專利名稱：一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，尤其是涉及一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒
素的組合分離純化方法。
背景技術：
眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的一種天然毒蛋白，其化學成分非常復雜，含有 多種蛋白質、多肽、酶類和其他小分子物質，具有廣泛的生物學活性，其中主要的有神經(jīng)毒 素、細胞毒素、神經(jīng)生長因子和眼鏡蛇毒因子(CVF)等。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，眼鏡蛇 毒的許多組分已得到分離純化和序列測定，各種成分廣泛應用于生物化學、分子生物學、毒 理學和藥物學理論研究和臨床應用。 自1933年Monaelesser和Taguet首次報道眼鏡蛇毒對癌組織壓迫神經(jīng)引起疼痛 的病例的顯著療效以來，眼鏡蛇毒的鎮(zhèn)痛作用得到了深入的研究，其中眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素 (neurotoxin, NTX)顯示了獨特的鎮(zhèn)痛作用，NTX的鎮(zhèn)痛機理與嗎啡類似，鎮(zhèn)痛效果大于嗎 啡，持續(xù)時間長，無麻醉作用，無成癮性和耐藥性，但起效較嗎啡慢；同時NTX還能戒除嗎啡 毒癮，所以在癌痛或戒毒等方面具有獨特的治療作用。 目前蛇毒神經(jīng)毒素的提取方法主要是采用離子交換法結合凝膠層析法，現(xiàn)有技術 的提取方法存在步驟多、分離周期長、提取成本高，蛇毒一次提取之后不能重復利用等問 題。例如李泛珠等所公開的《浙江眼鏡蛇蛇毒中神經(jīng)毒素的分離純化及其鎮(zhèn)痛作用研究》 (中國藥師，2004， 7， 9， 659-661)中，采用三次柱層析，步驟多、耗時長、提取成本高，不易作 為工業(yè)化大規(guī)模分離純化工藝；龔潮梁等所公開的《一種分離提純眼鏡蛇神經(jīng)毒素的簡便 方法》(1981 ， 2， 4， 83 87)中，采用CM-纖維素柱吸附并線性洗脫，CM—纖維素樹脂允許的 線性流速很低，并且極易被壓縮，造成工藝耗時長，產(chǎn)品質量不穩(wěn)定，屬于應淘汰的舊工藝。
眼鏡蛇毒因子(Cobra venom factor, CVF)，又稱為眼鏡蛇抗補體蛋白 (Cobraanticomplementary protein)，是來源于眼鏡蛇科蛇毒的一種旁路補體激活物。由 于CVF既能激活補體又能最終耗竭補體，且性質穩(wěn)定，特異性高，因此被廣泛應用于基礎醫(yī) 學的研究.具有廣闊的臨床應用前景，可能用于以下幾個方面研究抗補體作用的工具藥； 用于抗炎癥及抗自身免疫性疾?。豢挂浦才懦夥磻?；抗腫瘤導向藥物等。
由于CVF在眼鏡蛇毒中含量甚般，提取較困難，所以很少有公開報道的CVF分離提 純方法，葉春玲等曾公開《一種從蛇毒中分離提純抗補體因子的簡便方法》(中國藥理學通 報，1997Feb ;13(1) :85 87)，采用先凝膠層析再離子交換層析兩步層析法分離，凝膠層析 采用Bio-gel P200柱，離子交換層析采用DEAE cellulose DE 52柱，該方法可以少量制備 樣品，但以上兩種填料剛性較差，層析柱易壓縮，耗時長，不適合做規(guī)?；a(chǎn)工藝，并且大 部分蛇毒蛋白未能有效利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進已有技術的不足而提供一種同時分離眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素
和眼鏡蛇毒因子、分步得到重點產(chǎn)品、減少產(chǎn)品間的相互干擾、避免了脫鹽引起CVF的溶解
度降低而帶來的溶液渾濁且容易蛋白變性的問題、綜合利用率和提取效率高、產(chǎn)品純度高、
適合工業(yè)化生產(chǎn)的眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇神經(jīng)毒素的組合分離純化方法。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離
純化方法，其特點在于該方法包含以下步驟 1)、取蛇毒溶解于純化水或pH5-8的Tris緩沖液中，l(TC以下低溫離心，取上清液，過微孔濾膜； 2)、將步驟1)所得到的上清液進行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為3kDa-5kDa的超濾膜進行； 3)、將步驟2)所得到的蛇毒液分別進行離子交換層析和凝膠層析，取相應組分進行除鹽濃縮、冷凍干燥，分別得到純化的眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素成分。
為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所用蛇毒為眼鏡蛇毒干粉或凍干粉。
為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所述步驟l)中，采用O-l(TC低溫離心，上清液過0. 22 ii m或0. 44 ii m微孔濾膜。 為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所述步驟2)中，交換的緩沖液為pH5-8之間的Tris-HCl緩沖液或醋酸鹽緩沖液或PBS緩沖液中的一種，超濾采用截留分子量為3-5kDa之間的超濾膜系統(tǒng)。 為了進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以是所述步驟3)中包括下述步驟 a、將步驟2)最終得到的上清液進行截留分子量為3 5kDa的超濾； b、用pH值為5-8的緩沖液平衡陽離子交換柱，將步驟a得到的蛇毒液上樣后，
0-0. 5M含緩沖液的鈉鹽階段梯度或線性梯度洗脫； c、收集步驟b中具有眼鏡蛇神經(jīng)毒素活性成分峰，按照步驟a方式進行除鹽濃縮，
真空冷凍干燥，得到眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素； d、收集步驟b中流穿峰組分，按照步驟a濃縮； e、用lO-lOOmM的氯化鈉溶液平衡的凝膠層析柱，層析介質包括Superdex 200、S印hacryl 200或分離分子量在100kDa以上的凝膠層析介質，取步驟d的濃縮液上柱；
f 、收集步驟e中的眼鏡蛇毒因子成分，按照步驟a方式部分除鹽后真空冷凍干燥或者不除鹽直接真空冷凍干燥，得到眼鏡蛇毒因子。
本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點 1.本發(fā)明可以同時分離眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和眼鏡蛇毒因子，提高了眼鏡蛇毒這一珍稀資源的利用效率； 2.本發(fā)明取陽離子交換柱法分離眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的流穿峰中分離眼鏡蛇毒因子成分，兩步法中每步驟中得到重點產(chǎn)品，減少產(chǎn)品間的相互干擾； 3.采用直接帶鹽凍干CVF，避免了脫鹽引起CVF的溶解度降低而帶來的溶液渾濁且容易蛋白變性的問題； 本發(fā)明同時提取眼鏡蛇神經(jīng)毒素和眼鏡蛇毒因子，綜合利用率和提取效率高，產(chǎn)品純度高，得到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素純度95%以上，眼鏡蛇毒因子純度90%以上。采用本發(fā)明方法得到的眼鏡蛇毒因子成分，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢驗，非還原法為一條帶，還原法為三條帶。適合工業(yè)化生產(chǎn)，并且該兩種產(chǎn)品的應用前景廣泛。 本發(fā)明方法得到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素，是由68個氨基酸殘基組成的堿基多肽，分子量7000Da左右。由于其堿基多肽的特殊結構所致，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測的表觀分子量約12kDa，與科博肽國家標準品一致。 本發(fā)明方法得到的眼鏡蛇毒因子(CVF)，分子量為130-230kDa，等電點4. 4_6. 0，
三條肽鏈組成通過二硫鍵和非共價鍵鏈接，經(jīng)加入DDT ( 二硫蘇糖醇)還原后SDS-PAGE檢驗為三條帶，分子量依次為30kDa、50kDa、66kDa左右。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。 圖1為本發(fā)明方法的到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素與購自中檢所的科博肽標準品眼鏡蛇神經(jīng)毒素的SDS-PAGE電泳檢驗對照圖。 圖2為本發(fā)明方法的到的眼鏡蛇毒因子加入二硫蘇糖醇還原經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗圖。
具體實施例方式
實施例， 一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方法，是采用以下步驟 1.樣品粗毒的處理稱取蛇毒20g溶解于200ml純化水或pH5_8的Tris緩沖液中，10°C以下lOOOOrpm低溫離心10min，取上清液，過0. 22 ii m微孔濾膜，過膜后溶液用截留分子量為3kDa_5kDa的超濾膜交換為分離緩沖液；
2. CM-S印harose FF層析將交換緩沖液后的蛇毒溶液用蠕動泵以10ml/min的流速上樣到pH 7. 5， 20mmol/L的Tris緩沖液平衡的CM S印harose FF層析柱(5. 0 X 30cm)，并用平衡緩沖液洗脫完流穿峰并收集之，之后的洗脫緩沖液中加入NaCL分別洗脫，加入的NaCL濃度為0. IM，O. 2M，0. 4M，所有步驟流速均為10ml/min，收集眼鏡蛇神經(jīng)毒素；
3.眼鏡蛇神經(jīng)毒素超濾除鹽，凍干 用3Ka分子量的超濾膜膜包將眼鏡蛇神經(jīng)毒素溶液脫除緩沖鹽，成為無鹽蛋白溶液，將除鹽后的蛋白溶液過O. 22ym濾膜，無菌分裝，冷凍干燥后既得眼鏡蛇神經(jīng)毒素原料藥1206mg ; 4.眼鏡蛇毒因子濃縮 將步驟2收集的流穿峰用lOKDa分子量的膜包超濾濃縮至60ml ;
5. Superdex 200層析 將60ml眼鏡蛇毒因子濃縮液上樣到50mM NaCl平衡的Superdex200層析柱5. 0X80cm， 10ml/min上樣，洗脫，收集眼鏡蛇毒因子產(chǎn)品峰；
6.除鹽、冷凍真空干燥 將步驟5得到的眼鏡蛇毒因子產(chǎn)品峰用lOKDa分子量超濾膜超濾到5mM NaCl，過0. 22 m濾膜，無菌分裝，冷凍干燥后既得眼鏡蛇毒因子原料藥162mg。取本實施例得到的眼鏡蛇神經(jīng)毒素與購自中檢所的科博肽標準品(眼鏡蛇神經(jīng)毒素)進行實驗對照，SDS-PAGE電泳檢驗圖見圖l，圖中左側為本發(fā)明產(chǎn)品，右側為中檢所的科博肽標準品。
取本實施例得到的眼鏡蛇毒因子，加入二硫蘇糖醇還原經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗，見圖2，由圖中可以看出，CVF由分子量為32000Da、49000Da、66000Da的三個亞基組成，符合CVF的特征要求。
權利要求
一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方法，其特征在于該方法包含以下步驟1)、取蛇毒溶解于純化水或pH5-8的Tris緩沖液中，10℃以下低溫離心，取上清液，過微孔濾膜；2)、將步驟1)所得到的上清液進行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為3kDa-5kDa的超濾膜進行；3)、將步驟2)所得到的蛇毒液先后進行離子交換層析和凝膠層析，取相應組分除鹽、冷凍干燥，分別得到純化的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和眼鏡蛇毒因子成分。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方 法，其特征在于所用蛇毒為眼鏡蛇毒干粉或凍干粉。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方 法，其特征在于所述步驟1)中，采用O-l(TC低溫離心，上清液過O. 22ii m或O. 44y m微孔濾 膜。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方 法，其特征在于所述步驟2)中，交換的緩沖液為pH5-8之間的Tris-HCl緩沖液或醋酸鹽緩 沖液或PBS緩沖液中的一種，超濾采用截留分子量為3-5kDa之間的超濾膜系統(tǒng)。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方 法，其特征在于所述步驟3)中包括下述步驟a、 將步驟2)最終得到的上清液進行截留分子量為3k-5k的超濾；b、 用pH值為5-8的緩沖液平衡陽離子交換柱，將步驟a得到的蛇毒液上樣后，O-O. 5M 含緩沖液的鈉鹽階段梯度或線性梯度洗脫；c、 收集步驟b中具有眼鏡蛇神經(jīng)毒素活性成分峰，按照步驟a方式進行除鹽濃縮，真空 冷凍干燥，得到眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素；d、 收集步驟b中流穿峰組分，按照步驟a進行濃縮后上樣到Superdex 200層析柱；e、 用10 100mM的氯化鈉溶液平衡的凝膠層析柱，層析介質包括Superdex 200、 S印hacryl 200或分離分子量在100kDa以上的凝膠層析填料，取步驟d的濃縮液上柱；f、 收集步驟e中的眼鏡蛇毒因子成分，按照步驟a方式部分除鹽后真空冷凍干燥或者 不除鹽直接真空冷凍干燥，得到眼鏡蛇毒因子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的組合分離純化方法，是首先低溫高速離心處理蛇毒原液，再使用3KDa超濾膜除去蛇毒中小分子物質和低分子多肽等，兩步層析分別是CM-Sephrose FF層析柱和Superdex 200凝膠層析柱，在一次生產(chǎn)中分別得到眼鏡蛇神經(jīng)毒素和眼鏡蛇毒因子兩種有效成分，本發(fā)明具有可以同時分離眼鏡蛇毒因子和眼鏡蛇神經(jīng)毒素、有效提高了眼鏡蛇毒的利用效率、產(chǎn)品純度高、適合工業(yè)化生產(chǎn)的特點。
文檔編號C07K14/435GK101747409SQ20101001146
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月15日 優(yōu)先權日2010年1月15日
發(fā)明者劉志強, 呂憲峰, 張坤, 曹恒, 林峰, 王東 申請人:中鑫東泰(萊陽)納米基因生物技術有限公司