專利名稱：靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種多肽-基因復(fù)合物，還涉及該復(fù)合物的制備方法和在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫防疫的第一道防線，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。當(dāng)有外來病原體入侵或有細(xì)胞死亡，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)迅速被激活并將其清除，同時(shí)釋放炎癥因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。但有研究表明，過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可能加速某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)程，而其釋放的細(xì)胞毒性因子也會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成進(jìn)一步的損傷。因此，適當(dāng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性可能是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效途徑。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類約21-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，普遍存在于真核生物中，不編碼蛋白質(zhì)或多肽，而是與靶基因的信使RNA (mRNA) 3’非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用。近年來，miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病關(guān)系越來越受重視。miRNA已被證實(shí)參與了神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育與分化、細(xì)胞活化及應(yīng)答調(diào)控等過程，并且與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，在缺血缺氧引發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞特定miRNA會(huì)發(fā)生表達(dá)改變，調(diào)控宿主細(xì)胞的基因表達(dá)，應(yīng)對(duì)微環(huán)境做出相應(yīng)的反應(yīng)，從而參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。因此，miRNA在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中 樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療領(lǐng)域可能具有極為廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種miR-21復(fù)合物，該復(fù)合物可以特異靶向小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生或惡化。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案1.靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物，由K9肽和S9肽的融合肽與miR-21通過靜電作用結(jié)合而成，所述K9肽的氨基酸序列為KKKKKKKKK (Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys),所述 S9 妝的氨基酸序列為 VVMKFLTQQ (Val-Val-Met-Lys-Phe-Leu-Thr-Gln-Gln) 進(jìn)一步，所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接連接。2.靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物的制備方法，是在渦旋條件下，向含有miR-21和氯化鈉的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴畢，繼續(xù)渦旋2(Γ60分鐘，再靜置2(Γ60分鐘，即得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物。進(jìn)一步，所述miR-21與K9肽和S9肽的融合肽的質(zhì)量比為2. 5:1。進(jìn)一步，所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物的制備方法是在渦旋條件下，向含有濃度為500 μ g/mL的miR-21和濃度為lmg/mL的氯化鈉的水溶液中，滴加等體積濃度為200 μ g/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴加完畢后，繼續(xù)渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物。3.靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物在制備治療由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于K9肽為帶正電荷的短肽，可通過電性中和作用與帶負(fù)電荷的miRNA聚合形成致密顆粒，提高細(xì)胞對(duì)miRNA的攝取率，增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率。CX3CR1受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要在小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，來源于US28受體N末端的誘惑配體多肽S9可以阻斷人源CX3CR1受體結(jié)合生理性趨化因子形成的趨化作用，但其本身不引起趨化運(yùn)動(dòng)，不影響胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞自然活性。本發(fā)明所述miR-21復(fù)合物可通過S9肽的導(dǎo)向作用，特異靶向小膠質(zhì)細(xì)胞表面特異性CX3CR1受體，在S9肽與CX3CR1受體作用的同吋，miR-21高效轉(zhuǎn)染入小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生或惡化，可用于制備治療由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1為透射電鏡鑒定miR-21復(fù)合物。圖2為miR-21復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞活化后細(xì)胞因子的分泌水平。圖3為miR-21復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的殺傷水平。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

一、靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物的制備1、K9肽和S9肽的融合肽K9-S9的制備
融合肽K9-S9由K9肽的羧基端與S9肽的氨基端直接連接而成，氨基酸序列為KKKKKK-KKKVVMKFLTQQ (SEQ ID No.1)。融合肽K9-S9的合成在AB-431A型多肽合成儀上進(jìn)行，采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案。以
0.25mmol對(duì)羥甲基苯氧甲基聚苯こ烯(HMP)樹脂為起始樹脂，按照融合肽K9-S9的氨基酸序列，使肽鏈自羧基端向氨基端逐個(gè)延伸，肽鏈合成完畢后，將含有肽鏈的樹脂轉(zhuǎn)移至切割液(由酒石酸こニ胺0. 25mL、三氟こ酸9. 5mL和去離子水0. 25mL組成)中，室溫下攪拌反應(yīng)使肽鏈從樹脂上裂解下來，然后用G6玻砂漏斗過濾，收集濾液，室溫下低壓蒸干，殘余物用去離子水溶解后，用Akta explorer 100型中壓液相色譜儀進(jìn)行純化，色譜柱為C18柱，流動(dòng)相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%的三氟こ酸水溶液，流動(dòng)相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%的三氟こ酸こ腈溶液，ニ元線性梯度洗脫，流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)在(T15分鐘內(nèi)由10%上升至50%，流速為lmL/min,收集融合肽K9-S9的洗脫液，冷凍干燥，即得融合肽K9-S9，用去離子水溶解制成濃度為3mg/mL的溶液，用孔徑為0. 20 y m的微孔濾膜過濾除菌，_70°C凍存?zhèn)溆谩Ｈ∪诤想腒9-S9的洗脫液，用Delta 600型反相高壓液相色譜儀進(jìn)行純度鑒定，色譜柱為Symmetry C18柱，流動(dòng)相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%的三氟こ酸水溶液，流動(dòng)相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%的三氟こ酸こ腈溶液，ニ元線性梯度洗脫，流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)在(T15分鐘內(nèi)由10%上升至60%，流速為lmL/min。結(jié)果經(jīng)峰面積歸ー化法計(jì)算，融合肽K9-S9的純度為98%。另取融合肽K9-S9的洗脫液，用API 2000 LC/MS/MS型質(zhì)譜儀進(jìn)行分子量鑒定，結(jié)果顯示，融合肽K9-S9的分子量實(shí)測(cè)值與理論值相符。2、miR-21復(fù)合物的制備
miR-21 的核苷酸序列為5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ (SEQ ID No. 2)。于室溫、渦旋條件下，向100 ii L含有濃度為500 u g/mL的miR-21和濃度為lmg/mL的NaCl的水溶液中，滴加100 u L濃度為200 u g/mL的融合肽K9-S9溶液，滴加速度為5 u L/min,滴加完畢后，于室溫下繼續(xù)渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得miR-21復(fù)合物。將新鮮制備的miR-21復(fù)合物滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3分鐘，用吸水紙吸干，晾干30秒，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸鈾水溶液負(fù)染30秒,用吸水紙吸干，晾干30秒,80kV透射電鏡觀察。結(jié)果如圖1所示，所得miR-21復(fù)合物呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒長徑小于25nm。同時(shí)，按照上述相同方法，以無關(guān)序列5’ -CUUAUAGUGACUUGAUGUCAGA-3’ (SEQ IDNo. 3)替代miR-21，制得陰性對(duì)照復(fù)合物。ニ、靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物的活性測(cè)試1、miR-21復(fù)合物轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞
將小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2于6 孔板內(nèi)單層培養(yǎng)至覆蓋面積約30%，換入無血清DMEM培養(yǎng)基2mL，并加入miR-21復(fù)合物100 u L，培養(yǎng)4小時(shí)，再換入完全DMEM培養(yǎng)基2mL，培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，用PBS洗滌并重懸，獲得miR-21復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)，按照上述相同方法，采用陰性對(duì)照復(fù)合物，獲得陰性對(duì)照復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞。另外，分別將miR-21復(fù)合物和陰性對(duì)照復(fù)合物轉(zhuǎn)染少突膠質(zhì)細(xì)胞HO，作為無關(guān)細(xì)胞對(duì)照。2、ELISA檢測(cè)miR-21復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞活化后細(xì)胞因子的分泌水平 設(shè)置空白組(正常小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2)、對(duì)照組(陰性對(duì)照復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞)和實(shí)
驗(yàn)組(miR-21復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞)。取各組細(xì)胞，以4X IO5/孔種植于24孔板中，向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入脂多糖(LPS)至終濃度為IOii g/mL，刺激0. 5小時(shí)，之后棄去含LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液并洗滌細(xì)胞2次，再加入DMEM培養(yǎng)基lmL，繼續(xù)培養(yǎng)24小吋，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，用ELISA試劑盒測(cè)定白細(xì)胞介素-13 (IL-1 @ )和腫瘤壞死因子a (TNF_a)的含量。結(jié)果如圖2所示，miR-21復(fù)合物可以明顯降低活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1 ^和TNF-a的水平。3、檢測(cè)miR-21復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的殺傷水平
將少突膠質(zhì)細(xì)胞HO用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，收集細(xì)胞，離心洗滌2次，再用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為I X 106/mL,取ImL細(xì)胞懸液置IOmL血清瓶中，加入100 u Ci的Na51CrO4,37°C孵育90分鐘，充分洗滌細(xì)胞除去未結(jié)合的51Cr,再用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為I X 105/mL,作為靶細(xì)胞。在96孔U型板中，設(shè)置空白組(以正常小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2作為效應(yīng)細(xì)胞)、對(duì)照組(以陰性對(duì)照復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞)、實(shí)驗(yàn)組(以miR-21復(fù)合物轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞)、最大釋放組(用濃度為2mol/L的鹽酸替代效應(yīng)細(xì)胞)和最小釋放組(用含有質(zhì)量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細(xì)胞)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各孔按效靶比(E/T)為1:1加入效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞，500r/min離心30秒后，37°C孵育4小時(shí)，再1000r/min離心10分鐘，各孔取上清IOOy L，用Y計(jì)數(shù)器測(cè)定每分鐘放射活性(cpm值)，再按下述公式計(jì)算殺傷率殺傷率(%)=[(相應(yīng)組cpm均值-最小釋放組cpm均值)/ (最大釋放組cpm均值-最小釋放組cpm均值)]X 100%,殺傷率大于15%判為特異性殺傷。結(jié)果如圖3所示，miR-21復(fù)合物可以明顯降低活化的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的殺傷水平。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì) 其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的rniR-21復(fù)合物，其特征在于，由K9肽和S9肽的融合肽與miR-21通過靜電作用結(jié)合而成，所述K9肽的氨基酸序列為KKKKKKKKK，所述S9肽的氨基酸序列為VVMKFLTQQo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物，其特征在于，所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接連接而成。
3.權(quán)利要求1或2所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物的制備方法，其特征在于，在渦旋條件下，向含有miR-21和氯化鈉的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴畢，繼續(xù)渦旋2(Γ60分鐘，再靜置2(Γ60分鐘，即得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述miR-21與K9肽和S9肽的融合肽的質(zhì)量比為2. 5:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物的制備方法，其特征在于，在渦旋條件下，向含有濃度為500 μ g/mL的miR-21和濃度為lmg/mL的氯化鈉的水溶液中，滴加等體積濃度為200 μ g/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴加完畢后，繼續(xù)渦旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物。
6.權(quán)利要求1或2所述的靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物在制備治療由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的miR-21復(fù)合物，由K9肽(KKKKKKKKK)和S9肽(VVMKFLTQQ)的融合肽與miR-21通過靜電作用結(jié)合而成，該復(fù)合物可利用S9肽的導(dǎo)向作用，特異靶向小膠質(zhì)細(xì)胞表面特異性CX3CR1受體，在S9肽與CX3CR1受體作用的同時(shí)，miR-21高效轉(zhuǎn)染入小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生或惡化，可用于制備治療由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103028121SQ20121058415
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者楊曌, 楊清武 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院