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墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):1297658閱讀:412來(lái)源:國(guó)知局
墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中藥材墨旱蓮提取物作為治療肺纖維化的藥物用途。墨旱蓮提取物由中藥材墨旱蓮經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取等方法制備而成,墨旱蓮提取物得率10.01-15.05%,其中總皂苷含量在53.24-56.1%,旱蓮苷A含量為6.54-11.3%,蟛蜞菊內(nèi)酯的含量1.46-3.56%。本發(fā)明所得到的中藥材墨旱蓮提取物可用于治療肺纖維化等醫(yī)藥用途,墨旱蓮提取物可抑制反映肺組織損傷的NO、MDA含量,降低反映膠原沉積的HYP含量和抑制肺組織中致纖維化的細(xì)胞因子TGF-β1表達(dá)從而干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠纖維化程度。
【專利說(shuō)明】墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥材墨旱蓮提取物作為治療肺纖維化的藥物用途。
【背景技術(shù)】
[0002]肺纖維化(Pulmonary fibrosis,PF)是多種肺部疾病或肺損傷發(fā)展到晚期的一種常見(jiàn)的病理變化,目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要包括上皮細(xì)胞和基底膜的破壞、成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞的聚集和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量沉積。其特征是肺間質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)過(guò)度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積而正常肺組織結(jié)構(gòu)被破壞。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,慢性炎癥是成纖維細(xì)胞增殖和肺部結(jié)構(gòu)病理改變的主要因素,但抗炎治療效果不明顯,大量研究顯示成纖維細(xì)胞增殖與纖維化形成可以獨(dú)立于炎癥而發(fā)生,提示纖維化的病變不僅僅是炎癥的繼發(fā)結(jié)果。目前為止,抗炎及免疫調(diào)節(jié)藥物治療肺纖維化效果不好,傳統(tǒng)的治療藥物仍以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑/細(xì)胞毒藥物為主,如皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤或環(huán)磷酰胺無(wú)顯著效果,副作用大,肺移植是肺纖維化終末階段的唯一有效治療方法,但在臨床廣泛應(yīng)用受到經(jīng)濟(jì)、供體缺乏等限制 ,因此尋找新的治療方法迫在眉睫。
[0003]有關(guān)肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究早期主要集中在肺泡巨噬細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子,但目前已確定肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖及通過(guò)釋放大量介質(zhì)而產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起決定性作用,共同特征是體內(nèi)膠原代謝的失衡,在肺纖維化早期主要以III型膠原增加為主,晚期是以I型膠原增加為主。在肺纖維化過(guò)程中,肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖和分化作用受多種因子調(diào)控,除成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM外,受損的肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞也產(chǎn)生ECM,肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)病過(guò)程中肺組織損傷修復(fù)和再生的關(guān)鍵參與者,因此,研究藥物抑制成纖維細(xì)胞的增殖對(duì)于防止肺纖維化有重要的意義,
[0004]多數(shù)肺纖維化病人的組織中可以觀察到炎癥與纖維化并存,提示炎癥反應(yīng)參與了肺纖維化的形成,肺泡炎癥和纖維化是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程,炎癥反應(yīng)是有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng),在某些情況下,炎癥損傷持續(xù)并引起纖維化,在肺纖維化發(fā)生過(guò)程中,TGF-β、TOGF、FGF、VEGF等幾個(gè)細(xì)胞因子起到關(guān)鍵性作用,可以作為研究和治療的關(guān)鍵性靶點(diǎn)[1]。細(xì)胞因子之間及其與炎癥細(xì)胞、肺臟組織細(xì)胞之間可以相互作用發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)加重肺組織炎癥或免疫損傷,刺激纖維母細(xì)胞分裂增殖,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積,肺纖維化的發(fā)生是以細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡導(dǎo)致大量趨化因子釋放從而引起炎性細(xì)胞聚集、活化為基礎(chǔ)。細(xì)胞因子在肺纖維化中的作用是目前研究的熱點(diǎn),采用抑制促纖維化的細(xì)胞因子為纖維化的治療提供了一條新的有效途徑。
[0005]各種因素作用于肺臟,直接或間接產(chǎn)生氧自由基,損傷肺組織,使MDA產(chǎn)生增多,一方面加重肺組織損傷,另一方面又通過(guò)各種生長(zhǎng)因子,促進(jìn)損傷后的修復(fù),使膠原產(chǎn)生增多,最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。MDA為機(jī)體內(nèi)氧自由基,攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,并因此形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物,其含量的變化反映了機(jī)體組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。羥脯氨酸(HYP)是由結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸,對(duì)膠原蛋白的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用,膠原是唯一含羥脯氨酸較多的蛋白質(zhì)。在肺纖維化病人肺組織中TGF-β I表達(dá)上調(diào),而氧化應(yīng)激可以直接導(dǎo)致肺纖維化時(shí)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β I增多,TGF-β I是一個(gè)具有多重功能的細(xì)胞因子,通過(guò)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及肺纖維上皮細(xì)胞分化等作用來(lái)調(diào)控組織形成和分化,是一種強(qiáng)力的致纖維化因子[2],可以刺激細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)組分,還可改變基質(zhì)降解酶成分的活性,直接加劇ECM的沉積[3],肺纖維化機(jī)制中TGF-β I/Smad為經(jīng)典信號(hào)通路,TGF-β I先與受體結(jié)合發(fā)生磷酸化,結(jié)合激活Smad2/3、與胞漿內(nèi)Smad4結(jié)合,入核與核內(nèi)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)調(diào)控基因的表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞增殖、及致纖維化作用[4]。因此,通過(guò)測(cè)定肺組織羥脯氨酸能確定組織中膠原的含量,TGF-β I表達(dá)降低可顯示藥物干預(yù)肺纖維化的可能作用機(jī)制,即藥物不是通過(guò)抗炎而改善肺纖維程度,是通過(guò)降低組織中TGF-β I的表達(dá),激活TGF-β 1/Smad通路而發(fā)揮其干預(yù)作用。在眾多細(xì)胞因子中TGF-β I被認(rèn)為是肺纖維化形成與發(fā)展的“誘導(dǎo)劑”和“啟動(dòng)子”,TGF-β I可促進(jìn)成纖維細(xì)胞(FB)的增殖、分化及分泌的過(guò)程,繼而促進(jìn)膠原蛋白等ECM成分在肺間質(zhì)和肺泡中過(guò)度積聚,從而最終引起肺間質(zhì)纖維化。博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化是經(jīng)典的篩選抗肺纖維化藥物的體內(nèi)藥效模型,博萊霉素可引起體內(nèi)氧化與抗氧化失衡,氧自由基產(chǎn)生增多,從而啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),降低其TGF-β I含量可減緩小鼠肺纖維化進(jìn)程。 [0006]中藥材墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrata L.的地上部分,自上個(gè)世紀(jì)80年代國(guó)內(nèi)外學(xué)者該植物化學(xué)成分進(jìn)行研究,分離鑒定噻吩、皂苷、香豆素草醚、黃酮等類型成分。《中國(guó)藥典》(2010版)中收載蟛蜞菊內(nèi)酯、旱蓮苷A作為該藥材的定性、定量指標(biāo)性成分。墨旱蓮提取物有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、止血、升白、保肝、增加冠流等作用;注射旱蓮草提取液能使常壓缺氧情況下小鼠的生命明顯延長(zhǎng),亦能提高在減壓和缺氧環(huán)境下的小鼠存活率;旱蓮草擴(kuò)張冠狀血管、增加冠脈流量和增加耐缺氧能力的作用出現(xiàn)快,維持時(shí)間長(zhǎng),毒性小;能提高減壓缺氧情況下小鼠的存活率。近幾年墨旱蓮的藥效研究主要集中于保肝、肝細(xì)胞的再生[5’6]、抗癌[7’8]、非特異性免疫增強(qiáng)[9]、改善骨質(zhì)疏松[1°]、腦神經(jīng)保護(hù)[11]等作用。分子水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)化合物膨蜞菊內(nèi)酯(wedelolactone)是ATP酶抑制劑[12’13’13]及異構(gòu)酶II抑制劑[15],對(duì)NF-KB、IKK、capaSSe-ll等轉(zhuǎn)錄因子均具有抑制作用[16~19],具有保肝、抗癌、抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移[2°]、體外抑制人肝星狀細(xì)胞LX-2的纖維化[21]、減毒[22]等作用。
[0007]目如,有關(guān)墨旱蓮提取物等相關(guān)專利有近20余篇:主要集中在提取的制備方法(201010214799.6,201110184589.1,200610201098.2,201010603861.0,201110187513.4)、總皂苷的制備方法(200810031092.4,201310002410.5)、在保肝、降血脂(201110310181.4)以及在洗發(fā)膏、煙草香料等方面的應(yīng)用。尚未見(jiàn)報(bào)道墨旱蓮藥材的改善肺纖維化作用及其在治療此疾病藥物中用途。
[0008]【參考文獻(xiàn)】
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[0032]本項(xiàng)發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)墨旱蓮提取物可用于治療肺纖維化病癥的醫(yī)藥新用途。
[0033]技術(shù)方案
[0034]墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0035]所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用,其特征在于按質(zhì)量百分比計(jì),所述的墨旱蓮提取物中總皂苷含量為53.24-56.1%,提取物中旱蓮苷A含量為6.54-11.30%,蟛蜞菊內(nèi)酯含量為1.46-3.56%。
[0036]所述的墨旱蓮提取物經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取方法制備而成,所述的墨旱蓮提取物得率 10.01-15.05%o
[0037]其中所述的墨旱蓮提取物由如下方法制得:墨旱蓮干燥地上部分,以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次,每次2h,過(guò)濾,合并提取液,減壓去除乙醇,得總浸膏;將總浸膏懸于水中,以石油醚等倍量萃取,用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物及水部位,同時(shí)將乙酸乙酯部位通過(guò)HP-20吸附樹(shù)脂柱色譜進(jìn)行分離,分別獲得水洗脫部位、30%乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位、90%乙醇洗脫部位;其中60%乙醇洗脫部位、70%乙醇洗脫部位經(jīng)減壓干燥,以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物。
[0038]具體來(lái)說(shuō):
[0039]本項(xiàng)發(fā)明是經(jīng)過(guò)研究證明墨旱蓮提取物可改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型,并采用分光光度法對(duì)墨旱蓮提取物中總皂苷含量,采用HPLC法對(duì)提取物中2種單體物質(zhì)蟛蜞菊內(nèi)酯和旱蓮苷A的含量進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)觀察HE、Masson染色后肺組織病理切片、測(cè)定各組肺臟系數(shù)、在不同時(shí)期檢測(cè)各組小鼠肺組織中NO、MDA、HYP、TGF-β I含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:本發(fā)明中的墨旱蓮提取物可改善模型小鼠肺組織纖維化程度,降低模型肺組織膠原沉積,顯示對(duì)小鼠肺纖維化模型的干預(yù)作用,可用于治療肺纖維化疾病的新醫(yī)藥用途。
[0040]有益效果
[0041]1、肺纖維化是多種肺部疾病或肺損傷發(fā)展到晚期的一種常見(jiàn)的病理變化,多數(shù)研究認(rèn)為糖皮質(zhì)激素治療肺纖維化有效率小于30%,患者生存率無(wú)明顯改變,目前尚無(wú)明確治療藥物。本發(fā)明墨旱蓮是常用中藥材。中醫(yī)認(rèn)為墨旱蓮為保肝補(bǔ)腎中藥,目前,沒(méi)有任何研究報(bào)道墨旱蓮提取物或其中某類單體成分可用于肺纖維化的治療,本發(fā)明人通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該墨旱蓮提取物顯著改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。本發(fā)明的墨旱蓮提取物具有較好的穩(wěn)定性,可以用于制備治療相應(yīng)疾病的藥物。
`[0042]2、依據(jù)《中國(guó)藥典》(2010版)記載,本發(fā)明提取物測(cè)定總皂苷含量(53.24-56.1% )之外,同時(shí)測(cè)定墨旱蓮的指標(biāo)成分蟛蜞菊內(nèi)酯(1.46-3.56% )和旱蓮苷A(6.54-11.30% )。本發(fā)明中的墨旱蓮提取物是個(gè)復(fù)雜體系,體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明提取物整體入藥有效,尚不能確定活性成分及輔助成分類型。具體來(lái)說(shuō)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在實(shí)施例1和2(即權(quán)利要求兩個(gè)端點(diǎn)值)中所制備的提取物給藥組中,HE、MaSSon染色病理切片顯示給藥組肺纖維化程度明顯改善,墨旱蓮提取物給藥組NO含量明顯低于模型組,給藥第14、28天,肺組織中反映肺損傷的MDA含量明顯低于模型組(P < 0.05或P < 0.01),給藥第14、28天肺組織中反映膠原沉積的HYP的含量均明顯低于模型組,說(shuō)明墨旱蓮提取物對(duì)肺纖維化進(jìn)程不同時(shí)期都有一定的保護(hù)作用,提示墨旱蓮提取物具有減輕氧自由基損傷,抑制膠原形成、保護(hù)肺組織的作用。實(shí)施例3 (不在發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi))提取物給藥組,雖然模型小鼠肺系數(shù)有較顯著變化(P < 0.05),但其小鼠肺組織改善程度不明顯,NO、MDA、HYP,TGF-β I等指標(biāo)無(wú)明顯改變。抑制肺纖維化細(xì)胞過(guò)度增生和促進(jìn)其凋亡也成為防治肺纖維化的一種有效手段,體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在1.6-100 μ g/mL范圍內(nèi),實(shí)施例1-3制備的墨旱蓮提取物呈劑量依賴性抑制HFL-1增殖,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了墨旱蓮提取物的抗肺纖維藥物用途。因此說(shuō)明本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)其可以墨旱蓮提取物對(duì)肺纖維化進(jìn)程不同時(shí)期都有一定的保護(hù)作用,不在本發(fā)明保護(hù)范圍效果不佳。
[0043]3、本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自原植物,原植物分別范圍廣,成本低,提取物活性明確,具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044]1.圖1實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物對(duì)造模第14、28天的小鼠肺系數(shù)及肺組織中HYP含量的影響。A:對(duì)肺系數(shù)的影響;B:對(duì)肺組織中HYP含量的影響;#p < 0.05,versuscontrol ;*p < 0.05, **p < 0.01versus model ;陽(yáng)性對(duì)照藥物:prednisone。
[0045]2.圖2實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物對(duì)各組肺組織炎癥程度的影響(HE染色X200)。A空白;B~D實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物;E模型;F陽(yáng)性藥
[0046]3.圖3實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物對(duì)各組肺組織纖維化程度的影響(Masson染色X200)。A空白;B~D實(shí)施例1-3的墨旱蓮提取物;E模型;F陽(yáng)性藥
[0047]4.圖4實(shí)施例1-3制備的墨旱蓮提取物對(duì)造模第14、28天時(shí)各組肺組織中NO(A)與 MDA(B)含量的影響。(##p < 0.01,#p < 0.05,versus control ;*p < 0.05,**p< 0.01versus model),陽(yáng)性對(duì)照藥物:prednisone
[0048]5.圖5實(shí)施例1-3制備的墨旱蓮提取物對(duì)各組肺組織中TGF-β I含量的影響。(##ρ < 0.01, #ρ < 0.05, versus control ;*p < 0.05, **p < 0.01versus model),陽(yáng)性對(duì)照藥物:prednisone
【具體實(shí)施方式】
[0049]實(shí)施例1
[0050]一、墨旱蓮提取物的制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)考察
[0051]墨旱蓮(Herba Ecliptae)為菊科植物鱧腸Eclipta prostrate L.的干燥地上部分,購(gòu)于安徽亳州。乙醇、石油醚等試劑均為分析純。
[0052]墨旱蓮干燥地上部分,以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次,每次2h,過(guò)濾,合并提取液,減壓去除乙醇,得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中,以石油醚等倍量萃取,用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物(EtOAc)及水部位(H20),同時(shí)將乙酸乙酯部位通過(guò)HP-20吸附樹(shù)脂柱色譜進(jìn)行分離,分別獲得水(6.56% ) ,30% (4.66% ) ,60%(5.51% ),90% (4.49%)乙醇洗脫部位,60%乙醇洗脫部位減壓干燥,以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物,配制成藥液用于活性研究。
[0053]1、墨旱蓮提取中總皂苷的含量測(cè)定方法如下:
[0054]①標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液的制備:稱取干燥至恒重所得旱蓮苷A對(duì)照品1.46mg,甲醇溶解,定容于IOml量瓶,作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取墨旱蓮提取物7.0lmg,甲醇溶解,定容至25ml,混勻,作為樣品液。
[0055]②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取旱蓮苷A對(duì)照品溶液各0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml,置于IOml具塞試管中水浴揮干,加0.2ml的5%香草醛/冰醋酸和0.8ml高氯酸溶液,于60°C水浴加熱15min,冷卻后加5ml冰醋酸,以溶液濃度C為縱坐標(biāo),吸光度A為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為 C = 0.4757A+0.0002,R2 = 0.9998,在 0.029 ~0.146mg/ml 呈良好的線性關(guān)系。依同法制備空白對(duì)照。于波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0056]③樣品中總皂苷含量測(cè)定:吸取樣品液lmL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟操作,測(cè)定吸收度。計(jì)算墨旱蓮總皂苷含量為56.1%。
[0057]2、墨旱蓮提取物中旱蓮苷A和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量測(cè)定:[0058]①色譜條件:C18柱(ZORBAX SB-C18,14.6 X 250mm5-Micron,Agilent);進(jìn)樣量:20 μ L0流速lml/min。檢測(cè)波長(zhǎng):210nm。流動(dòng)相:乙腈(A)和0.1 %磷酸緩沖液⑶梯度洗脫,O ~lOmin,15-23% (A) ;10-40min, 23% (A) ;40-42min, 23-40% (A) ;42-60min, 40%⑷;60-65min ;40-90% ⑷。
[0059]②對(duì)照品、供試品溶液制備:精密稱取蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)照品6.72mg,旱蓮苷A7.03mg于25ml容量瓶,甲醇溶解并定容。即蟛蜞菊內(nèi)酯和旱蓮苷A的濃度分別為0.2688mg/ml,0.2812mg/ml。精密稱取墨旱蓮提取物16.77mg于IOml容量瓶,甲醇溶解定容,搖勻,即得。
[0060]③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密吸取混合對(duì)照品溶液各1.00,1.25,1.5,1.75,2.0Oml于IOml量瓶,甲醇稀釋至刻度,搖勻,得標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按上述條件測(cè)定。以對(duì)照品溶液濃度X(Xl(T5mg/ml)為橫軸,峰面積Y為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得蟛蜞菊內(nèi)酯的回歸方程為:Y=L 0459X-784.56 (R2 = 0.9905),旱蓮苷 A 的回歸方程為:Y = 0.0793Χ-29.940 (R2 =0.9982),分別在 0.02688 ~0.05376mg/ml 和 0.02812 ~0.05624mg/ml 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。 [0061]將供試品溶液按上述所述條件進(jìn)樣檢測(cè),計(jì)算得總皂苷旱蓮苷A的含量為
11.30%和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為3.56%。
[0062]實(shí)施例2
[0063]墨旱蓮干燥地上部分,以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次,每次2h,過(guò)濾,合并提取液,減壓去除乙醇,得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中,以石油醚等倍量萃取去除葉綠素等脂溶性成分,水溶液減壓濃縮成每毫升相當(dāng)于2.0g生藥的溶液,通過(guò)HP-20樹(shù)月旨,用乙醇-水梯度洗脫,依次采用30%,70%及90%乙醇洗脫,其中70%乙醇洗脫部位減壓干燥后,備用,用于抗肺纖維化活性研究。
[0064]按實(shí)施例1所述條件進(jìn)樣檢測(cè),計(jì)算得總皂苷含量為53.24%,旱蓮苷A的含量為6.54%和蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為1.46%。
[0065]實(shí)施例3
[0066]墨旱蓮干燥地上部分,以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次,每次2h,過(guò)濾,合并提取液,減壓去除乙醇,得總浸膏903g。將總浸膏懸于水中,以石油醚等倍量萃取去除葉綠素等脂溶性成分,水溶液減壓濃縮成每毫升相當(dāng)于2.0g生藥的溶液,得墨旱蓮極性提取物,_20°C冷藏保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)用藥:以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物,配制成藥液。
[0067]按實(shí)施例1中所述條件檢測(cè),計(jì)算得總皂苷為45.2%,旱蓮苷A的含量為0.71%,蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為0.26%。
[0068]實(shí)施例4
[0069]二、墨旱蓮提取物改善博萊霉素所致小鼠肺纖維模型
[0070]選取實(shí)施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物進(jìn)行下述體內(nèi)藥效學(xué)研究。氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素復(fù)制小鼠肺纖維化模型,是國(guó)際上普遍采用的一種方法,而且與人類肺間質(zhì)纖維化相近。
[0071]I材料與儀器ICR小鼠,雌性,體重18_22g,由南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。娃哈哈純凈水。羥脯氨酸試劑盒,南京建成生物工程研究所。醋酸潑尼松,批號(hào)120101,江蘇平光制藥有限責(zé)任公司。水合氯醛,批號(hào)20100813,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0072]2實(shí)驗(yàn)方法 ICR雌性小鼠,分空白組,模型組,陽(yáng)性藥組,墨旱蓮提取物按照劑量lOg/kg灌胃給藥,每組各20只。小鼠腹腔注射10ml/kg,4%的水合氯醛進(jìn)行麻醉,小鼠麻醉后,固定小鼠,消毒小鼠頸部。用剪刀縱向剪開(kāi)小鼠頸部皮膚,用鑷子縱向鈍性撕開(kāi)筋膜與肌肉,暴露氣管。注射器刺入氣管,空白組注入生理鹽水,其余各組均注入博來(lái)霉素(5mg/kg)。然后迅速將鼠板直立,旋轉(zhuǎn)鼠板,觀察小鼠呼吸情況,旋轉(zhuǎn)后用75%酒精棉消毒頸部傷口,縫合傷口,并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術(shù)后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息,等待蘇醒,大約l_2h后蘇醒,之后正常飼養(yǎng)。
[0073]造模后即日開(kāi)始,空白組,模型組每天灌胃生理鹽水,陽(yáng)性藥組灌胃6.67mg/kg/d醋酸潑尼松。取實(shí)施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物,分別灌胃10g/kg墨旱蓮提取物,連續(xù)灌胃28天。于28日,小鼠稱體重,摘眼球取血,血液流入1.5ml離心管中,靜置后,40C 3000rpm離心20min, -80°C保存?zhèn)溆?。取出肺組織,稱重,計(jì)算肺系數(shù),肺系數(shù)=肺重(mg)/體重(g),見(jiàn)圖1A所示。另取各組實(shí)驗(yàn)小鼠左上肺葉按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定羥脯氨酸含量,結(jié)果見(jiàn)圖1B。取各組小鼠左下肺放入4%甲醛中固定,逐級(jí)酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋后,常規(guī)切片,HE染色,Masson染色,觀察肺組織損傷及纖維化變化,造模28天后肺組織形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果如圖2和3。
[0074]所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)土SD(x土s)表示。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理,統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(one-way AN0VA), P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0075]病理組織切片經(jīng)HE、Masson染色,結(jié)果表明對(duì)照組的小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,肺泡間隔未增厚,肺泡腔透亮,腔內(nèi)未見(jiàn)明顯滲出物,肺泡腔未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)成纖維細(xì)胞增生,對(duì)照組小鼠的肺組織內(nèi)可見(jiàn) 少量染成藍(lán)色的膠原纖維,是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔增寬,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)急成纖維細(xì)胞增生,大量膠原沉積,肺纖維化形成,Masson染色后可見(jiàn)多量致密被染成藍(lán)色的膠原纖維,呈束狀或片狀沉積,基本符合肺纖維化的特點(diǎn),則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)實(shí)施例1-3所制備的墨旱蓮提取物治療后,可見(jiàn)小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,肺泡間隔略增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生程度均比模型組輕。經(jīng)陽(yáng)性藥物醋酸潑尼松治療后,陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺泡間隔較寬,肺泡腔變窄,較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生,病變程度較模型組減輕。給藥各組及陽(yáng)性藥與模型組相比,纖維化程度均減輕。(圖2和3)
[0076]3.總提取物對(duì)模型小鼠肺系數(shù)和肺組織HYP含量所產(chǎn)生的影響。
[0077]羥脯氨酸(HYP)是由結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸,約占膠原重量的14%,對(duì)膠原蛋白的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用,由于膠原是唯一含HYP較多的蛋白質(zhì),因此,測(cè)定HYP含量能反映組織膠原的總量變化。造模之后的第14、28天測(cè)定肺系數(shù),消化法檢測(cè)肺組織中HYP的含量。與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義$<0.01或0.05);與模型組小鼠肺系數(shù)相比較。給藥14、28天后,墨旱蓮提取物組和陽(yáng)性藥物(醋酸潑尼松)組的肺系數(shù)均有明顯下降,具有顯著性差異(P <0.01),但實(shí)施例1-3所制備的墨旱蓮提取物組間不具有明顯差異(圖1A)。與對(duì)照組相比,28天時(shí)模型組肺組織HYP含量顯著增加(P < 0.01),與模型組相比,實(shí)施例1和實(shí)施例2所制備的提取物可明顯降低肺組織中HYP含量(P < 0.05),實(shí)施例3所制備的提取物的作用不明顯(圖1B)。提示實(shí)施例1-3所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化,墨旱蓮提取物劑可降低模型肺組織膠原纖維含量,減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度。[0078]4.墨旱蓮提取物對(duì)模型小鼠肺組織中NO,MDA、TGF- β I含量所產(chǎn)生的影響。
[0079]肺組織損傷則MDA產(chǎn)生增多,引起肺泡炎癥,炎癥細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)N0、TNF-a等及各種細(xì)胞因子,一方面加重肺組織損傷,另一方面又通過(guò)各種生長(zhǎng)因子促進(jìn)膠原產(chǎn)生過(guò)度增多。本實(shí)驗(yàn)按照試劑盒的要求規(guī)范操作,比色法檢測(cè)14、28天時(shí)各組肺組織N0、MDA含量。
[0080]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,第14、28天模型組的NO、MDA含量均升高(P
<0.01),陽(yáng)性給藥組中反映肺損傷的MDA、N0含量明顯低于模型組,同樣,實(shí)施例1和實(shí)施例2法所制備的墨旱蓮提取物給藥組的NO、MDA含量也顯著下降(P < 0.01或0.05)(圖
4),提示實(shí)施例1-2所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的改善模型小鼠的肺組織損傷程度。
[0081]采用ELISA法,在造模28天結(jié)束時(shí)檢測(cè)各組小鼠肺組織中TGF-β I的含量(圖
5)。與對(duì)照組相比,模型組的TGF-βI的含量顯著升高,而與模型組相比,灌胃給予實(shí)施例1和實(shí)施例2所制備的墨旱蓮提取物之后,模型小鼠肺組織中TGF-β I的含量均顯著降低(P
<0.05),而灌胃給藥實(shí)施例3法制備的提取物之后,模型肺組織中TGF-β I含量變化不明顯。TGF-β I是組織纖維化中公認(rèn)的致纖維化因子,通過(guò)經(jīng)典的TGF-β 1/Smads途徑參與纖維化進(jìn)程,研究結(jié)果提示實(shí)施例1-2所制備的墨旱蓮提取物在10g/kg劑量下可不同程度的降低TGF-β I含量,較好地干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化發(fā)展程度。
[0082]三、實(shí)施例1-3所制`備的墨旱蓮提取物對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響
[0083]肺成纖維細(xì)胞是肺纖維化進(jìn)程中的效應(yīng)細(xì)胞,不是被動(dòng)參與病程,成纖維細(xì)胞的增殖并且分化成肌成纖維細(xì)胞,這兩種細(xì)胞均可分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),肺內(nèi)的ECM主要由膠原、糖胺聚糖、纖連蛋白FN等構(gòu)成,在肺纖維化早期主要以III型膠原增加為主,晚期是以I型膠原增加為主。由于肺成纖維細(xì)胞異常增殖及膠原分泌增加在肺纖維化過(guò)程中起重要作用,抑制肺纖維化細(xì)胞過(guò)度增生和促進(jìn)其凋亡也成為防治肺纖維化的一種有效手段。
[0084]人胚肺成纖維細(xì)胞(HFLl)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。HFLl細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的F12-K培養(yǎng)基,置37°C,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換I次培養(yǎng)基,細(xì)胞生長(zhǎng)90%密度時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞并傳代。將實(shí)施例1-3中所制備的墨旱蓮提取物分別命名為I號(hào)、2號(hào)、3號(hào)提取物。
[0085]實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。采用MTT法考察不同濃度藥物對(duì)HFL-1的生長(zhǎng)抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,胰蛋白酶消化,并接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),細(xì)胞密度為5 X IO4ceIΙ/ml,每孔細(xì)胞懸液200μ 1,置37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后,棄原培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組依次加入不同濃度的墨旱蓮提取物培養(yǎng)液,設(shè)立空白及陰性對(duì)照組,每組5個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。分別作用48h后加入MTT溶液(5mg/ml)20l.! 1,孵育4h,棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加150μ 1DMS0,震蕩混勻后,在酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度。(如表1)。
[0086]表1不同濃度墨旱蓮提取物對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響(n = 5,48h,x土SD)
【權(quán)利要求】
1.墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用,其特征在于按質(zhì)量百分比計(jì),墨旱蓮提取物中總皂苷含量在53.24-56.1%,提取物中旱蓮苷A的含量為6.54-11.30%,蟛蜞菊內(nèi)酯的含量為1.46-3.56%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用,其特征在所述的墨旱蓮提取物經(jīng)醇水提取、有機(jī)溶劑萃取方法制備而成,墨旱蓮提取物得率為10.01-15.05%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的墨旱蓮提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用,其特征在于所述的墨旱蓮提取物由如下方法制得:墨旱蓮干燥地上部分,以10倍于生藥體積的80%乙醇回流提取3次,每次2h,過(guò)濾,合并提取液,減壓去除乙醇,得總浸膏;將總浸膏懸于水中,以石油醚等倍量萃取,用乙酸乙酯進(jìn)行萃取、分別獲得乙酸乙酯萃取物及水部位,同時(shí)將乙酸乙酯部位通過(guò)HP-20吸附樹(shù)脂柱色譜進(jìn)行分離,分別獲得水洗脫部位、30 %乙醇洗脫部位、60%乙醇洗脫部位、90%乙醇洗脫部位; 其中60%乙醇洗脫部位、70%乙醇洗脫部位經(jīng)減壓干燥,以蒸餾水稀釋墨旱蓮極性提取物。
【文檔編號(hào)】A61P11/00GK103768117SQ201410044532
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】張朝鳳, 許翔鴻, 張勉, 薛倩, 賀湘, 鄒倩 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)
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