專利名稱：豬A組輪狀病毒Vp4全基因真核表達質粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物基因領域，具體涉及豬A組輪狀病毒Vp4全基因的基因序列、Vp4全基因的克隆、構建真核表達質粒、以及在真核細胞中的表達。
背景技術：
輪狀病毒(Rotavirus，RV)是引起嬰幼兒和各種幼齡動物非細菌性腹瀉的主要病原之一。RV性腹瀉是一種世界性傳染病。自1969年Mebus等首次從犢牛腹瀉中分離出輪狀病毒(RV)以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)該病毒是引起嬰幼兒及幼齡動物腹瀉并致死亡的主要病原體。輪狀病毒引起的感染在發(fā)展中國家每年造成近百萬嬰幼兒死亡。A組RV是引起全世界嬰幼兒嚴重腹瀉的最重要病原，在發(fā)展中國家，每年發(fā)生中度和嚴重腹瀉的兒童約18000000人，死于輪狀病毒感染的超過350000～390000人；在發(fā)達國家，由于RV腹瀉導致脫水是兒童住院的一個常見病因，醫(yī)療費用高，據(jù)估計美國每年直接的醫(yī)藥損失達2億6千萬美元。2004年11月，廣州輪狀病毒日感染近千人。2005年2月，孟加拉國共有190000人感染輪狀病毒，其中32人死亡。在動物性腹瀉中，仔豬、小綿羊、馬、狗、貓、兔、牛、雞、火雞雛、橫河猴、鼠等出生動物常感染發(fā)病[10]。自1982年我國首次分離到水牛輪狀病毒后，已相繼發(fā)現(xiàn)豬、牛、羊、犬、兔和多種禽類的RV感染報道，并已發(fā)現(xiàn)或分離鑒定了病毒。據(jù)對華東地區(qū)牛、豬血清中輪狀病毒抗體的調查，奶牛、黃牛和豬群的抗體陽性率分別達到85.4％、83.0％、68.3％。表明我國動物輪狀病毒感染較普遍，感染率也很高。輪狀病毒主要侵害幼齡畜禽，15~30日齡的仔豬輪狀病毒感染最為普遍；牛的發(fā)病年齡從出生到60日齡不等，但以15~40日齡發(fā)病率最高；兔和雞的易感期是30~70日齡和7~30日齡。成年動物對輪狀病毒也有易感性。仔豬感染PRV后，因腹瀉使機體免疫力急劇下降，易繼發(fā)多種細菌性感染，導致仔豬存活率下降，存活者生長緩慢或停滯。近年來，隨著養(yǎng)豬數(shù)量的增加，本病的流行范圍不斷擴大，發(fā)病率不斷增加。其發(fā)病率最高可達80％，14日齡以內新生仔豬的病死率可達100％，我國是養(yǎng)豬大國，仔豬存活率低給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。一般認為RV只引起消化系統(tǒng)損害，但近年來的研究表明RV感染可引起多臟器損害，病毒血癥是RV多系統(tǒng)播散的途徑。動物感染RV后對生產和生長有較大影響，造成嚴重的經濟損失。環(huán)境衛(wèi)生和用水衛(wèi)生條件的改善，不能減少輪狀病毒的發(fā)病頻率。由于目前尚無治療輪狀病毒的特效藥物，因此預防顯得尤為重要。為此，世界衛(wèi)生組織多次呼吁各國科學家研制開發(fā)有效的輪狀病毒疫苗，并將其列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項目之一。指出疫苗預防才是遏制輪狀病毒腹瀉唯一有效的手段。因此認為控制輪狀病毒疾病的發(fā)生，必須從疫苗的研制著手。縱向研究表明，不論發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，嬰幼兒輪狀病毒的重復感染都十分常見，尤其在出生后的最初幾年內。與初次感染相比，再次感染癥狀一般較溫和，或者為無癥狀感染，這一研究結果肯定了用疫苗免疫嬰兒可以預防重癥輪狀病毒疾病。據(jù)估計，如果使用有效的疫苗，每年在全世界可以挽救500000~1000000個兒童的生命。疫苗預防是控制此病的最佳選擇。雖然當前的弱毒疫苗在預防該病的發(fā)生上起到了重要的作用，但與核酸疫苗相比，它仍存在弱毒疫苗的相對不穩(wěn)定，易返祖，潛在感染等缺陷。隨著分子生物學的深入研究，新型DNA疫苗的問世為豬輪狀病毒的診斷和預防提供了一條嶄新的途徑。DNA疫苗是自1992年開始迅速發(fā)展起來的一種新型疫苗，被認為是第三代疫苗。DNA疫苗的優(yōu)點在于DNA疫苗能有效地刺激機體產生持久的體液免疫和細胞免疫，并顯示出它作為第3代疫苗的優(yōu)越性。傳統(tǒng)的亞單位疫苗不能誘導機體產生細胞免疫。而DNA疫苗在細胞內表達的蛋白抗原通過MHCI類分子呈遞抗原，從而激活CTL及殺滅靶細胞。這一點對輪狀病毒來講尤為重要。同時DNA疫苗還兼有重組亞單位疫苗的安全性和減毒活苗的誘導全面免疫應答的高效性。此外，DNA疫苗還易于生產，穩(wěn)定性強及安全可靠。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用基因工程技術，將RV的外殼蛋白VP4基因表達出來作抗原，制取豬A組輪狀病毒Vp4全基因真核表達質粒。
本發(fā)明的技術方案是從培養(yǎng)的RV中用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術擴增Vp4全基因，開放閱讀框含2331bp，編碼776個氨基酸。通過T-A克隆技術，將PCR產物克隆至克隆載體pGEM-T載體中，獲得重組克隆質粒pGEM-T-Vp4。將重組克隆質粒pGEM-T-Vp4及表達載體pVAX1均以KpnI和BamHI雙酶切，純化回收后，以T4DNA連接酶連接、轉化，構建真核重組表達質粒pVAX1-Vp4。
從培養(yǎng)的RV中用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術擴增Vp4全基因，通過T-A克隆技術，將PCR產物克隆至克隆載體pGEM-T載體中，獲得重組克隆質粒pGEM-T-Vp4；經DNASTAR軟件分析核苷酸序列和氨基酸序列是1 atg gct tcg ctc att tat aga caa cta ctt act aat tca tac aca gtc1 Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val49 aat ctt tct gac gaa att caa gag att gga tca gct aag tca cag gat17 Asn Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Ala Lys Ser Gln Asp97 gtt act ata aat cct ggt cca ttc gca cga acs ggt tat gca cca gtt33 Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Arg Thr Gly Tyr Ala Pro Val145aat tgg gga gca ggt gag act aat gac tcc aca act gtc gag ccg tta49 Asn Trp Gly Ala Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu193tta gat ggt cca tac caa cca acc act ttc aat cca cca aca agc tat65 Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr241tgg gta cta ctt gcg cca act gta gag ggc gta att att caa gga aca81 Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr289aac aat acc gat aga tgg ttg gcc act ata cta att gaa cca aac gta97 Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val337caa aca act aac aga ata tac aat ctt ttt ggt cag caa gta act tta113Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu385tcg gtg gag aat acg tca cag aca caa tgg aag ttc att gat gtg agt129Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser433aca act acg cca aca gga agt tat acg cag cac gga cca ttg ttc tct145Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser
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1、重組表達質粒的構建重組克隆質粒pGEM-T-Vp4及表達載體pVAX1均以KpnI和BamHI雙酶切，純化回收后，以T4DNA ligase于室溫連接2h后，4℃過夜，10ul連接反應體系如下pVAX1 1.0ul，Vp4 2.0ul，2×ligation Buffer 5.0ul，T4DNAligase 1.0ul，D.D.W 1.0ul.
2、重組表達質粒的篩選將5ul連接產物轉化到感受態(tài)E.coli DH5a中，轉化產物涂布于LB(Kan，50ug/ml)瓊脂平板中。以堿裂解法小量提取質粒，進行1％瓊脂糖凝膠電泳分析。選取滯后的質粒以KpnI，BamHI雙酶切及PCR鑒定重組表達質粒。
真核重組表達質粒pVAX1-Vp4實施步驟如下1、重組表達質粒的大量提取將鑒定為重組表達質粒的陽性菌株接種于150ml含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜，以堿裂解法大量提取重組表達質粒，并以PEG法進行純化。
2、質粒的定量與純度的鑒定以紫外分光光度計測定提取質粒的260nm和280nm光密度值。按經驗公式DNA含量(ug/ml)＝OD260×50ug/ml計算質粒DNA的含量，以D260/OD280的比值在1.8-2.0范圍內，且瓊脂糖凝膠電泳檢測未見RNA帶，表明所提取的質粒純度較高，可用于細胞轉染。
3、真核重組表達質粒轉染MA-104細胞真核重組表達質粒轉染MA-104細胞按LipofectamineTM2000使用說明書進行，具體操作如下(1)在轉染前一天將MA-104細胞用胰酶消化下來，接入細胞培養(yǎng)板(6孔板)中，每孔加2mlRPMI1640生長液(不加雙抗)，5％二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h。分設重組表達質粒組，pVAXI對照組和正常細胞對照組。(2)接入的細胞量能使轉染時貼壁細胞在培養(yǎng)皿底部占到表面積約80％，一般可用一塊蓋玻片(預先用無水乙醇浸泡數(shù)天)放入細胞培養(yǎng)板孔底，需在紫外下照射數(shù)天，目的嚴格無菌，一般接入的細胞在1×105-2×105個細胞。(3)在250ul無血清無雙抗的RPMI1640生長液中加入10ul脂質體，輕輕混勻，作用5min。(4)另取250ul無血清無雙抗的RPMI1640生長液中加入4ug重組質粒，輕輕混勻，作用5min。(5)將4滴加到3中，慢慢混勻，室溫30min。(6)將5加入培養(yǎng)好的細胞培養(yǎng)皿中，共轉染。6小時后加入1.5ml含有8％血清，2％雙抗的RPMI1640生長液。5％二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18-42h。
本發(fā)明的有益效果是它按一定的量通過肌肉注射到體內能有效地刺激機體產生持久的體液免疫和細胞免疫，細胞免疫是在細胞內把表達的蛋白抗原通過MHCI類分子呈遞抗原，從而激活CTL及殺滅靶細胞。這一點對輪狀病毒來講尤為重要。同時它既安全又有誘導全面免疫應答的高效性。此外，它還易于生產，穩(wěn)定性強及安全可靠。本發(fā)明的DNA疫苗的研究是通過將pVAXI-Vp4免疫BALB/c鼠，檢測其血清抗體和脾臟中的淋巴細胞增殖情況及CD4+，CD8+T細胞的數(shù)量變化情況，結果表明，豬A組輪狀病毒Vp4全基因不但在哺乳動物細胞中獲得了表達，而且將真核重組表達質粒pVAXI-Vp4給動物免疫后，獲得了免疫效果。這為pVAXI-Vp4 DNA核酸疫苗的進一步推廣應用提供科學依據(jù)。
本發(fā)明對實驗動物免疫，血樣采集，脾細胞處理將BLAB/c小鼠隨機分成A，B，C三組，每組30只。用滅菌生理鹽水將大量制備并經過檢測符合要求的真核重組表達質粒pVAXI-Vp4和真核表達載體pVAXI稀釋，每種質粒終濃度為1ug/ul。普魯卡因按終濃度0.5％加入到質粒中。對各組小鼠進行注射免疫，每側肌肉注射50ul。A組注射pVAX1-Vp4；B組注射pVAX1；C組注射生理鹽水。以后按同樣方法間隔二周加強免疫，共免疫三次。免疫前隨機取5只小鼠眼眶靜脈取血，收集血樣，脫臼處死取脾細胞，分別進行血清抗體和脾細胞中CD4+，CD8+T細胞相對數(shù)量檢測。免疫后于第14，28，42天各組分別隨機取5只小鼠，用同樣方法收集血樣及處理脾細胞。
抗體檢測 用ELISA法測待檢血清抗RV抗體的OD492值。用包被緩沖液將RV抗原按160ug/孔稀釋包被反應板。將待檢血清用PBS作1∶200稀釋后，每孔100ul，HRP羊抗鼠IgG用PBS稀釋至工作濃度，每孔100ul。按常規(guī)方法操作。輪狀病毒抗原的制備取200ml用MA-104細胞培養(yǎng)的輪狀病毒液，5000轉離心30min，取上清20000轉離心1h。沉淀溶于0.5ml的生理鹽水中。
用分光光度計測定輪狀病毒蛋白的含量按下列公式計算OD280×1.45-OD260×0.74＝蛋白含量(mg/ml)用包被緩沖液將RV抗原按160ug/孔稀釋包被反應板。將待檢血清用PBS作1∶200稀釋后，每孔100ul，HRP羊抗鼠IgG用PBS稀釋至工作濃度，每孔100ul。按常規(guī)方法操作。
用自動酶標測定儀在波長492處測定各孔的光吸收值(OD492值)。用SAS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。
T淋巴細胞轉化實驗無菌分離脾淋巴細胞，以MTT法測定淋巴細胞的增殖反應，以反映免疫鼠體內的細胞免疫水平。
小鼠于42天脫臼處死，置75％乙醇溶液中浸泡1-2min以消毒皮膚。無菌取脾置于滅菌的紗布中，輕輕揉搓，制成脾細胞懸液。
脾細胞計數(shù)，活細胞數(shù)在90％以上，調整細胞濃度為5×106個/ml。每孔加入100ul脾細胞懸液，共8孔。其中4孔加100ulConA，另4孔加100ulRPMI1640生長液做空白對照。
將細胞培養(yǎng)板放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育68h。
每孔加入20ul MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入100ulDMSO，振蕩10min，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定OD570，計算刺激指數(shù)(stimulation index，SI)，SI＝OD570實驗組/OD570對照組。用Spss 11.0分析。
CD4+CD8+T細胞檢測 脾細胞樣品在采集后2h內送吉林大學第一醫(yī)院基礎部，用流式細胞儀(FACSCalibur)檢測10000個脾細胞中CD4+，CD8+T細胞的相對數(shù)量(％)。用SAS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。
抗體檢測重組表達質粒pVAXI-Vp4免疫后的ELISA抗體檢測結果顯示，A組鼠血清在首免后第14天即可檢出抗RV陽性抗體(P/N＞2.0)，以后在第28、42天分別檢出了抗RV陽性抗體(P/N＞2.0)，說明免疫后抗原基因在BLAB/c鼠體內得到了表達，表達的抗原基因誘導鼠產生了體液免疫應答。結果見表1.
表1 重組表達質粒pVAX1-Vp4免疫后的抗體應答Table1Antibody responses in mice after vaccination withrecombinant plasmid pVAXI-Vp4

注A和B有顯著差異，B與B差異不顯著.
淋巴細胞轉化實驗淋巴細胞轉化試驗是檢測機體細胞免疫功能狀態(tài)常用的一個指標。無菌分離免疫小鼠脾淋巴細胞，用ConA作為刺激劑刺激淋巴細胞增殖。實驗結果顯示，Vp4組與pVAXI和生理鹽水對照組的淋巴細胞增殖反應存在顯著差異(p＜0.05).這一點與流式細胞術對實驗組的CD4+T細胞數(shù)量的檢測結果一樣。
表2 免疫鼠 淋巴細胞轉化結果與分析Table 2Results and analysis of lymphocyte transformation test ofthe immunized mice

注a，b，c，d字母不同者差異顯著，相同者不顯著。CD4+，CD8+T細胞檢測首次免疫后，A組小鼠脾臟中CD4+，CD8+T細胞數(shù)量與B、C組相比均有顯著差異(P＜0.05)，并明顯高于B、C組，說明免疫后抗原基因在小鼠體內得到了表達，CD4+T細胞和CD8+T細胞被有效激活后發(fā)生了擴增。見表3和表4。
表3 重組表達質粒pVAXI-Vp4免疫后的脾細胞中CD4+T細胞的數(shù)量(％)變化Table 3 Alteration of CD4+T Lymphocytes in Spleen of mice aftervaccination with recombinant plasmid pVAXI-Vp4

(注表中A與B有顯著差異，B、C與C無顯著差異)表4 重組表達質粒pVAXI-Vp4免疫后的脾細胞中CD8+T細胞的數(shù)量(％)變化Table 4Alteration of CD8+T Lymphocytes in Spleen of mice aftervaccination with recombinant plasmid pVAX1-Vp4

(注表中A與B有顯著差異，B、C與C無顯著差異)


圖1是本發(fā)明真核表達質粒構建圖譜。
具體實施例方式
實施例1一、豬A組輪狀病毒W(wǎng)a株Vp4全基因的克隆與序列分析1.Vp4全基因的克隆和擴增根據(jù)GenBank中(X13190)豬輪狀病毒W(wǎng)a株Vp4的基因序列，設計一對擴增該基因的PCR引物(由大連TaKaRa公司合成)P15’-GTAGTCGACATGGCTTCGCTCATTTATAGA-3’；P25’-CCTGGTACCTTACAGTCTACATTGCATGATTA-3’(劃線序列分別為SaLI、KpnI酶切位點)。
按Trizol試劑盒方法提取豬輪狀病毒總RNA；以總RNA為模板，以P1、P2為引物，對Vp4基因進行RT-PCR擴增。50μl反轉錄反應體系及反應條件如下取10μl mRNA，75C加熱5min，使雙鏈RNA變性，迅速置于冰上冷卻后，再加入5×AMV Buffer 10.0μl；dNTPs 4.0μl(2.5mM each)；RNasin 1μl；下游引物0.5μl；AMV(5Units/μl)0.5μl；Olig(dt)1.0μl；MgCl2(25mM)4.0μl；加DEPC水19.0μl。42C反轉錄1h，95C煮沸5min滅活AMV反轉錄酶。50μl PCR反應體系及反應條件如下取經DEPC處理的0.5ml EP管，在50μl反應體系中加入10×PCR Buffer 5.0μl；dNTP(2.5mM)8.0μl；上游引物1μl；下游引物1μl；cDNA 5μl；RNasin 1μl；MgCl22.0μl；EX-Taq 0.5μl；DEPC水26.5μl。反應條件為94C預變性8min；94C變性1.5min，45C退火1min，72C延伸3.5mins，共35 cycles；72C延伸10min。PCR反應結束后，取5μlPCR擴增產物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳分析。
2.序列分析PCR產物經純化后，以T4 DNA連接酶連接于pGEM-T Vector中，并轉化至感受態(tài)E.coli JM109中。通過質粒提取、酶切分析及PCR擴增鑒定重組克隆，獲得重組質粒pGEM-T-Vp4。送至大連TaKaRa公司進行測序，并應用DNASTAR軟件進行分析。
二、真核表達質粒的構建、真核細胞中的表達1.真核表達質粒的構建及鑒定重組克隆質粒pGEM-T-Vp4及表達載體pVAX1均以KpnI和BamHI雙酶切，純化回收后，以T4DNA ligase于室溫連接2h后，4℃過夜，10ul連接反應體系如下pVAX1 1.0ul，Vp4 2.0ul，2×ligation Buffer 5.0ul，T4DNAligase 1.0ul，D.D.W 1.0ul.
將5ul連接產物轉化到感受態(tài)E.coli DH5a中，轉化產物涂布于LB(Kan，50ug/ml)瓊脂平板中。以堿裂解法小量提取質粒，進行1％瓊脂糖凝膠電泳分析。選取滯后的質粒以KpnI，BamHI雙酶切及PCR鑒定重組表達質粒。
重組表達質粒的鑒定結果以堿裂解法小量提取質粒，通過質粒大小分析，限制性內切酶KpnI/BamHI酶切分析，PCR擴增鑒定陽性重組表達質粒。結果得到了約3000bp的pVAX1載體片段和2331bp的Vp4目的基因片段。PCR擴增也得到了2331bp的Vp4目的基因片段。成功地構建出了Vp4基因的真核表達質粒。
2.真核表達質粒的純化和定量將鑒定為重組表達質粒的陽性菌株接種于150ml含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜，以堿裂解法大量提取重組表達質粒，并以PEG法進行純化。
以紫外分光光度計測定提取質粒的260nm和280nm光密度值。按經驗公式DNA含量(ug/ml)＝OD260×50ug/ml計算質粒DNA的含量，以OD260/OD280的比值在1.8-2.0范圍內，且瓊脂糖凝膠電泳檢測未見RNA帶，表明所提取的質粒純度較高，可用于轉染和免疫。
3.MA-104細胞中的表達和鑒定真核重組表達質粒轉染MA-104細胞按LipofectamineTM2000使用說明書進行，具體操作如下(1)在轉染前一天將MA-104細胞用胰酶消化下來，接入細胞培養(yǎng)板(6孔板)中，每孔加2mlRPMI1640生長液(不加雙抗)，5％二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h。分設重組表達質粒組，pVAXI對照組和正常細胞對照組。(2)接入的細胞量能使轉染時貼壁細胞在培養(yǎng)皿底部占到表面積約80％，一般可用一塊蓋玻片(預先用無水乙醇浸泡數(shù)天)放入細胞培養(yǎng)板孔底，需在紫外下照射數(shù)天，目的嚴格無菌，一般接入的細胞在1×105-2×105個細胞。(3)在250ul無血清無雙抗的RPMI1640生長液中加入10ul脂質體，輕輕混勻，作用5min。(4)另取250ul無血清無雙抗的RPMI1640生長液中加入4ug重組質粒，輕輕混勻，作用5min。(5)將4滴加到3中，慢慢混勻，室溫30min。(6)將5加入培養(yǎng)好的細胞培養(yǎng)皿中，共轉染。6小時后加入1.5ml含有8％血清，2％雙抗的RPMI1640生長液。5％二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18-42h.收集轉染細胞，提取總RNA，進行RT-PCR鑒定。具體步驟如下(1)以生理鹽水洗滌轉染細胞，向細胞沉淀中加入0.5mlTRIzol試劑，反復吹打，室溫放置5min，使蛋白溶解。(2)加入0.1ml氯仿，用力搖勻15sec，室溫靜置3min，4℃12000轉離心15min。(3)將上層水相轉移至新的離心管中，加異丙醇0.25ml，室溫靜置3min，4℃12000轉離心10min。(4)棄上清，加0.5ml 75％乙醇洗滌沉淀，8000轉離心5min。
(5)棄上清，空氣干燥10min，用15ul DEPC水溶解總RNA，55℃水浴10min，-70℃保存。
(6)以總RNA為模板，反轉錄合成cDNA。根據(jù)國際上已經發(fā)表的輪狀病毒Vp4基因的全序列設計一對引物，并在上游引物中添加KpnI酶切位點，下游引物中添加BamHI酶切位點，由TaKaRa公司合成。25ul反應體系如下Oligod(T)1.0ul，Rnase Inhibitor 1.0ul，AMV buffer 5.0ul，AMV 1.0ul，dNTP 2.0ul，RNA 3.0ul，DEPC水12.0ul.42℃水浴1h，95℃5min滅活反轉錄酶。以反轉錄產物為模板，p1，p2為引物，進行PCR擴增，25ul PCR反應體系如下ExTaq Buffer 2.5ul，p10.5ul，p2 0.5ul，dNTP 4.0ul，Mgcl22.5ul，ExTaq 1.0ul，cDNA 4.0ul，D.D.W10.0ul加入液體石蠟25.0ul.
反應條件94℃預變性8min，94℃變性90sec，56℃退火1min，72℃延伸3min30sec。35個循環(huán)，72℃終延伸10min。
RT-PCR鑒定結果采用LipofectamineTM2000將重組表達質粒pVAXI-Vp4轉染至MA-104細胞中，同時以pVAXI轉染的MA-104細胞做空白對照和正常細胞做陰性對照，轉染48h后，提取轉染細胞的總RNA，符合真核生物RNA特征；再以該RNA為模板進行RT-PCR，電泳結果可見重組表達質粒pVAX1-Vp4轉染的MA-104細胞擴增出一條大小一致的目的DNA帶，而空載體pVAX1轉染的MA-104細胞和正常MA-104細胞均未見目的帶。
4.在BLAB/c小鼠體內的表達將BLAB/c小鼠隨機分成A，B，C三組，每組30只。用滅菌生理鹽水將大量制備并經過檢測符合要求的真核重組表達質粒pVAXI-Vp4和真核表達載體pVAXI稀釋，每種質粒終濃度為1ug/ul。普魯卡因按終濃度0.5％加入到質粒中。對各組小鼠進行注射免疫，每側肌肉注射50ul。A組注射pVAX1-Vp4；B組注射pVAX1；C組注射生理鹽水。以后按同樣方法間隔二周加強免疫，共免疫三次。免疫前隨機取5只小鼠眼眶靜脈取血，收集血樣，脫臼處死取脾細胞，分別進行血清抗體和脾細胞中CD4+，CD8+T細胞相對數(shù)量檢測。免疫后于第14，28，42天各組分別隨機取5只小鼠，用同樣方法收集血樣及處理脾細胞。
抗體檢測 用ELISA法測待檢血清抗RV抗體的OD492值。用包被緩沖液將RV抗原按160ug/孔稀釋包被反應板。將待檢血清用PBS作1∶200稀釋后，每孔100ul，HRP羊抗鼠IgG用PBS稀釋至工作濃度，每孔100ul。按常規(guī)方法操作。
(1)輪狀病毒抗原的制備取200ml用MA-104細胞培養(yǎng)的輪狀病毒液，5000轉離心30min，取上清20000轉離心1h。沉淀溶于0.5ml的生理鹽水中。
(2)用分光光度計測定輪狀病毒蛋白的含量。以下列公式計算蛋白含量。OD280×1.45-OD260×0.74＝蛋白含量(mg/ml)用包被緩沖液將RV抗原按160ug/孔稀釋包被反應板。將待檢血清用PBS作1∶200稀釋后，每孔100ul，HRP羊抗鼠IgG用PBS稀釋至工作濃度，每孔100ul。按常規(guī)方法操作。
用自動酶標測定儀在波長492處測定各孔的光吸收值(OD492值)。用SAS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。
T淋巴細胞轉化實驗 無菌分離脾淋巴細胞，以MTT法測定淋巴細胞的增殖反應，以反映免疫鼠體內的細胞免疫水平。
(1)小鼠于42天脫臼處死，置75％乙醇溶液中浸泡1-2min以消毒皮膚。無菌取脾置于滅菌的紗布中，輕輕揉搓，制成脾細胞懸液。
(2)脾細胞計數(shù)，活細胞數(shù)在90％以上，調整細胞濃度為5×106個/ml。每孔加入100ul脾細胞懸液，共8孔。其中4孔加100ulConA，另4孔再加100ul脾細胞懸液做空白對照。
(3)將細胞培養(yǎng)板放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育68h。
(4)每孔加入20ul MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
(5)小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入100ulDMSO，振蕩10min，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定OD570，計算刺激指數(shù)(stimulation index，SI)，SI＝OD570實驗組/OD570對照組。用Spss 11.0分析。
CD4+CD8+T細胞檢測脾細胞樣品在采集后2h內送吉林大學第一醫(yī)院基礎部，用流式細胞儀(FACSCalibur)檢測10000個脾細胞中CD4+，CD8+T細胞的相對數(shù)量(％)。用SAS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。
抗體檢測結果重組表達質粒pVAXI-Vp4免疫后的ELISA抗體檢測結果顯示，A組鼠血清在首免后第14天即可檢出抗RV陽性抗體(P/N＞2.0)，以后在第28、42天分別檢出了抗RV陽性抗體(P/N＞2.0)，說明免疫后抗原基因在BLAB/c鼠體內得到了表達，表達的抗原基因誘導鼠產生了體液免疫應答。結果見表1.
表1 重組表達質粒pVAX1-Vp4免疫后的抗體應答


注A和B有顯著差異，B與B差異不顯著.
淋巴細胞轉化實驗結果淋巴細胞轉化試驗是檢測抗原刺激機體后產生細胞免疫常用的一個指標。無菌分離免疫小鼠脾淋巴細胞，以ConA作為抗原刺激淋巴細胞增殖。實驗結果顯示，Vp4組與pVAXI和生理鹽水對照組的淋巴細胞增殖反應存在顯著差異(p＜0.05).這一點與流式細胞術對實驗組的CD4+T細胞數(shù)量的檢測結果一樣。
表2 免疫鼠 淋巴細胞轉化結果與分析

注a，b，c，d字母不同者差異顯著，相同者不顯著。
CD4+，CD8+T細胞檢測結果首次免疫后，A組小鼠脾臟中CD4+，CD8+T細胞數(shù)量與B、C組相比均有顯著差異(P＜0.05)，并明顯高于B、C組，說明免疫后抗原基因在小鼠體內得到了表達，CD4+T細胞和CD8+T細胞被有效激活后發(fā)生了擴增。見表3和表4。
表3 重組表達質粒pVAXI-Vp4免疫后的脾細胞中CD4+T細胞的數(shù)量(％)變化

(注表中A與B有顯著差異，B、C與C無顯著差異)表4 重組表達質粒pVAXI-Vp4免疫后的脾細胞中CD8+T細胞的數(shù)量(％)變化

(注表中A與B有顯著差異，B、C與C無顯著差異)本發(fā)明將真核重組表達質粒pVAXI-Vp4免疫BALB/c鼠，檢測其血清抗體和脾臟中的淋巴細胞增殖情況及CD4+，CD8+T細胞的數(shù)量變化情況，結果表明，豬A組輪狀病毒Vp4全基因不但在哺乳動物細胞中獲得了表達，而且將真核重組表達質粒pVAXI-Vp4給動物免疫后，獲得了免疫效果。這為pVAXI-Vp4作為DNA疫苗的進一步推廣應用提供科學依據(jù)。
權利要求
1.一種豬A組輪狀病毒Vp4全基因真核表達質粒，其特征是從培養(yǎng)的RV中用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術擴增Vp4全基因，開放閱讀框含2331bp，編碼776個氨基酸，通過T-A克隆技術，將PCR產物克隆至克隆載體pGEM-T載體中，獲得重組克隆質粒pGEM-T-Vp4，將重組克隆質粒pGEM-T-Vp4及表達載體pVAX1均以KpnI和BamHI雙酶切，純化回收后，以T4DNA連接酶連接、轉化，構建真核重組表達質粒pVAX1-Vp4。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種豬A組輪狀病毒Vp4全基因真核表達質粒，其特征是從培養(yǎng)的RV中用反轉錄聚合酶鏈式反應RT-PCR技術擴增Vp4全基因，通過T-A克隆技術，將PCR產物克隆至克隆載體pGEM-T載體中，獲得重組克隆質粒pGEM-T-Vp4；經DNASTAR軟件分析核苷酸序列和氨基酸序列是1 atg gct tcg ctc att tat aga caa cta ctt act aat tca tac aca gtc1 Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val49 aat ctt tct gac gaa att caa gag att gga tca gct aag tca cag gat17 Asn Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Ala Lys Ser Gln Asp97 gtt act ata aat cct ggt cca ttc gca cga aca ggt tat gca cca gtt33 Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Arg Thr Gly Tyr Ala Pro Val145aat tgg gga gca ggt gag act aat gac tcc aca act gtc gag ccg tta49 Asn Trp Gly Ala Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu193tta gat ggt cca tac caa cca acc act ttc aat cca cca aca agc tat65 Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr241tgg gta cta ctt gcg cca act gta gag ggc gta att att caa gga aca81 Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr289aac aat acc gat aga tgg ttg gcc act ata cta att 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全文摘要
一種豬A組輪狀病毒Vp4全基因真核表達質粒，本發(fā)明屬于生物基因領域，其特征是從培養(yǎng)的RV中用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT－PCR)技術擴增Vp4全基因，開放閱讀框含2331bp，編碼776個氨基酸。通過T－A克隆技術，亞克隆至pGEM－T載體中，獲得pGEM－T－Vp4，將其及pVAX1均以KpnI和BamHI雙酶切回收后，以T4DNA連接酶連接、轉化，構建真核重組表達質粒pVAX1－Vp4。有益效果是它按一定的量通過肌肉注射到體內產生體液免疫和細胞免疫，細胞免疫是在細胞內把表達的蛋白抗原通過MHC I類分子呈遞抗原，從而激活CTL及殺滅靶細胞。這一點對輪狀病毒來講尤為重要。同時它既安全又有誘導全面免疫應答的高效性。此外，它還易于生產，穩(wěn)定性強及安全可靠。
文檔編號C07K14/14GK1952158SQ200510017198
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月19日 優(yōu)先權日2005年10月19日
發(fā)明者王春鳳, 王會巖, 李玉 申請人:吉林農業(yè)大學, 王春鳳, 王會巖, 李玉