專利名稱：熒光細胞標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及硝基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽(NBQ)和氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽(ABQ)的合成及生物活性，更具體地涉及制備展示顯著的生物活性和熒光性質(zhì)的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽和氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽的·合成過程。背景討論當(dāng)研究細胞或受試者對給定的內(nèi)部的或外部的刺激如何反應(yīng)或行為時科學(xué)界不斷地需要應(yīng)用細胞標(biāo)記。這些刺激中的一些包括，但不限于，藥物處理、治療和自然疾病過程。Cox等人的美國專利第4，590，275號(Cox ‘275)公開了顯示細胞毒活性、抗腫瘤活性和抗病毒活性的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽(BQS)的制備。然而Cox’275未能公開氨基取代的吲哚并[3，2-a]喹啉鎗(ABQ)化合物的合成，其中所述ABQ具有可用于細胞器的鑒別的熒光性質(zhì)及可用于治療應(yīng)用的生物活性。熒光性質(zhì)幫助使用者鑒別細胞器，使該化合物成為用于研究、診斷或治療的極好的標(biāo)記。生物活性中的一些包括，但不限于，對培養(yǎng)的腫瘤細胞系的細胞毒性、線粒體損傷和凋亡誘導(dǎo)。Cox ‘275還公開了合成一些化合物的不同方法，然而公開的方法沒有限制被化合物照射的刺激以避免導(dǎo)致不期望的特性和性質(zhì)的不期望的反應(yīng)。另外通過加入避免分離純的BQS的高氯酸水溶液或飽和高氯酸鈉溶液，BQS作為高氯酸鹽通過其沉淀被分離。發(fā)明概述本發(fā)明克服了 Cox ‘275等人提出的合成氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽的限制并公開了在細胞培養(yǎng)中提供自體熒光的增加對腫瘤細胞生物活性和更好選擇性的合成過程，誘導(dǎo)通過凋亡的細胞毒性、與細胞器結(jié)合及在培養(yǎng)中對人類惡性或正常細胞的胱天蛋白酶活化?；衔锏倪x擇是吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽(BQS)的一部分，BQS已合成四個系列化合物 系列1(X = S)，是在環(huán)C和環(huán)D中結(jié)合了稠合苯并噻唑的氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗或苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗高氯酸鹽； 系列2(X = NR)，是在環(huán)C和環(huán)D中結(jié)合了稠合的苯并咪唑部分的氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎗； 系列3(X = 0)，是在環(huán)C和環(huán)D中結(jié)合了苯并噁唑環(huán)的氯化苯并噁唑并[3，2-a]喹啉鎗或苯并噁唑并[3，2-a]喹啉鎗高氯酸鹽； 系列4(X = Se),是在環(huán)C和環(huán)D中結(jié)合了苯并硒唑部分的苯并硒唑并[3,2_a]氯化喹啉鎗。系列1-4化合物進一步特征在于在環(huán)A中包括硝基或氨基取代基，這些分別被確定為NBQ和ABQ。即使當(dāng)提出所有這些系列時，本發(fā)明具體涉及屬于系列I和2的四種BQS (NBQ-38、ABQ-38、NBQ-95 和 ABQ-95)的合成和生物活性。首先，本發(fā)明公開了化合物，諸如氨基取代的吲哚并[3，2-a]喹啉鎗，顯示了(I)細胞內(nèi)結(jié)合；(2)通過由線粒體損傷和胱天蛋白酶3和7活化介導(dǎo)的凋亡活化對惡性細胞的細胞毒性；(3)細胞器結(jié)合及損傷?；衔锱c細胞接觸還顯示了自體熒光性質(zhì)。這些熒光性質(zhì)在研究中作為突光標(biāo)記或在臨床研究中作為治療標(biāo)記或診斷標(biāo)記，清楚表明了與細胞器的相互作用?？蓱?yīng)用于監(jiān)視環(huán)境中的微生物的存在和濃度，因為微生物也具有可與這些熒光化合物結(jié)合的細胞器。在系列I和2中與NBQ相比，ABQ還顯示了對癌細胞增強的 選擇性。第二，本發(fā)明公開了硝基和氨基取代的苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗鹽I的合成，其通過凋亡機制、與大細胞器(macro organelle)諸如線粒體和DNA相互作用、胱天蛋白酶3和7活化以及在X0/HX的存在下生物還原時8-2-dG加合物的形成而引起細胞死亡。合成的硝基取代的苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗鹽I還顯示了選擇性地靶向含氧量低的細胞的能力和對腫瘤細胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制能力。第三，本發(fā)明公開了合成苯并噻唑并[3，2_a]喹啉鎗鹽I(BQ)的改進的過程。因此本發(fā)明的目的之一是提供一種化合物，其顯示了細胞內(nèi)結(jié)合，通過由線粒體損傷和胱天蛋白酶3和7活化介導(dǎo)的凋亡活化對惡性細胞的細胞毒性，細胞器結(jié)合及損傷和自體熒光。本發(fā)明的另一個目的是提供一種合成的硝基取代的苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗鹽I (NBQ)，其通過凋亡機制、與大細胞器諸如線粒體和DNA相互作用、胱天蛋白酶3和7活化以及在X0/HX的存在生物還原時的8-2-dG加合物的形成而引起細胞死亡。本發(fā)明的另一個目的是提供一種合成的硝基取代的苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗鹽，其能夠鑒別腫瘤或異常組織。本發(fā)明的另一個目的是提供一種合成與生物系統(tǒng)更相容的BQ的新改進的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種避免不期望的反應(yīng)的BQ的合成方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種改進化合物特性的BQ的合成方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種適合作為抗癌治療劑的化合物。本發(fā)明的又一個目的是提供作為治療標(biāo)記的熒光BQ類似物，因為其可顯示已與BQ相互作用的器官或組織。通過以下優(yōu)選的實施方案的詳細描述連同附圖，發(fā)明本身，關(guān)于其結(jié)構(gòu)和操作的方式將被很好地理解，且另外的目的和其優(yōu)勢將變得明顯。因此本申請聲明，本申請的公開可包括不只一個發(fā)明且在不只一個發(fā)明的情況下，這些發(fā)明的一個發(fā)明相對于另一個發(fā)明可以是可取得專利權(quán)的和非顯而易見的。而且，所附摘要的目的是使美國專利商標(biāo)局和公眾通常地，且特別地是不熟悉專利或法律術(shù)語或措辭的本領(lǐng)域科學(xué)家、工程師和從業(yè)者能夠由粗略查看快速地確定本申請技術(shù)公開的性質(zhì)和要素。摘要既不意圖限制本申請的發(fā)明(其由權(quán)利要求度量)，也不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。附圖簡述本文結(jié)合的附圖構(gòu)成了說明書的一部分并說明了本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。圖I顯示了本發(fā)明的通用結(jié)構(gòu)。圖2顯示了開發(fā)的BQS的化學(xué)式的表。圖3制備(E)-2-苯乙烯基吲哚衍生物II的合成方法。圖4顯示了(E)-2-苯乙烯基吲哚衍生物II的化學(xué)式的表。圖5顯示了通過II的光誘導(dǎo)的環(huán)化合成BQS(I)。
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圖6利用新方法合成新的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗衍生物。圖7顯示氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗衍生物的表，系列I。圖8顯示氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎗衍生物的表,系列2。圖9顯示氯化苯并噁唑并[3，2-a]喹啉鎗衍生物的表，系列3。

圖10顯示氯化苯并硒唑并[3，2-a]喹啉鎗衍生物的表,系列4。圖IlABQ與A431人類腫瘤的線粒體和DNA的細胞內(nèi)結(jié)合的圖像。圖12ABQ38在A431腫瘤細胞上的自體熒光的圖像。圖13顯示用BQ和陰性對照處理A431細胞的IC5tl的測定的表。圖14顯示用BQ處理的A431細胞上線粒體膜的狀態(tài)的圖。圖15顯示比較用BQ處理的A431細胞上的胱天蛋白酶3&7活化的圖。優(yōu)選實施方案的描述圖I顯示了合成的NBQ和ABQ的通用結(jié)構(gòu)。如圖2中所示，本發(fā)明具體涉及四種BQS(NBQ-38、ABQ-38、NBQ-95和ABQ-95)的合成和生物活性。如圖3和圖4所示，合成順序開始于硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑II的合成和特定方法，之后利用硼化鎳作為催化劑用肼還原硝基。進一步通過一種方法光誘導(dǎo)地環(huán)化II，以可接受的收率得到I。如圖5、圖6和圖7所示，結(jié)果是合成氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗。合成了四個系列，其中如圖7所示，系列I (X = S)包括在環(huán)C和環(huán)D中結(jié)合了稠合的苯并噻唑的氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗或苯并噻唑并[3，2-a]喹啉高氯酸喹啉；如圖8所示，系列2 (X = NR)包括在環(huán)C和環(huán)D中結(jié)合了稠合的苯并咪唑部分的氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎗；如圖9所示，系列3 (X = 0)包括在環(huán)C和環(huán)D中結(jié)合了苯并噁唑環(huán)的氯化苯并噁唑并[3，2-a]喹啉鎗或苯并噁唑并[3，2-a]喹啉鎗高氯酸喹啉；最后如圖10所示，系列4(X = Se)包括在環(huán)C和環(huán)D中結(jié)合了苯并硒唑部分的氯化苯并硒唑并[3，2-a]喹啉鎗。系列1-4進一步特征在于在環(huán)A中包括硝基或氨基取代基，這些分別被確定為NBQ和ABQ。如圖2所示，從NBQ和ABQ表中選擇的一些是獲自系列I和2的NBQ-38、ABQ-38、NBQ-95 和 ABQ-95。特定的方法學(xué)或方法包括使用一些測量和儀器以便進行化合物的合成。除非另外聲明，在本情況下一些過程在開放大氣下在預(yù)干燥的玻璃器皿(2h，125°C)中進行。在230C -250C的室溫下利用安裝有350nm燈的Rayonet光化學(xué)反應(yīng)器進行照射。利用熔-溫(Melt-Temp)儀器在毛細管中測定熔點。在諸如以下的分光計上記錄1H和13C nmr光譜通用電氣QE-300(利用5mm C/H雙探頭)，在對1H為300. 15MHz的觀測頻率和對13C為75. 48MHz的觀測頻率下操作，并安裝處理和分析由觀測獲得的數(shù)據(jù)的軟件諸如Nicolet1280數(shù)據(jù)系統(tǒng)和293-C脈沖編程器；或BrukerDRX500 (利用5mm寬譜帶探頭)，在對1H為500. 13MHz的可觀測頻率和對13C為125. 77MHz的可觀測頻率下操作。質(zhì)子數(shù)據(jù)參考在
50. Oppm的四甲基娃燒(TMS),在S 7. 26ppm的氯仿(O)Cl3)或在5 2. 49ppm的二甲亞砜(DMS0-d6)。13C核參考在S 77. Oppm的氘代氯仿的I : I : I多重峰的峰中心或分配在
639. 5ppm的六氘代甲基亞砜的多重峰的中心峰。紅外光譜記錄在Nicolet系列6000FT-IR分光計上。高分辨質(zhì)譜(HRMS)光譜記錄在熒光光譜儀上，諸如FISON儀器、利用直插式探頭(DIP)的VGAuto Spect系列。HRMS參數(shù)如下電子碰撞70eV ;分辨率1000ppm ;溫度斜坡100-40(TC (30°C /min)。薄層色譜法(TLC)在具有熒光指示劑的0. 25cm厚度的聚酯支持的硅膠上進行并用紫外光(254nm)觀測。通過Atlantic Microlab進行元素分析。 此外，將化合物進行核磁共振研究，其中利用5mm NMR樣品管在23_25°C之間的溫度進行該過程。使用的溶劑是DMS0-d6和⑶Cl3且樣品量的范圍從30至150mg，全部溶解在大約0. 50mL至0. 75mL的相應(yīng)的氘取代的溶劑中。1H和13C nmr光譜的測量條件如下脈沖寬度，分別是8. 75 ii s (90° )和9.60ii s(90° );譜寬分別是3311Hz和14705Hz ;數(shù)據(jù)點分別是16K和32K。利用脈沖序列諸如由Bax和Freeman描述的序列記錄COSY譜。在兩個維(F1, F2)中譜寬均是3311Hz。光譜在Bruker DRX500中收集為256x Ik數(shù)據(jù)塊或在通用電氣QE-300中以每塊16-24捕獲且捕獲之間0. Is收集，并在每個維中利用正弦貝爾乘法將光譜處理為最終512X512實點矩陣(補零F1維)，隨后使最終數(shù)據(jù)矩陣對稱。在Bruker DRX500NMR分光計上進行了所有異核多級量子相干(HMQC)和異核多鍵相關(guān)(HMBC)實驗。光譜由每個h進行96積累的256x4矩陣獲得，并在F1和F2維中分別利用余弦平方乘法和正弦平方乘法將光譜處理為最終512X512實點矩陣(補零F1維)。延遲時間是3. 0ms(l/2JcH = A1)以阻止單鍵反應(yīng),和50ms(l/nJcH = A2)以展開遠程偶合(IOHz)。利用一些方法合成BQS、NBQ和ABQ。然而在環(huán)A中包括氨基取代基和硝基取代基在合成(E)-2-苯乙烯基吲哚和氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗(BQS)之后進行。如圖3和圖4所示，(E)-2_苯乙烯基吲哚的合成具有至少四種不同的方法，其中每種方法包括I.方法 I將相應(yīng)的2-氯取代苯甲醛和相應(yīng)的2-甲基吲哚衍生物的等摩爾混合物溶解于摩爾過量的醋酐中并回流18至24h。使溶液在23°C _25°C之間的溫度冷卻并過濾沉淀的固體，用醋酐或冷的2 I己烷/丙酮混合物洗滌。從有機非質(zhì)子溶劑諸如丙酮、己烷/丙酮
I I混合物、環(huán)己烷或甲苯中重結(jié)晶沉淀物，得到期望的產(chǎn)物。2.方法 2在23°C _25°C之間的溫度以恒定攪拌向DMSO(IOmL)中的2_甲基苯并噻唑和相應(yīng)的2-氯-6-取代苯甲醛的等摩爾溶液一次性加入50%氫氧化鈉溶液(3.0mL)。立即觀察到固體形成，并額外攪拌混合物5-15min。加入水之后，攪拌反應(yīng)混合物約5min。真空過濾并從甲苯或丙酮中重結(jié)晶，得到期望的產(chǎn)物。
3.方法 3將相應(yīng)的2-氯取代苯甲醛和相應(yīng)的2-甲基吲哚衍生物的等摩爾混合物溶解于摩爾過量的醋酐中并回流18至24h。使溶液在23°C _25°C之間的溫度冷卻并過濾沉淀的固體，用醋酐或冷的2 I己烷/丙酮混合物洗滌。從有機非質(zhì)子溶劑諸如丙酮、己烷/丙酮
I I混合物、環(huán)己烷或甲苯中重結(jié)晶沉淀物，得到期望的產(chǎn)物。為了阻止2-氯-6-取代苯甲醛，過程包括由涉及冷凝諸如回流的技術(shù)組成的擴展。在回流過程中包括在沸騰的醋酐中等摩爾混合物與小量的2-甲基吲哚衍生物(0. 2當(dāng)量)持續(xù)48h至168h之間的延長的反應(yīng)時間。通過TLC和1H NMR光譜監(jiān)視反應(yīng)過程。4.方法 4本方法用于制備(E)-I-取代_2_ (2_氣_5_硝基苯乙稀基)苯并咪唑(II),其中R基團對酸性條件敏感。特別地，這些化合物通過相應(yīng)的(E)-2-苯乙烯基苯并咪唑-I-基陰離子與鹵代烷(R-X)的烷基化而制備。向干燥的DME中加入分散于礦物油中的60%氫化鈉·(2.2當(dāng)量)并在氬氣氣氛下在冰水浴中冷卻攪拌。然后一次性加入(E)-lH-2-(2-氯-5-硝基苯乙烯基)苯并咪唑(1.0當(dāng)量)。加完(E)-苯乙烯基苯并咪唑(II)后，在23°C-25°C攪拌反應(yīng)混合物30min。然后在室溫下緩慢加入烷化劑(每當(dāng)量(E)-苯乙烯基苯并咪唑I. 5當(dāng)量)并在氮氣氣氛下攪拌反應(yīng)混合物6-24h。在該時間結(jié)束時，將得到的反應(yīng)混合物在冰水浴中冷卻并加入水。在真空下過濾得到的沉淀物，用I : I丙酮/己烷混合物洗滌并風(fēng)干。如圖6所示，利用至少四種不同的方法進行氯化吲哚并[3，2_a]喹啉鎗的合成，其中每種方法包括I.方法 I使用波長為350nm燈的可透容器。在本情況下，選擇的反應(yīng)容器是Pyrex管(40 X 6 X 0. 3cm)。利用裝配有350nm燈的Rayonet光化學(xué)反應(yīng)器進行照射，代替450W-Hanovia汞汽燈作為光源。重要的是理解照射的特異性是為了避免不期望的反應(yīng)。照射溶解于150-250mL 3 : I苯二噁烷混合物中的0. 2-1. Og相應(yīng)的(E)-2_(2_氯苯乙烯基)吲哚(II)樣品IO-ISh的間隔。在每次中斷后，過濾溶液以移出部分產(chǎn)物。在濾紙上獲得純形式的固體材料。用蒸餾水(大約15mL)提取殘留在管壁上的剩余的產(chǎn)物。濾紙也用水洗滌以移出水溶性產(chǎn)物。過濾來自一些照射的合并的水提取物并經(jīng)冷凍干燥以分離純的BQS0重新使用前，輻照容器依次用丙酮、乙醇、硫酸(I. 0M)、水、稀釋的碳酸鈉溶液(10% )、蒸餾水和丙酮洗滌。最后，在烘箱中干燥不少于24h。2.方法 2使用波長為350nm燈的可透容器。在本情況下，反應(yīng)容器是Pyrex管(40 X 6 X 0. 3cm)。利用裝配有350nm燈的Rayonet光化學(xué)反應(yīng)器進行照射，代替450ff-Hanovia汞汽燈作為光源。照射前將0. 2-1. Og相應(yīng)的(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚
(II)樣品溶解于150-250mL 2 : I : I苯溴苯二噁烷混合物中。在每次中斷后，過濾溶液以移出部分產(chǎn)物。在濾紙上獲得純形式的固體材料。用蒸餾水(大約15mL)提取殘留在管壁上的剩余的產(chǎn)物。濾紙也用水洗滌以移出水溶性產(chǎn)物。過濾來自一些照射的合并的水提取物并經(jīng)冷凍干燥以分離純的BQS。重新使用前，輻照容器依次用丙酮、乙醇、硫酸(I. 0M)、水、稀釋的碳酸鈉溶液(10%)、蒸餾水和丙酮洗滌。最后，在烘箱中干燥不少于24h。3.方法 3使用波長為350nm燈的可透容器。在本情況下，反應(yīng)容器是Pyrex管(40 X 6 X 0. 3cm)。利用裝配有350nm燈的Rayonet光化學(xué)反應(yīng)器進行照射，代替450W-Hanovia汞汽燈作為光源。首先將溶解于150_250mL 3 I苯二噁烷混合物中的
0.2-1.Og相應(yīng)的(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚(II)樣品用氬氣脫氣，然后照射5-18h。在4_5h的間隔之間，過濾溶液以移出部分產(chǎn)物。在濾紙上獲得純形式的固體材料。用蒸餾水(大約15mL)提取殘留在管壁上的剩余的產(chǎn)物。濾紙也用水洗滌以移出水溶性產(chǎn)物。過濾來自一些照射的合并的水提取物并經(jīng)冷凍干燥以分離純的BQS。在開始的過程中BOS高氯 酸鹽通過加入高氯酸水溶液或飽和高氯酸鈉溶液通過其沉淀來分離。重新使用前，輻照容 器依次用丙酮、乙醇、硫酸(I. 0M)、水、稀釋的碳酸鈉溶液(10%)、蒸餾水和丙酮洗滌。最后，在烘箱中干燥不少于24h。4.方法 4該方法用于以改善的收率制備NBQ-95。向含有3mL DMS0_d6、卵形或圓形攪拌棒的小圓底燒瓶中加入0. 15-0. 3g待異構(gòu)化的2-苯乙烯基苯并噻唑(II)樣品。該過程進行得順利，即使2-苯乙烯基苯并噻唑(II)沒有全部溶解在DMSO中。燒瓶放置在光化學(xué)反應(yīng)器中，諸如裝配有350nm燈的Rayonet儀器并在磁力攪拌下照射4_6h時段。在反應(yīng)期末，固體完全溶解并在冷卻至室溫時固化。將反應(yīng)混合物加入到含有50-75mL蒸餾水的燒杯中并攪拌額外的15min。通過真空蒸餾除去沉淀的固體并用三份50mL蒸餾水洗滌。將固體放置于干燥器中并干燥24h時段。將固體溶解于IOOmL無水苯中并用無水硫酸鈉干燥。通過過濾除去硫酸鈉并將透明溶液放置于照射管中并在Rayonet儀器中暴露于350nm光，并如方法I中合成BQS所描述的進行操作。在合成(E)-2-苯乙烯基吲哚和氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗(BQS)并加入氨基取代基和硝基取代基之后，四種選擇的化合物的結(jié)果是I. NBQ-38 (7_乙基_3_硝基氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎗)根據(jù)方法1,2-(21-氯-51-硝基苯乙烯基)-1_乙基苯并咪唑(IIt) (0. 60g,
1.8mmol)經(jīng)光環(huán)化(BQS 方法 I)得到 0. 45g(75 % ) NBQ-38 =1H NMR(DMS0-d6, 300MHz)8 9. 43 (d, J = 9. 0Hz，1H，芳族的)，9. 40 (d, J = 3. OHz, 1H) ,9. 20 (d, J = 9. 0Hz，lH 芳族的)，9. 06 (d，J = 9. OHz，1H，芳族的),8. 78 (dd，J = 9.0,3. 0Hz, 1H，芳族的),8.69 (d，J =
9.0Hz，lH 芳族的)，8. 43 (d，J = 9. 0Hz，IH 芳族的)，8. 05-7. 94 (m，2H，芳族的)，5. 01 (q，J=7. 5Hz,2H, CH2)，I. 50 (t，J = 7.5Hz，3H，Me) ；13C NMR(DMS0_d6，300MHz) 8 31. 3, 111. 7,113. 6，-116. 4，118. 9，123. 9，126. 2，126. 4，126. 8，127. 6，128. 6，132. 7，136. 1，139. 1，143. 9，144. 8 ；IR(KBr) 3400. 0,3350. 0,3025. 0,3000. 0,2950. 0,2925. 0，1618. 0，1570. 2，1527. 6，1473. 2，1451. 0，1427. 2，1384. 3，1346. 5，1373. 0，1253. 0，1253. 4，1208. 8，1161. 4，1088. 8,987. 0,913. 1,812. 9,763. 2,737. 6,696. 7,601. 7,584. 5,556. 3,507. 4,455. 6cm_10化合物分析為高氯酸鹽衍生物。C17H14Cl-N3O6的分析計算值C，52. 12 ;H，3. 60 ；N, 10. 73。實測值C, 52. 08 ；H, 3. 63 ；N, 10. 67。2. NBQ-95 (2_氯_10_甲基_3_硝基氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗)利用方法4從(E)-5-甲基-2-(2，4-二氯-5-硝基苯乙烯基)苯并噻唑(0. 543g，I. 49mmol)起始合成，(E)-5-甲基-2-(2，4-二氯-5-硝基苯乙烯基)苯并噻唑如圖3所述(BQS方法I)在沸騰的醋酐中由2，4-二氯-5-硝基苯甲醛和2，5-二甲基苯并噻唑的縮合來制備。得到的苯乙烯基衍生物(He)經(jīng)光環(huán)化得到0. 22g(41% )NBQ-95黃色固體mp 236-240 °C (dec.) NMR (300. 15MHz, DMSOd6) : S ppm 9. 54 (s，1H)，9. 37 (s，1H)，9. 06 (s, 1H)，9. 00 (s, 2H)，8. 59 和 7. 86 (AB, 2H, J = 8. 4Hz)，2. 74 (s, 3H) ；UV-vis (95 %EtOH) Amax/nm(e) :389 (11196)，380 (11363)，270 (14858)，225sh (21441)和 202(28390)；C16H10Cl2N2O2SH2O 的分析計算值C,50. 14 ；H,3. 16 ；N,7. 31%。實測值C,49. 85 ；H,3. 35 ；N,
7.00%。3. ABQ-38和ABQ-95 (3_氨基_7_乙基氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎗，和3_氨基_2_氣-10-甲基氣化苯并喔唑并[3, 2~a]喧琳鐵)ABQ-38和ABQ-95的氛基前體(分別是(E) _7_乙基_2_(5_氛基_2_氣苯乙稀 基)苯并咪唑IIv和(E)-5-甲基-2-(5-氨基-2，4-二氯苯乙烯基)苯并噻唑IId)通過在干燥的甲醇中在硼化鎳存在下用肼還原相應(yīng)的硝基衍生物而制備，參見圖3。(E)-7-乙基_2_(5_氛基_2_氣苯乙稀基)苯并咪唑IIv如所述(BQS方法I)經(jīng)光環(huán)化得到3_氛基-7-乙基氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎗(ABQ-38)黃色固體 NMR(500. 13MHz,DMS0-d6) 8 ppm 9. 05(d,1H,J = 8. 50Hz)，8. 88(d,1H,J = 9. OHz)，8. 56(d,1H,J = 9. 5Hz,
8.27 (d, 1H, J = 8. 5Hz)，8. 23 (d, 1H, J = 9. 50Hz)，7. 90 (t, 1H, J = 7. 5Hz)，7. 81 (t，1H，J=7. 5Hz)，7. 43 (dd, 1H，J = 8. 5，2. 5)，7. 27 (d, 1H, J = 2. 5Hz)，4. 83 (q, 2H, J = 7. 0Hz)，
I.48(t,3H, J = 7.0Hz) ；UV-vis(95% EtOH)入 MX/nm(e) :409 (1410)，351 (8104)，336 (9815)和271(20866) ;C17H16N3的HRMS計算值(化合物沒有氯化物平衡離子)262. 1，在m/z261. 9實測ESI。(E)-5-甲基-2-(5-氨基-2，4-二氯苯乙烯基)苯并噻唑IId如所述(BQS方法I)經(jīng)光環(huán)化得到3-氨基-2-氯-10-甲基氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎗(ABQ-95)黃色固體 NMR(500. 13MHz，DMS0-d6) : S ppm 9. 17 (s，1H)，8. 92 (s，1H)，8. 63 (AB 四重峰，2H, J = 9. 5Hz)，8. 48 (d, 1H, J = 8. 5Hz)，7. 76 (d, 1H, J = 8. 5Hz)，7. 53 (s, 1H)，6. 50 (m,2H)，2. 70(s，3H) ；UV-vis(95 % EtOH) Amax/nm(e) :429(4417),380(10 387), 282 (22 568)和214 (2650) ；C16H12C1N2S 299. 0的HRMS計算值(沒有氯化物平衡離子)，在m/z 299. OM+實測ESI。在環(huán)A中包括氨基取代基和硝基取代基的(E)-2_苯乙烯基吲哚和氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗的合成得到了提供一些性質(zhì)、更具體地展示了生物活性的增加的ABQ和NBQ。例如，當(dāng)對人類腫瘤細胞系-表皮樣癌A431細胞(ATCC CRL-1555ABQ)檢測時，ABQ化合物展示了(I)細胞內(nèi)結(jié)合；(2)自體熒光；(3)通過由線粒體損傷和胱天蛋白酶3和7活化介導(dǎo)的凋亡活化對惡性細胞的細胞毒性和；(4)細胞器結(jié)合及損傷。關(guān)于細胞器結(jié)合，圖11顯示了 A431腫瘤細胞用具有鑒別干涉對比和電控載物臺的Nikon Eclipse E800寬視野熒光顯微鏡的照片，清楚地說明了這些ABQ(ABQ_38和ABQ-95)與DNA和線粒體結(jié)合的能力。關(guān)于自體熒光，選擇玫瑰樹堿作為熒光陽性對照，因為它是ABQS的結(jié)構(gòu)類似物。通過范圍從0至50uM的濃度處理A431細胞培養(yǎng)物(一式二份)來測定A431中玫瑰樹堿的IC50劑量。每個平板上的最終體積是9mL含有細胞整份試樣、介質(zhì)和藥物的修飾的RPMT1640。細胞暴露于IC50濃度的ABQS和玫瑰樹堿，孵育并在72小時期間通過倒置顯微鏡監(jiān)視。具有U濾光鏡、40X物鏡的Olympus CKX41倒置熒光顯微鏡(50w Hg燈)。利用Q捕獲軟件獲取暴露13-17秒時的照片。利用陰性和陽性對照作為參考來區(qū)分自體熒光細胞和非自體熒光細胞。圖11和圖12用熒光顯微鏡(Olympus CKX41)顯示了 A431腫瘤細胞的ABQ38的自體熒光。圖像清楚地顯示了 ABQ作為細胞相互作用的標(biāo)記的自體熒光能力。關(guān)于細胞毒性，為了測定BQS的細胞毒性，5X IO6個細胞的一式兩份培養(yǎng)物接種在25cm2的燒瓶中。每個平板的最終體積是9mL含有細胞整份試樣、介質(zhì)和本發(fā)明的BQS的修飾的RPMT 1640。然后孵育細胞4小時，使細胞粘附在燒瓶上。用范圍5uM至IOOuM的濃度的BQS培養(yǎng)細胞48小時。在每個實驗中包括了用超純水(媒介物)處理的陰性對照。用不同濃度的每個化合物處理培養(yǎng)的細胞以通過測定IC5tl或50%的細胞群的抑制來測定其生長抑制效價。在暴露期末，除去介質(zhì)并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗培養(yǎng)物兩次以除去溶液中的化合物。用5%胰蛋白酶分離細胞，離心，在新鮮的介質(zhì)中再懸浮并通過細胞存活力方案諸如錐藍排除分析計數(shù)。計算細胞存活并用Microsoft Excel 軟件對時間繪圖。圖12顯示了與其硝基取代類似物相比獲得的ABQ的IC50%如下NBQ38 36uM ；ABQ38 32uM ；NBQ95 28uM 和 ABQ95 :36uM。關(guān)于由膜滲透性和胱天蛋白酶活化介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)，程序性細胞死亡(凋亡)被證實為主要的細胞死亡機制，利用線粒體膜的滲透性作為指示。進行了兩次重復(fù)實驗。將培養(yǎng)的細胞暴露于IC50濃度的BQ并孵育48小時。對照包括作為陽性對照的纈氨霉素(5uM)和作為陰性對照的超純水。在處理期末，用PBS洗滌細胞，用5%胰蛋白酶分離并離心。為每個樣品制備細胞整份試樣并根據(jù)生產(chǎn)商說明書用Mito PT 測定(免疫化學(xué)技術(shù)LLC)染色一小時。通過具有U感光濾光片和40X物鏡的倒置熒光顯微鏡同時觀察凋亡(527nm)和非凋亡(590nm)細胞。利用陰性和陽性對照作為參照區(qū)分凋亡細胞(綠色)與非凋亡的細胞(紅橙)。為了定量凋亡分析，處理之后計數(shù)大約5 X IO6個細胞的整份試樣并用Mito PT 染料染色。通過用單管模量(Turner Biosystem熒光計)測量527nm處熒光單體信號和590nm處J聚集評測了樣品熒光。觀察到了藍色濾光鏡捕獲的相應(yīng)于凋亡細胞(527nm)的515-570nm之間的發(fā)射；關(guān)于所述濾光鏡的高熒光強度揭示了受損的線粒體膜。綠色濾光鏡捕獲范圍為580-640nm的發(fā)射并檢測健康細胞(590nm);在此通道中的高熒光強度揭示了健康的線粒體。因為ABQ在熒光染料的發(fā)射波長附近微弱地發(fā)射熒光，我們用兩種濾光鏡(藍色和綠色)來測量染色的整份試樣和未染色的整份試樣的熒光用于本底測定和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。計算了數(shù)據(jù)并通過扣除來自陰性對照的任何本底熒光進行了兩次標(biāo)準(zhǔn)化。計算了凋亡細胞的百分?jǐn)?shù)并用Microsoft Excel 軟件對藥物繪圖。圖13說明了選擇的BQS (NBQ-38、ABQ-38、NBQ-95和ABQ-95)對線粒體膜滲透性的能力之間的比較。另外，對于胱天蛋白酶3和7活化，應(yīng)用了基于與活性胱天蛋白酶結(jié)合的酶的比色測定諸如源于免疫化學(xué)技術(shù)的Magic Red 測定。在凋亡過程中，位于溶酶體的酶原裂解成為DEVD酶一胱天蛋白酶3和7的活性酶(Belloc，F(xiàn).等人2000)。酶原是非活性酶前體，其需要生物化學(xué)變化(裂解)來暴露其活性位點(Biagiotti, E0等人2000 ；Lee, B. W.，2003)。利用Magic Red 測定，具有非活性胱天蛋白酶3和7的凋亡細胞不發(fā)熒光，而具有活性胱天蛋白酶3和7的細胞發(fā)紅色熒光，表明陰性或陽性凋亡。文獻表明十字孢堿和順鉬誘導(dǎo)涉及胱天蛋白酶3和7的凋亡(Zhang, X. D.等人2004 ；Blanc, C.等人2000)，使順、鉬和十字孢堿成為合適該測定的陽性對照。使用了細胞培養(yǎng)基，諸如RPMI 1640，所述培養(yǎng)基用被添加以改善細胞復(fù)制并阻止細菌污染的額外的營養(yǎng)素和添加劑諸如胎牛血清和抗生素來改進。5X IO6個細胞的細胞培養(yǎng)物接種在25cm2細胞培養(yǎng)瓶中(兩份)。每個平板上的最終體積是9mL含有細胞整份試樣、介質(zhì)和藥物的修飾的RPMT 1640。對于凋亡誘導(dǎo)能力，順鉬(3uM)和十字孢堿(IuM)用作陽性對照且未處理的細胞作為陰性對照。在處理時間結(jié)束時，細胞用PBS洗滌，用5%胰蛋白酶分離細胞并離心。計數(shù)細胞并用甲酚紫(熒光染料)染色整份試樣一小時。用倒置顯微鏡定性地監(jiān)視活性胱天蛋白酶3和7，在用40X物鏡暴露9秒時用G濾光鏡捕獲細胞圖像。利用陰性和陽性對照作為參照區(qū)分凋亡細胞(紅色)和未凋亡的細胞(無熒光的)。制備最近的5X IO5個暴露細胞的整份試樣并根據(jù)生產(chǎn)商說明書(進行稍微的修改)用染料染色。如圖12所觀察到的，胱天蛋白酶3和7活化的順序如下順鉬51±13% = ABQ38 51±1%>ABQ95 :46±6%>BQ108 :27±5%>NBQ38 :22±7%和陰性對照0±1%。ABQ38在暴露48小時呈現(xiàn)出最高的胱天蛋白酶3和7活化。
本發(fā)明不限于上述精確的配置。雖然本發(fā)明已被描述為具有優(yōu)選的設(shè)計，然而，應(yīng)該理解的是在考慮本說明書和附圖之后，本發(fā)明的許多改變、修飾、變化和其它用途和應(yīng)用對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，而在實質(zhì)上不偏離本發(fā)明的新穎的教導(dǎo)和優(yōu)勢。因此，不偏離本發(fā)明的精神和范圍的所有這樣的改變、修飾、變化和其它用途和應(yīng)用視為被本發(fā)明所覆蓋，如以下權(quán)利要求和其法律等價物所限定的。在權(quán)利要求中，手段加功能語句(如果有的話)意圖覆蓋本文描述的結(jié)構(gòu)為進行列舉功能且不僅是結(jié)構(gòu)等價物也是等價結(jié)構(gòu)。本文及所附聲明(如果有的話)中引用的所有的專利、專利申請和出版物在此通過引用并入，如同其整體在本文提出。在這些專利中公開的所有或基本所有組分可用于本發(fā)明的實施方案中及其等價物中。在此通過引用并入的專利、專利申請和出版物的細節(jié)可被認(rèn)為在起訴過程中可根據(jù)申請人的選擇并入到權(quán)利要求中，在權(quán)利要求中作為進一步限定以專利性地區(qū)分任何修改的權(quán)利要求與任何應(yīng)用的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，所述化合物由如下組成 C4 I —R iJ R2+ D C I * 其中R1是硝基且X選自由硫和NR組成的組，所述方法包括如下步驟 a.硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的合成； b.硝基的還原；和 c.所述硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的光誘導(dǎo)環(huán)化過程以產(chǎn)生生物熒光的氨基取代的氯化吲哚并[3，2_a]喹啉鎗鹽。
2.如權(quán)利要求I所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中硝基的還原包括利用硼化鎳作為催化劑的肼。
3.如權(quán)利要求I所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的合成包括 a.將等摩爾混合物溶解于摩爾過量的醋酐中并回流18h至24h，其中所述等摩爾混合物由2-氯取代的苯甲醛和2-甲基吲哚衍生物組成； b.使所述等摩爾混合物在23°C_25°C之間的溫度冷卻，其中沉淀出固體；和 c.分離沉淀的固體并將所述固體進行重結(jié)晶過程。
4.如權(quán)利要求3所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中所述沉淀的固體通過過濾分離，用醋酐或冷的2 I己烷/丙酮混合物洗滌。
5.如權(quán)利要求3所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中所述重結(jié)晶過程包括選自丙酮、己烷/丙酮I : I混合物、環(huán)己烷或甲苯的有機非質(zhì)子溶劑。
6.如權(quán)利要求I所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的合成包括 a.在23°C_25°C之間的溫度和恒定攪拌下，將等摩爾溶液加入50%氫氧化鈉溶液，其中所述等摩爾溶液由在大約IOmL 二甲基亞砜中的2-甲基苯并噻唑和2-氯-6-取代的苯甲醛組成； b.攪拌所述等摩爾溶液額外的5-15min； c.加入水并攪拌約5min直到固體沉淀；和 d.分離沉淀的固體并將所述固體進行重結(jié)晶過程。
7.如權(quán)利要求6所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中所述沉淀的固體通過真空過濾分離。
8.如權(quán)利要求6所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中所述重結(jié)晶過程包括甲苯或丙酮。
9.如權(quán)利要求6所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中加入所述等摩爾混合物的步驟包括在沸騰的醋酐中回流所述等摩爾溶液與小量的2-甲基吲哚衍生物，持續(xù)48h至168h之間的反應(yīng)時間。
10.如權(quán)利要求I所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中硝基取代的2-(2-氯苯乙烯基)苯并噻唑的合成包括如下步驟， a.向一份(E)-2-苯乙烯基吲哚中加入二甲氧基乙烯中的2.2當(dāng)量的NaH，產(chǎn)生第一反應(yīng)混合物； b.在23°C-25°C之間的溫度攪拌所述第一反應(yīng)混合物30min ； c.用烷化劑烷基化，其中所述烷化劑鹵代烷在23°C_25°C之間的溫度緩慢地加入，產(chǎn)生第二反應(yīng)混合物，其中所述第二反應(yīng)混合物由每當(dāng)量(E)-苯乙烯基苯并咪唑I. 5當(dāng)量的烷化劑組成； d.在氮氣氣氛下攪拌所述第二反應(yīng)混合物6-24h； e.在冰水浴中冷卻所述第二反應(yīng)混合物并加入水直到固體沉淀；和 f.在真空下過濾所述固體沉淀，用I: I丙酮/己烷混合物洗滌并風(fēng)干。
11.如權(quán)利要求I所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中所述光誘導(dǎo)環(huán)化過程包括 a.選擇能透過350nm波長的容器和輻照裝置，其中所述輻照裝置裝配有350nm波長燈； b.將優(yōu)選的量的(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚放置于所述容器內(nèi)；和 c.用所述輻照裝置照射所述容器預(yù)選的以一定間隔分開的時間，其中每個間隔將溶液過濾以移出部分純形式的硝基取代的氯化吲哚并[3，2_a]喹啉鎗鹽化合物并提取殘留在容器壁上的剩余的所述硝基取代的氯化吲哚并[3，2_a]喹啉鎗鹽化合物。
12.如權(quán)利要求11所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2_a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中放置于所述容器內(nèi)的所述優(yōu)選的量包括溶解于150-250mL的3 I苯二噁烷混合物中的0. 2-1.0克所述(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚且所述照射時間是間隔4-6小時的10-18小時。
13.如權(quán)利要求11所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中放置于所述容器內(nèi)的所述優(yōu)選的量包括溶解于150-250mL的2 : I : I苯溴苯二噁烷混合物中的0. 2-1. Og所述(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚。
14.如權(quán)利要求11所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中放置于所述容器內(nèi)的所述優(yōu)選的量包括溶解于150-250mL的3 I苯二噁烷混合物中的0. 2-1. Og所述(E)-2-(2-氯苯乙烯基)吲哚(II)，其中所述混合物首先用氬氣脫氣，然后以4-5h的間隔照射5-18h。
15.如權(quán)利要求11所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中殘留在所述容器壁上的所述硝基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物用蒸餾水提取并過濾。
16.如權(quán)利要求15所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中所過濾的水經(jīng)冷凍干燥以分離純的BQS。
17.如權(quán)利要求I所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中所述光誘導(dǎo)環(huán)化過程包括 a.選擇具有攪拌棒的燒瓶和輻照裝置，其中所述輻照裝置裝配有350nm燈；b.用混合物填充所述燒瓶，其中所述混合物包括3mL甲基亞砜； c.將2-苯乙烯基苯并噻唑加入所述混合物中； d.將所述燒瓶置于所述輻照裝置處，并在磁力攪拌下照射所述混合物4-6h的時間，直到固體完全溶解并在23°C _25°C之間的溫度下固化，產(chǎn)生反應(yīng)混合物； e.將所述反應(yīng)混合物加入到含有50-75mL蒸餾水的燒杯中并攪拌約15min直到第一固體沉淀； f.移出第一沉淀固體并將所述第一沉淀固體放入干燥器中； g.使所述第一沉淀固體干燥選定的時間；和 h.將所述第一沉淀固體溶解于IOOmL干燥的苯中并干燥所述第二固體。
18.如權(quán)利要求17所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中所述選定的時間是24小時且在所述第一沉淀固體溶解于IOOmL干燥的苯中之后用無水硫酸鈉干燥。
19.如權(quán)利要求18所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中干燥所述沉淀固體之后，所述硫酸鈉通過過濾除去并將得到的溶液放置于輻照容器中并在所述輻照裝置處暴露于350nm光。
20.如權(quán)利要求17所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中移出所述第一沉淀固體包括通過真空蒸餾移出所述第一沉淀固體并用蒸餾水洗滌所述第一沉淀固體。
21.如權(quán)利要求17所述的氨基取代的氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎗鹽化合物的合成方法，其中放置于燒瓶中的所述混合物包括0. 15-0. 3g待異構(gòu)化的2-苯乙烯基苯并噻唑。
全文摘要
氯化吲哚并[3，2-a]喹啉鎓鹽的合成方法，加入氨基取代基和硝基取代基得到四種化合物諸如NBQ-38(7-乙基-3-硝基氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎓)、NBQ-95(2-氯-10-甲基-3-硝基氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎓)、ABQ-38(3-氨基-7-乙基氯化苯并咪唑并[3，2-a]喹啉鎓)和ABQ-95(3-氨基-2-氯-10-甲基氯化苯并噻唑并[3，2-a]喹啉鎓)，其中所述方法提供了化合物生物活性的增加。所述化合物還用于細胞內(nèi)結(jié)合、通過由線粒體損傷和胱天蛋白酶3和7活化介導(dǎo)的凋亡活化對惡性細胞的細胞毒性、細胞器結(jié)合及損傷，和由于自體熒光性質(zhì)的標(biāo)記。
文檔編號C07D471/00GK102762555SQ201080021846
公開日2012年10月31日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者奧斯瓦爾多·考克斯, 比阿特麗斯·扎亞斯 申請人:奧斯瓦爾多·考克斯, 比阿特麗斯·扎亞斯