隆入pORF-HSVtk載體，分別獲得pLARNtk，pLARGtk和pLARPtk載體； 5)通過SOE-PCR方法，克隆獲得兩端含有NotI酶切位點及第二1xP序列的MCS，克隆入 pIRES2-AcGFPl-Nuc 載體獲得 pIAN-MCSL ； 6)通過PCR獲得兩端帶有PvuI和SpeI酶切位點的SV40終止子和第二rox序列，克隆入 ρ IAN-MCS 載體中獲得 ρ IAN-RMCSL ； 7)NheI單酶切pLARNtk，pLARGtk和pLARPtk載體，回收1500bp左右片段，分別克隆入PIAN-RMCSL 載體，獲得 pLARNtk-1AN-RMCSL、pLARGtk-1AN-RMCSL 和 pLARPtk-1AN-RMCSL。
8.權利要求1所述的可去除隨機整合的位點特異性整合載體在哺乳動物細胞篩選中提供剔除隨機整合重組細胞而直接篩選出假attP位點特異整合的重組細胞的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，可去除隨機整合的位點特異性整合載體在進行細胞轉(zhuǎn)染之后，進行藥物篩選，獲得表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的重組細胞；然后對其進行Cre重組剪切1xP序列和Dre重組剪切rox序列的處理，獲得假attP位點特異整合的無抗生素篩選標記無質(zhì)粒骨架的重組細胞。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的Cre重組剪切1xP序列和Dre重組剪切rox序列的處理為: 對藥物篩選后的重組細胞進行包含Cre元件和Dre元件的表達載體的轉(zhuǎn)染,或者將其在含有連接有穿膜肽的Cre重組酶和Dre重組酶的環(huán)境中進行孵育。
【文檔編號】C12N15/85GK103820494SQ201410073055
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權日:2014年2月28日
【發(fā)明者】張涌, 余源, 李仲夏, 佟琪, 王易之, 王勇勝, 劉軍, 權富生, 郭澤坤 申請人:西北農(nóng)林科技大學, 楊凌科元克隆股份有限公司