Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記復合擴增試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記復合擴增試劑盒，該系統(tǒng)可以同時檢測12個X染色體基因座，每個基因座的擴增片段均小于250bp；本發(fā)明將12個基因座分為4組，共涉及5種顏色的熒光標記；12個mini-X-STR基因座的熒光標記復合擴增檢驗體系方法簡單、靈敏度高、結(jié)果可靠、穩(wěn)定，可以解決祖母-孫女、姐妹或更遠的親緣關系的親權鑒定，以及疑難降解生物檢材等方面實際辦案的需要。本復擴系統(tǒng)整個PCR程序控制在40-50min之間，可以達到快速檢測的效果。
【專利說明】Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記復合擴增試劑 合 品

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明公開一種Mini-X-STR和Amelogenin基因座突光標記復合擴增試劑盒，共 包括13個位點的熒光標記快速復合擴增檢驗，具體是涉及X染色體基因座的五色熒光標記 快速復合擴增系統(tǒng)，可以解決祖母-孫女、姐妹或更遠的親緣關系的親權鑒定，以及疑難降 解生物檢材等方面實際辦案的需要。

【背景技術】
[0002] 在人類的23對染色體中，其中一對為性染色體即X和Y染色體。在正常的體細胞 中，女性有一對X染色體，核型為46XX ;而男性只有一條X染色體，以半合子的狀態(tài)存在，核 型為46XY。性染色體在減數(shù)分裂中，與常染體一樣，同樣會發(fā)生分離，分配到配子中，在受精 卵中又組合成XX或XY染色體對。含XX染色體的受精卵發(fā)育成女孩，含XY染色體的受精 卵發(fā)育男孩。
[0003] 女性的一對X染色體在卵子的生成過程中可以像常染色體那樣發(fā)生互換和重組。 但是在男性個體生成精子的過程中，X和Y染色體并不能隨意互換和重組。非重組區(qū)的基 因以性連鎖的方式遺傳。X染色體特異性的基因以X連鎖的方式遺傳，即X連鎖遺傳。父親 的X染色體基因只遺傳且必須遺傳給女兒，而母親的X染色體基因既可以遺傳給女兒也可 以遺傳給兒子。X染色體這種獨特的遺傳方式，使得X染色體的遺傳標記在親權鑒定中具有 特殊的應用價值，在一些缺失雙親的鑒定中，如姐妹的認定，更是有著常染色體遺傳標記難 以比擬的優(yōu)點。
[0004] 隨著STR復合擴技術的發(fā)展，X染色體STR的復合擴增也在發(fā)展。從最初的復 合擴增銀染法到熒光標記引物復合擴增，現(xiàn)在已報道最多可以同時復合擴增17、19個 X-STR。并且國外有了檢測X-STR的復合擴增的商品化試劑盒，其最多可以復合擴增12個 X_STR(http://www. biotype· de/fileadmin/user/Flyer/Mentype_ArgusX-12· pdf)。國內(nèi)也 出現(xiàn)了基點認知17個X-STR。但Qiagen的ArgusX-12最大擴增子在375bp不適于降解檢 材的分型，且無法做到法醫(yī)對快速的要求?；c認知最大片段達到330bp，且無法做到快速 檢測。
[0005] 隨著STR技術在法庭科學中的逐漸廣泛應用，越來越多的微量疑難生物檢材（如 各類接觸性脫落細胞、汗斑、）被提取送檢要求進行DNA檢驗，這些疑難檢材往往存在量微、 腐敗降解或含有較多抑制因素的等問題，采用常規(guī)的STR技術檢驗，尤其是大片段的基因 座，經(jīng)常不能擴增成功。本發(fā)明建立的mini-STR基因座位復合擴增體系，所有基因座擴增 片段均不大于236bp，其中DXS7423基因座擴增片段為187-207bp，DXS10162基因座擴增片 段為196-236bp，其余10個基因座擴增片段均不大于205bp，因此可以在一定程度上克服微 量、因降解導致的小片段檢材、含擴增抑制劑等常見難題，容易擴增成功，從而提高困難生 物檢材的檢驗成功率。
[0006] 目前的STR分型技術，往往包括樣本檢材的DNA提取、PCR擴增和分型檢測三項主 要操作步驟，獲得一個樣本的最終分型結(jié)果往往需要8個小時以上?？s短樣本DNA檢驗時 間，在實際檢案中將有利于快速鎖定犯罪嫌疑人，或排除無辜人員，在案件偵破過程中具有 重要意義，是法庭科學DNA分型技術發(fā)展的必然方向。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術問題是X-STR基因座檢測過程中檢測時間時、擴增片段 大、在小片段檢材上檢測效果不好，提供了一種Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記 復合擴增試劑盒。
[0008] 技術方案：
[0009] Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，包括有用于擴增如下13 個基因座的引物：DXS7133、DXS8378、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS10159、GATA165B12、 DXS101、DXS7423、GATA31E08、DXS10164、DXS10162、Amelogenin。
[0010] 上述的引物以及引物在擴增體系中優(yōu)選濃度如表1所示：
[0011] 表1優(yōu)選引物序列以及其在擴增體系中的優(yōu)選濃度 [0012]

【權利要求】
1. Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，其特征在于，包括有用于 擴增如下 13 個基因座的引物：DXS7133、DXS8378、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS10159、 GATA165B12、DXS101、DXS7423、GATA31E08、DXS10164、DXS10162、Amelogenin。
2. 根據(jù)權利要求1所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，其 特征在于：上述的試劑盒中的引物是在同一個擴增體系中進行復合擴增的。
3. 根據(jù)權利要求2所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，其 特征在于：所述的引物的序列如下所示：DXS7133, SEQ ID NO. 1?2 ;DXS8378, SEQ ID NO. 3 ?4;DXS981，SEQ ID NO. 5 ?6;DXS7424，SEQ ID NO. 7 ?8;DXS6789，SEQ ID NO. 9 ? 10;DXS10159，SEQIDN0.11?12;GATA165B12，SEQIDN0.13?14;DXS101，SEQIDN0. 15 ?16 ;DXS7423, SEQ ID NO. 17 ?18 ;DATA31E08, SEQ ID NO. 19 ?20 ;DXS10164, SEQ ID NO. 21 ?22 ;DXS10162, SEQ ID NO. 23 ?24 ;Amelogenin，SEQ ID NO. 25 ?26。
4. 根據(jù)權利要求2所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，其 特征在于：擴增體系的組成如下所示：Buffer，11 μ L ;基因組DNA，0. 1?10 μ 1，DNA的含 量為0. 04?5ng ;引物混合物，5. 0 μ L ;sdH20,補足至25. 0μ L ;其中，所述的Buffer的組 成是：MgCl2 7. 5mM、Tris-HCl buffer 125mM、KCl 125mM、dNTPs 7.5m M、BSA 2mg/ml、Taq 酶0.5 μ L，其余為水。
5. 根據(jù)權利要求2所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，其 特征在于：每個基因座對應的引物中至少有一個引物的5'端進行熒光染料標記。
6. 根據(jù)權利要求5所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，其 特征在于：每個基因座對應的引物之間為分組標記的，分組是：DXS7133、DXS8378、DXS981 為第一組；DXS7424、DXS6789、DXS10159 為第二組；GATA165B12、DXS101、DXS7423 為第三組； GATA31E08、DXS10164 和 DXS10162 為第四組。
7. 根據(jù)權利要求6所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，其 特征在于：各組采用的熒光染料標記物選自6-FAM、HEX、TAMRA或R0X，且每組的標記色都不 相同。
8. 根據(jù)權利要求2所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座熒光標記擴增試劑盒，其 特征在于：所述的試劑盒的擴增程序如下：初始變性，95°C，2分鐘；熱循環(huán)，94°C 5秒，60°C 15秒，72°C 10秒，共27?30個循環(huán)；終延伸，72°C，6分鐘；保溫，4°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK104120183SQ201410359425
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權日:2014年7月25日
【發(fā)明者】吳微微, 郝宏蕾, 呂德堅, 周懷谷, 蘇艷佳, 任文彥 申請人:浙江省公安物證鑒定中心