一種規(guī)?；苽潴豺嗑諆?nèi)酯化學對照品的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種規(guī)?；苽潴豺嗑諆?nèi)酯化學對照品的制備新工藝。通過蟛蜞菊內(nèi)酯穩(wěn)定性及制備工藝流線化優(yōu)化，采用自制大型中壓或減壓硅膠柱色譜純化，批量獲取純度大于98%的蟛蜞菊內(nèi)酯化學對照品，其規(guī)?？蛇_十克級。
【專利說明】一種規(guī)模化制備蟛蜞菊內(nèi)酯化學對照品的方法
[0001 ] 【技術領域】本發(fā)明涉及一種規(guī)?；苽渑蝌嗑諆?nèi)酯(Wedelolactone )化學對照品的制備新工藝。主要包括乙酸乙酯萃取、自制大型中壓或減壓硅膠柱色譜純化、重結晶三個步驟。

【背景技術】
[0002]蟛蜞菊內(nèi)酯為香豆素類化合物，具有保肝、抗炎、增強免疫等功效，中國藥典(2010版)將其列為中藥墨旱蓮的新增定量指標成分，實際應用缺口巨大，加上該對照品分離純化步驟繁瑣，均導致該對照品價格昂貴(市售1000-1500元，20mg/支)。因此批量獲取大量對照品，不僅能滿足墨旱蓮相關制品的質(zhì)量控制所需，而且對于深入研究其作用機制具有重要意義。
[0003]目前，從墨旱蓮中制備蟛蜞菊內(nèi)酯的報道多為實驗室規(guī)模，步驟較繁瑣，如張金生等(藥學學報，36 (I): 34-37，2011)報道采用石油醚-乙醚-甲醇或95%甲醇滲濾提取、甲醇溶解除雜或乙酸乙酯萃取除雜、硅膠柱分離獲取蟛蜞菊內(nèi)酯，其中分離洗脫劑采用甲苯-丙酮-醋酸(6:8:1)或二氯甲烷-甲醇-水(14:9:4下層);原紅霞等(中國實驗方劑學雜志，17 (16):103-105，2011)報道采用95%乙醇滲濾提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱石油醚-乙酸乙酯梯度分離、sephadex LH-20純化獲取膨蜞菊內(nèi)酯；Wagner等(Ger.DE3525363,德國專利)采用甲醇浸泡提取、乙酸乙酯萃取、C18反相HPLC梯度洗脫制備蟛蜞菊內(nèi)酯，Kokai等(JP83228353,日本專利)采用水回流提取，丁醇-水(1:1)逆流-逆流分布、SephadexLH-20，該類文獻或采用含苯及二氯甲烷毒性較大的洗脫溶劑，或采用Sephadex LH_20、C18價格昂貴的分離填料，且?guī)缀蹙捎梅浅：臅r的滲濾或浸泡提取，無法進行工業(yè)規(guī)模放大生產(chǎn)，對照品產(chǎn)量無法滿足實際應用所需。
[0004]本發(fā)明通過系統(tǒng)提取、分離工藝優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)雖然蟛蜞菊內(nèi)酯結構中含有一個內(nèi)酯鍵和三個酚羥基(圖1)，結構不太穩(wěn)定，但用含醇量70%以上的乙醇提取，50°C減壓濃縮時其含量未見明顯變化，提示可以用回流提取代替滲濾提取，大大加快提取效率；萃取時熱水的溫度不大于40°C，蟛蜞菊內(nèi)酯可以較好地保持穩(wěn)定。硅膠柱分離時，采用柱床緊密、柱效較高的中壓或減壓層析柱進行分離，不僅可以獲得更好的分離效果，且大大加快了分離進度；采用自制多種不銹鋼柱作為層析柱，可方便加工為任意所需大直徑柱，顯著提高分離通量；同時通過仔細優(yōu)化洗脫溶劑，最終選擇在石油醚-乙酸乙酯混合流動相中添加適量醋酸，選用該洗脫溶劑，可實現(xiàn)硅膠柱上的等度洗脫且回收率較高，對于批量制備非常有利，因為只需調(diào)配一種比例的洗脫劑，大大降低了溶劑回收調(diào)配的難度。采用系統(tǒng)優(yōu)化的本制備工藝，可實現(xiàn)蟛蜞菊內(nèi)酯的規(guī)模化制備，其純度在98%以上，制備規(guī)?？蛇_10克級以上。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種工藝簡單、易規(guī)?；闹苽湫路椒?，可以以墨旱蓮醇提物為原料，經(jīng)乙酸乙酯萃取、中壓或減壓硅膠柱色譜純化、重結晶三個步驟，即可獲得純度大于98%的蟛蜞菊內(nèi)酯化學對照品，其規(guī)?？蛇_十克級。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案:
[0007]I)乙酸乙酯萃取:
[0008]墨旱蓮醇提物，或墨旱蓮藥材經(jīng)體積分數(shù)不小于70%的乙醇提取后減壓干燥獲得醇提物，加入提取物重量3-5倍體積的水，加熱使其溶解，溫度控制在30°C -40°C ;加入提取物重量1-2倍體積的乙酸乙酯萃取，重復萃取2-4次，合并萃取液，減壓濃縮至醇提物重量的1/3~1/6體積(ml/g)，然后拌入等比例重量(g/ml)的硅膠，干燥獲得乙酸乙酯萃取物干粉；
[0009]2)中壓或減壓硅膠柱色譜純化:
[0010]取徑高比為2~12.5的不銹鋼柱作為層析柱，裝入萃取物干粉1-2倍重量的硅膠作為層析分離硅膠，干法上樣；用石油醚:乙酸乙酯:醋酸(體積比8:2:1-6:4:1)混合溶劑洗脫，中壓柱壓力0.2-0.3MPa，減壓柱壓力在-0.08-0.09MPa，薄層色譜檢測，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(體積比3:7:0.5-5:5:0.5)為展開劑，收集Rf值在0.40-0.48的洗脫液，減壓濃縮，析出淺白色沉淀為蟛蜞菊內(nèi)酯粗品；
[0011]3)重結晶:
[0012]上述對照品粗品用乙酸乙酯或甲醇溶解，-4°C-10°C以下放置析晶，即可獲得純度大于98%的蟛蜞菊內(nèi)酯對照品，其外觀為白色粉末。
[0013]所述步驟I)中拌樣硅膠一定采用100-200目硅膠，否則上樣硅膠比層析硅膠顆粒細，將在加壓和減壓中下沉，嚴重影響分離效果。
[0014]所述步驟2)的具體參數(shù)為，層析分離硅膠為100-200目或200-300目，裝柱前不不需干燥活化處理，如將硅膠活化，其吸附能力太強，將大大降低對照品的回收率。洗脫劑中的石油醚沸程為60-90°C，洗脫劑洗脫控制在8~12倍柱體積，流速為100-150ml/min。
[0015]所述步驟3)的具體過程為，重結晶時所用乙酸乙酯為分析純重蒸溶劑，甲醇為色譜級，母液需過濾后再行放置結晶。
[0016]以本發(fā)明從墨旱蓮中分離蟛蜞菊內(nèi)酯化學對照品具有如下優(yōu)點和進步:
[0017]I)本發(fā)明工藝簡單，便于流線化生產(chǎn)
[0018]本發(fā)明采用墨旱蓮醇物經(jīng)乙酸乙酯萃取，萃取液合并濃縮時不需濃縮成稠浸膏即可直接加入100-200目的硅膠拌樣，通風櫥揮干即可得萃取物干粉，適量研磨后即可作為第二步硅膠柱層析的待分離樣品。第二步硅膠柱層析時采用等度洗脫溶劑，獲得目標流份后通過減壓干燥，一方面可獲得蟛蜞菊內(nèi)酯粗品，一方面回收溶劑便于重新調(diào)配循環(huán)使用，減壓干燥時仍不需抽干溶劑，濃縮至小體積即可過濾放置析晶，獲取蟛蜞菊內(nèi)酯粗品，隨后采用重蒸乙酸乙酯或色譜純甲醇溶解過濾即可進行重結晶。三個分離步驟銜接的非常好，非常便于流線化生產(chǎn)。相較文獻分離工藝每個步驟均需濃縮至干或稠浸膏，大大提高了分離效率。
[0019]2)本發(fā)明采用的技術手段非常適宜放大進行規(guī)模化生產(chǎn)。
[0020]本制備工藝對原料要求不高，工藝采用常見的70%乙醇提取，而非文獻中采用的滲濾及浸泡操作，非常易于批量備料；硅膠柱層析采用不銹鋼中壓或減壓層析，不但克服了傳統(tǒng)玻璃中壓柱的壓力限制，同時不銹鋼柱易于加工，可方便加工至所需的大直徑柱，達到生產(chǎn)所需的大規(guī)模及高通量；硅膠填料便宜易得，所用溶劑僅涉及石油醚、乙酸乙酯、醋酸等常規(guī)溶劑，成本價廉。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1蟛蜞菊內(nèi)酯的結構；
[0022]圖2硅膠柱層析后獲得的蟛蜞菊內(nèi)酯粗品的HPLC分析圖譜(351nm)；
[0023]圖3蟛蜞菊內(nèi)酯對照品重結晶后的HPLC分析圖譜(351nm)；
[0024]圖4蟛蜞菊內(nèi)酯的ES1-MS負離子質(zhì)譜圖譜；
[0025]圖5蟛蜞菊內(nèi)酯的紫外色譜圖。

【具體實施方式】
[0026]現(xiàn)結合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明，實施例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。
[0027]實施例1
[0028]I)乙酸乙酯萃取:
[0029]墨旱蓮醇取物3kg (四川省中醫(yī)藥科學院提供)，加入15L水，40°C加熱使其溶解，加入4.5L乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至500ml，拌入500克100-200目的硅膠，拌勻，通風櫥晾干，研磨后備用。
[0030]2)中壓硅膠柱色譜純化:
[0031]取(pScmx I OOcm的不銹鋼柱作為中壓層析柱，裝入1.5kgi00-200目硅膠作為分離硅膠，將乙酸乙酯萃取物拌樣粉末均勻裝入柱頭，裝填緊密；采用上海同田TBP2H10恒流泵作為中壓泵，石油醚:乙酸乙酯:醋酸(7:3:1)混合溶劑作為洗脫劑，流速控制在150ml/min，壓力約0.3MPa,洗脫10倍柱體積，約45L ;薄層色譜檢測，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(4:6:0.5)為展開劑，紫外燈365nm處檢視熒光斑點，收集Rf值為0.46的洗脫液，濃縮，析出灰白色沉淀7.2g (蟛蜞菊內(nèi)酯粗品)，其純度約為70% (圖2);
[0032]3)重結晶:
[0033]上述蟛蜞菊內(nèi)酯粗品以色譜甲醇加熱溶解(<40°C)，用0.45微米的微孔濾膜抽濾，清液低溫放置(冬季室溫約10°c )，24h后析出白色沉淀，過濾，可得蟛蜞菊內(nèi)酯純品，母液可繼續(xù)濃縮放置結晶，不同批次單獨采用HPLC檢測，合并純度大于98%的批次作為蟛蜞菊內(nèi)酯對照品，最終獲取蟛蜞菊內(nèi)酯對照品6.1gJ^HPLC歸一化檢測，其純度為98.7% (圖3)
[0034]上述對照品的UV、MS均和文獻相一致(圖4，5 )。
[0035]實施例2
[0036]I)乙酸乙酯萃取:
[0037]墨旱蓮藥材40kg，采用70%乙醇回流提取，第一次480L，第二次400L，各提取1.5小時，合并兩次提取液，得醇提物浸膏約7kg ;加入35L水，40°C加熱使其溶解，加入10.5L乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至2L，拌入2kg100-200目的硅膠，拌勻，通風櫥晾干，研磨后備用。
[0038]2)減壓硅膠柱色譜純化:
[0039]取cp20cmx40cm的不銹鋼柱作為減壓層析柱，下配2.5L抽濾瓶作為收集器；裝Λ 4.2kg200-300目硅膠作為分離硅膠，將乙酸乙酯萃取物拌樣粉末均勻裝入柱頭，裝填緊密；采用河南鞏義予華牌循環(huán)真空泵作為減壓泵，壓力約在-0.09MPa，石油醚:乙酸乙酯:醋酸(8:2:1)混合溶劑作為洗脫劑，洗脫12倍柱體積，約180L;薄層色譜檢測，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(5:5:0.5)為展開劑，紫外燈365nm處檢視熒光斑點，收集Rf值為0.40的洗脫液，濃縮，析出灰白色沉淀15.3g (蟛蜞菊內(nèi)酯粗品)，其純度約為65% ；
[0040]3)重結晶:
[0041]上述蟛蜞菊內(nèi)酯粗品以重蒸乙酸乙酯加熱溶解(<40°C)，用0.45微米的微孔濾膜抽濾，清液低溫放置(冬季室溫約10°c )，24h后析出白色沉淀，過濾，可得蟛蜞菊內(nèi)酯純品，同實施例1類似步驟合并純度大于98%的批次作為蟛蜞菊內(nèi)酯對照品，最終獲取蟛蜞菊內(nèi)酯對照品10.9g，經(jīng)HPLC歸一化檢測，其純度為98.5% ；
[0042]實施例3
[0043]I)乙酸乙酯萃取:
[0044]墨旱蓮醇取物Ikg (四川省中醫(yī)藥科學院提供)，加入5L水，40°C加熱使其溶解，加入1.5L乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至200ml，拌入200克100-200目的硅膠，拌勻，通風櫥晾干 ，研磨后備用。
[0045]2)中壓硅膠柱色譜純化:
[0046]取(p8cmx I OOcm的不銹鋼柱作為中壓層析柱，裝入750克100-200目硅膠作為分離硅膠，將乙酸乙酯萃取物拌樣粉末均勻裝入柱頭，裝填緊密；采用上海同田TBP2H10恒流泵作為中壓泵，石油醚:乙酸乙酯:醋酸(6:4:1)混合溶劑作為洗脫劑，流速控制在10ml/min，壓力約0.2MPa,洗脫8倍柱體積，約24L ;薄層色譜檢測，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(3:7:0.5)為展開劑，紫外燈365nm處檢視熒光斑點，收集Rf值為0.48的洗脫液，濃縮，析出灰白色沉淀2.5g (蟛蜞菊內(nèi)酯粗品)，其純度約為75% ；
[0047]3)重結晶:
[0048]上述蟛蜞菊內(nèi)酯粗品以色譜甲醇加熱溶解(<40°C)，用0.22微米的微孔濾膜抽濾，清液低溫放置(冬季室溫約10°c )，24h后析出白色沉淀，過濾，可得蟛蜞菊內(nèi)酯純品，同實施例1合并純度大于98%的批次作為蟛蜞菊內(nèi)酯對照品，最終獲取蟛蜞菊內(nèi)酯對照品
1.9g，經(jīng)HPLC歸一化檢測，其純度為99.0%。
【權利要求】
1.一種規(guī)模化制備蟛蜞菊內(nèi)酯化學對照品的方法，其特征在于:墨旱蓮醇提物，經(jīng)乙酸乙酯萃取、中壓或減壓硅膠柱色譜純化、重結晶三個步驟，批量獲取純度大于98%的蟛蜞菊內(nèi)酯對照品；具體步驟如下: 1)乙酸乙酯萃取: 墨旱蓮醇提物，或墨旱蓮藥材經(jīng)體積分數(shù)不小于70%的乙醇提取后減壓干燥獲得醇提物，加入提取物重量3-5倍體積的水，加熱使其溶解，溫度控制在30°C -40°C ;加入提取物重量1-2倍體積的乙酸乙酯萃取，重復萃取2-4次，合并萃取液，減壓濃縮至醇提物重量的1/3~1/6體積(ml/g，濃縮液體積/醇提物重量)，然后拌入等比例重量(g/ml，硅膠重量/濃縮液體積)的硅膠，干燥獲得乙酸乙酯萃取物干粉； 2)中壓或減壓硅膠柱色譜純化: 取徑高比為2~12.5的不銹鋼柱作為層析柱，裝入萃取物干粉1-2倍重量的硅膠作為層析分離硅膠，干法上樣；用石油醚:乙酸乙酯:醋酸(體積比8:2:1-6:4:1)混合溶劑洗脫，中壓柱壓力0.2-0.3MPa，減壓柱壓力在-0.08-0.09MPa，薄層色譜檢測，以石油醚:乙酸乙酯:醋酸(體積比3:7:0.5-5:5:0.5)為展開劑，收集Rf值在0.40-0.48的洗脫液，減壓濃縮，析出淺白色沉淀為蟛蜞菊內(nèi)酯粗品； 3)重結晶: 上述對照品粗品用乙酸乙酯或甲醇溶解，-4°C -10°C放置析晶，即可獲得純度大于98%的蟛蜞菊內(nèi)酯對照品，其外觀為白色粉末。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)中拌樣硅膠為100-200目。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)中層析分離硅膠為100-200目或200-300目，裝柱前不需干燥活化處理。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)中洗脫劑洗脫8~12倍柱體積。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)中重結晶時所用乙酸乙酯為分析純重蒸溶劑，甲醇為色譜級，溶解后的母液需過濾后濾液再行放置結晶。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:過濾采用的微孔濾膜為0.22-0.45微米的微孔濾膜。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:墨旱蓮醇提物制備過程為，墨旱蓮藥材，加入藥材重量10-12倍體積的乙醇溶液，其中乙醇的體積分數(shù)為70%-100%，回流提取2-3次，每次1-2小時，合并提取液，減壓干燥即可得墨旱蓮醇提物。
【文檔編號】C07D493/04GK104045648SQ201310082363
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權日:2013年3月13日
【發(fā)明者】肖紅斌, 王莉, 彭杰, 程孟春 申請人:中國科學院大連化學物理研究所