專利名稱：表達(dá)特異性HBV shRNA的重組HBV載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及表達(dá)特異性HBV shRNA的重組HBV載體，還涉及該載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus )是引起人類急、慢性肝炎的DNA病毒，也稱丹氏顆粒，簡(jiǎn)稱HBV。HBV屬嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，基因組長(zhǎng)約3. 2kb，有四個(gè) 0RF,編碼以下蛋白Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白和S蛋白(L,M, S)。Core是核衣殼蛋白；X蛋白對(duì)病毒復(fù)制是重要的，并與肝癌的發(fā)生有關(guān)；S蛋白是病毒的包膜蛋白，與病毒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)。HBV 超螺旋共價(jià)、閉合、環(huán)狀 DNA 分子(covalently closed circularDNA, cccDNA)的持續(xù)存在是HBV慢性感染的根源，松弛環(huán)狀DNA (RC DNA)是cccDNA形成的前體，故阻斷RC DNA的合成將致cccDNA減少。研究發(fā)現(xiàn)缺失某些序列的突變型rHBV的RC DNA合成效率更高，rHBV與HBV共存于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，由于rHBV具有如下特性①合成效率高，rHBV將在數(shù)量上占優(yōu)；@rHBV自身不能合成復(fù)制所必需的Core、Pol蛋白，需利用野生HBV的Core、Pol蛋白進(jìn)行復(fù)制，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制野生HBV的復(fù)制，但不能完全抑制。因此尋找一種能夠完全抑制野生HBV的方法是解決HBV持續(xù)慢性感染的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供表達(dá)特異性HBV shRNA的重組HBV載體，能夠依賴野生型HBV進(jìn)行復(fù)制，并且形成RC DNA,為慢性HBV感染的治療提供了新的工具。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為
表達(dá)特異性HBV shRNA的重組HBV載體，所述乙型肝炎病毒shRNA表達(dá)載體由LJ196載體刪除2111-2643位、187-680位或1060-1500位堿基后，在刪除序列處替換識(shí)別所述刪除序列的shRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元而得。優(yōu)選的,所述shRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元由啟動(dòng)子和shRNA編碼序列組成。優(yōu)選的,所述啟動(dòng)子為Hl啟動(dòng)子。更優(yōu)選的，所述shRNA 編碼序列如 SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 22 或 SEQ ID NO. 25 所示。本發(fā)明的目的之二在于提供表達(dá)特異性HBV shRNA的重組HBV載體的制備方法，其制備方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，技術(shù)方案為
所述重組HBV載體的制備方法，根據(jù)LJ196載體序列設(shè)計(jì)引物，然后以LJ196載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得刪除LJ196載體2111-2643位、187-680位和1060-1500位堿基的序列，同時(shí)克隆Hl啟動(dòng)子并分別與所得序列連接，環(huán)化后在Hl啟動(dòng)子3’端連入識(shí)別所述刪除序列的shRNA的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元，得重組HBV載體。優(yōu)選的，所述引物為SEQ ID NO. 2-7所示的核酸序列。更優(yōu)選的，所述克隆Hl啟動(dòng)子的具體方法為以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示核酸序列為引物，以PLVTHM質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得Hl啟動(dòng)子。本發(fā)明的目的之三在于提供乙型肝炎病毒shRNA表達(dá)載體的應(yīng)用，技術(shù)方案為 所述重組HBV載體在制備干擾乙型肝炎病毒基因組DNA復(fù)制的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明有益效果在于本發(fā)明公開的重組HBV載體，刪除病毒蛋白表達(dá)元件，并保留RC DNA合成必須順式元件，并在刪除序列處替代shRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元(由Hl啟動(dòng)子和shRNA序列組成，不足300bp)，用以表達(dá)靶向被刪除序列的shRNA，使其特異性降解野生型 HBV pgRNA,阻斷RC DNA合成及cccDNA的形成；該重組HBV載體依賴野生型HBV復(fù)制并且不會(huì)整合入宿主基因組中，因此重組HBV載體只能在感染HBV病毒的細(xì)胞中存活，在正常細(xì)胞中會(huì)很快消失，不會(huì)影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，也不會(huì)引起轉(zhuǎn)基因細(xì)胞發(fā)生突變。重組HBV載體因刪除了靶序列而不受RNAi的影響，并能在野生型HBV表達(dá)的Core、Pol蛋白輔助下轉(zhuǎn)化為cccDNA，后者持續(xù)表達(dá)siRNA達(dá)到持久抗HBV復(fù)制效應(yīng)①在半衰期方面，野生型HBV cccDNA和rHBV cccDNA相同，同時(shí)在肝細(xì)胞內(nèi)可能存在降解cccDNA的未知機(jī)制；②在復(fù)制效率方面，rHBV高于野生型HBV ;③受RNAi抑制作用方面，野生型HBV在pgRNA水平受到大量降解，RC DNA合成受阻，而rHBV的pgRNA不受RNAi影響，可以合成RC DNA進(jìn)而形成cccDNA ;在這些效應(yīng)下，隨著肝細(xì)胞的分裂，最終野生型HBVcccDNA先于rHBV cccDNA被耗竭，達(dá)到治療乙型肝炎病毒感染的目的。


圖1 rHBV載體與LJ96輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染IfepG2細(xì)胞后Southern blot結(jié)果。圖2為rHBV-Hl載體與LJ96輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞后Southern blot結(jié)果圖。圖3為shRNA541雙鏈結(jié)構(gòu)圖。圖4為shRNA456雙鏈結(jié)構(gòu)圖。圖5為shRNA1436雙鏈結(jié)構(gòu)圖。圖6為shRNA1302雙鏈結(jié)構(gòu)圖。圖7為shRNA1573雙鏈結(jié)構(gòu)圖。圖8為rHBV-shRNA表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。本發(fā)明中使用的LJ196和LJ96質(zhì)粒由Daniel D. Loeb教授惠贈(zèng)，并在公開的文獻(xiàn)中有記載(Liu N, Ji L, Maguire ML, Loeb DD. cis-Acting sequences that contributeto the synthesis of relaxed-circular DNA of human hepatitis B virus. J Virol.Jan 2004 ；78(2) :642-649.)。一、缺失突變r(jià)HBV構(gòu)建過程
在不表達(dá)任何病毒蛋白的質(zhì)粒LJ196 (SEQ ID NO.1)的基礎(chǔ)上，利用反向PCR技術(shù)刪除LJ196質(zhì)粒的DNA片段，使刪除后RC DNA合成效率更高。分別刪除LJ196的第2111至2643位核苷酸(簡(jiǎn)記為rHBVl)、刪除LJ196的第187至680位核苷酸(簡(jiǎn)記為rHBV2)、刪除LJ196的第1060至1500位核苷酸(簡(jiǎn)記為rHBV3)、刪除LJ196的第2111至2643位核苷酸和1060至1500位核苷酸(簡(jiǎn)記為rHBVl. 3)、刪除LJ196的第2111至2643位核苷酸和187至1500位核苷酸(簡(jiǎn)記為rHBVl. 23)。rHBV1-3載體的構(gòu)建方法
設(shè)計(jì)合成以下引物
HBV187-163 :5’-aggggtcctagggatccttatgtga-3’ (SEQ ID NO. 2)；
HBV1060-1036 :5’-caaaggcatcaacgcaggataacca-3’ (SEQ ID NO. 3)
HBV2111-2087 :5’-agtcattagttccccccagcaaaga-3’ (SEQ ID NO. 4)
HBV680-704 :5’-agtgccatttgttcagtggttcgta-3’ (SEQ ID NO. 5)
HBV1500-1518 :5’-tgccgttccgaccgaccac-3’ (SEQ ID NO. 6)
HBV2643-2667 :5’-attatgcctgccaggttttatccaa-3’ (SEQ ID NO. 7)
按表I引物配對(duì)，以LJ196質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性2分鐘；然后96°C變性15秒，55°C退火30秒，68 °C延伸6分鐘40秒，共21個(gè)循環(huán)。表1.反向PCR擴(kuò)增引物對(duì)
權(quán)利要求
1.表達(dá)特異性HBVShRNA的重組HBV載體，其特征在于所述表達(dá)特異性HBV shRNA的重組HBV載體由LJ196載體刪除2111-2643位、187-680位或1060-1500位堿基后，在刪除序列處替換識(shí)別所述刪除序列的shRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元而得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述表達(dá)特異性HBVshRNA的重組HBV載體，其特征在于所述 shRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元由啟動(dòng)子和shRNA編碼序列組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述表達(dá)特異性HBVshRNA的重組HBV載體，其特征在于所述啟動(dòng)子為Hl啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述表達(dá)特異性HBVshRNA的重組HBV載體，其特征在于 所述 shRNA 編碼序列如 SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 22 或 SEQ ID NO. 25 所示。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述重組HBV載體的制備方法，其特征在于根據(jù)LJ196載體序列設(shè)計(jì)引物，然后以LJ196載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得刪除LJ196載體2111-2643位、 187-680位和1060-1500位堿基的序列，同時(shí)克隆Hl啟動(dòng)子并分別與所得序列連接，環(huán)化后在Hl啟動(dòng)子3’端連入識(shí)別所述刪除序列的shRNA的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元，得重組HBV載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述引物為SEQID NO. 2-7所示的核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于所述克隆Hl啟動(dòng)子的方法為， 以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列為引物，以pLVTHM質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得Hl啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述重組HBV載體在制備干擾乙型肝炎病毒基因組DNA復(fù)制的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)特異性HBVshRNA的重組HBV載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，重組HBV載體由LJ196載體刪除2111-2643位、187-680位或1060-1500位堿基后，在刪除序列處替換識(shí)別所述刪除序列的shRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元而得，制備方法簡(jiǎn)單，該重組HBV載體能夠利用野生型乙型肝炎病毒基因組的Core蛋白和Pol蛋白高效合成RCDNA，并且合成效率高于野生型乙型肝炎病毒基因組DNA，競(jìng)爭(zhēng)野生型乙型肝炎病毒的復(fù)制，同時(shí)利用重組HBV載體合成效率高的特性，高效表達(dá)shRNA，然后干擾乙型肝炎病毒DNA復(fù)制和HBsAg合成，能夠用于制備干擾乙型肝炎病毒基因組DNA復(fù)制的藥物，為慢性乙型肝炎病毒感染的治療提供了新的思路。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103014045SQ201210584159
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者李俊剛, 毛青, 王宇明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)