本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是植物中間表達載體及其構建方法與應用。

背景技術：

目前，在構建植物表達載體時，為了構建完整的表達盒和選擇合適的酶切位點，需要將目的片段在多個中間表達載體之間進行多步構建。

而把表達盒和多克隆位點構建在一個載體上，作為通用載體適應于多條目的片段，并自帶表達盒，大大節(jié)省了工作人員構建載體的時間，降低了復雜的多步構建中產(chǎn)生的費用，同時也減少了構建過程中出現(xiàn)錯誤的幾率，是現(xiàn)階段技術人員致力研究的技術內容。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供植物中間表達載體。

本發(fā)明所要解決的另一技術問題在于提供所述植物中間表達載體的構建方法。

本發(fā)明所要解決的另一技術問題在于提供所述植物中間表達載體的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是：

植物中間表達載體，pEXP-DR，具有序列表中<400>1所示的序列。

上述植物中間表達載體的構建方法，通過PCR擴增和酶切技術在質粒PSK中連接了外源片段DR、啟動子、終止子序列，所述外源片段DR序列為序列表中<400>13所示的序列，啟動子序列為序列表中<400>2所示的序列，所述終止子序列為序列表中<400>3所示的序列。

上述植物中間表達載體在植物基因工程載體構建方面的應用。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明所述植物中間表達載體pEXP-DR把表達盒和多克隆位點構建在一個載體上，作為通用載體適應于多條目的片段，并自帶表達盒，使植物中間表達載體不僅具有完整的表達盒，而且在各序列的上下游，添加了多克隆位點，便于外源基因片段的導入和該表達盒與各種植物表達載體的連接，大大節(jié)省了工作人員構建載體的時間，降低了復雜的多步構建中產(chǎn)生的費用，同時也減少了構建過程中出現(xiàn)錯誤的幾率，使植物基因工程載體構建更加便利和高效。

附圖說明

圖1為載體PEXP構建流程圖；

圖2為pT-PA的PCR和酶切鑒定圖，其中，泳道M：DNA分子量標準Trans2K plus；泳道1：pT-PA的PCR鑒定；泳道2：pT-PA的酶切鑒定；PA所標示的箭頭指向酶切后0.3kb的PA片段；

圖3為pT-TP的PCR和酶切鑒定圖，其中，泳道M：DNA分子量標準DGL2000；泳道1：pT-TP的PCR鑒定；泳道2：pT-TP的酶切鑒定；TP所標示的箭頭指向酶切后0.2kb的TP片段；

圖4為pT-35S的PCR和酶切鑒定圖，其中，泳道M：DNA分子量標準DGL2000；泳道1：pT-35S的PCR鑒定；泳道2：pT-35S的酶切鑒定；35S所標示的箭頭指向酶切后0.8kb的35S片段；

圖5為pSK-PA的PCR和酶切鑒定圖，其中，泳道M1、M2：DNA分子量標準DGL2000、Trans2K plus；泳道1：pSK-PA的PCR鑒定；泳道2：pSK-PA的酶切鑒定；PA所標示的箭頭指向酶切后0.3kb的PA片段；

圖6為pSK-TP-PA的PCR和酶切鑒定圖，其中，泳道M：DNA分子量標準DGL2000；泳道1：pSK-TP-PA的PCR鑒定；泳道2：pSK-TP-PA的酶切鑒定；TP-PA所標示的箭頭指向酶切后0.5kb的TP-PA片段；

圖7為pEXP的PCR和酶切鑒定，其中，泳道M：DNA分子量標準DGL2000；泳道1：pEXP的PCR鑒定；泳道2：pEXP的酶切鑒定；35S-TP-PA所標示的箭頭指向酶切后1.3kb的整個表達盒35S-TP-PA片段；

圖8為中間載體PEXP-DR構建流程圖；

圖9為測序對比圖；

圖10為pEXP-DR的質粒及酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道M:DNA分子量標準Trans15K；泳道1：pEXP-DR的質粒；泳道2：用NdeI和BglП雙酶切pEXP-DR的質粒。

圖11為載體1301-PEXP-SmGPPS的構建流程。

圖12為克隆SmGPPS基因的瓊脂糖有凝膠電泳圖，其中泳道M:DNA分子量標準Trans2K PlusП；泳道1：負對照；泳道2：克隆得到的SmGPPS基因。

圖13為pEXP-DR-SmGPPS的質粒及酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道M:DNA分子量標準DL15000；泳道1：pEXP-DR-SmGPPS的質粒；泳道2：用KpnI和XbaI雙酶切pEXP-DR-SmGPPS的質粒。

圖14為載體1301-PEXP-SmIS1的構建流程。

圖15為克隆SmIS1基因的瓊脂糖有凝膠電泳圖，其中泳道M:DNA分子量標準Trans2K；泳道1：負對照；泳道2：克隆得到的SmIS1基因。

圖16為pEXP-DR-SmIS1的質粒及酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道M:DNA分子量標準DL15000；泳道1：pEXP-DR-SmIS1的質粒；泳道2：用KpnI和XbaI雙酶切pEXP-DR-SmIS1的質粒。

具體實施方式

實施例1

構建載體PEXP，具體流程見圖1。根據(jù)所述構建流程如下：

首先要獲得含有所需各個組件的T載體。

以質粒pCAMBIA1301為模板，PA1、PA2為引物，通過PCR擴增片段PA(PolyA，終止子)后將其與T載體連接，獲得pT-PA，PCR和酶切鑒定(見圖2)證明pT-PA構建正確，送至公司測序證明其序列也沒有錯誤且酶切位點與設計相符。

以實驗室保存的、含有豌豆Rubisco小亞基上葉綠體定位信號肽編碼序列的質粒為模板，TP5、TP6為引物，通過PCR擴增片段TP后將其與T載體連接，獲得了pT-TP，pT-TP的PCR和酶切鑒定正確(見圖3)。送至公司測序證明其序列沒有錯誤且酶切位點與設計相符。

以質粒pCAMBIA1301為模板，35S1、35S2為引物，通過PCR擴增片段35S后將其與T載體連接，獲得pT-35S，轉化子的PCR和酶切鑒定見圖4。送至公司測序證明其序列沒有錯誤且酶切位點與設計相符。

同時用限制性內切酶Kpn I和Sac I雙酶切質粒pSK和pT-PA，將pSK雙酶切后的大片段(約2.9kb)與pT-PA雙酶切后的小片段(約0.3kb)進行回收、純化、連接后轉化大腸桿菌，獲得轉化子pSK-PA，通過PCR和酶切反應鑒定其正確性(見圖5)。

然后同時用限制性內切酶Kpn I和ApaI雙酶切pSK-PA和pT-TP，將pSK-PA雙酶切后的大片段(約3.2kb)和pT-TP雙酶切后的小片段(約0.2kb)進行回收、純化、連接后轉化大腸桿菌，獲得轉化子pSK-TP-PA，然后通過PCR和酶切反應證明其構建的正確性(見圖6)。

最后同時用限制性內切酶Kpn I和Bgl II雙酶切pSK-TP-PA和pT-35S，將pSK-TP-PA雙酶切后的大片段(約3.4kb)與pT-35S雙酶切后的小片段(約0.8kb)進行回收、純化、連接后轉化大腸桿菌，獲得轉化子pEXP，然后通過PCR(擴增0.8kb的35S組件)和酶切反應(切下1.3kb的整個表達盒35S-TP-PA)。證明其構建無誤(見圖7)，最后還通過測序證明三個組件連接處也都符合設計。

實施例2

根據(jù)PEXP載體進行改造后，構建中間載體PEXP-DR，具體流程見圖8。根據(jù)所述構建流程：

(1)從SmIS1基因中用引物DR1和DR2克隆一段688bp的片段，該片段中沒有本發(fā)明所要利用的酶切位點，在片段的上游嫁接酶切位點Bgl II，BamHI和SmaI，下游嫁接酶切位點NdeI，將其連接在pMD19-T1-Simple的載體上。

(2)利用PEXP原有的酶切位點，替換其中的TP序列,TP即導肽,序列為序列表中<400>4所示序列。利用BglII和NdeI這兩個酶切位點對PEXP和T-DR進行雙酶切。

(3)連接PEXP的大片段和T-DR的小片段，即得到pEXP-DR的載體。

利用已知的SmIS1的部分序列(即DR)進行替換構建，測序結果為序列表中<400>1所示的序列，分析如下：

DR模板上游加酶切位點GGAAGATCT為BglII，GGATCC為BamHI,CCCGGG為SmaI，GGAATTCCATATG為NdeI。測序比對結果見圖9，由比對結果可知，在76bp左右有一個錯配，沒有Gap。由于該段基因并沒有任何意義，故而有錯配沒有問題，只要檢查該錯配處是否會產(chǎn)生本發(fā)明要用到的酶切位點即可。故而主要通過軟件檢查，該段基因有沒有多余的BglII，BamHI,SmaI，NdeI這幾個酶切位點。根據(jù)下表1可知，在該段基因內部這幾個酶切位點都是僅有一個，是在克隆這段基因的時候利用引物給加上去的而不是由于基因內部的那個錯配而引起的,故而該錯配并沒有什么影響，可以用其進行后續(xù)的實驗。

表1

繼續(xù)對所構建的中間載體PEXP-DR進行雙酶切鑒定，結果見圖10，表明載體構建無誤。

對于PEXP-DR這個表達載體的具體應用例如下：

實施例3

將SmGPPS這個基因構建在上述表達載體上,構建流程見圖11。

用引物SG1、SG2通過PCR擴增目的基因SmGPPS,結果見圖12。由于該目的基因內部沒有BglII和NdeI這兩個酶切位點，故而可用BglII和NdeI對目的基因的PCR產(chǎn)物和PEXP-DR載體進行雙酶切。后將二者純化后用T4連接酶進行連接之后即完成了該基因的植物過表達載體的構建，結果見圖13。

實施例4

對于PEXP-DR這個表達載體的具體應用例如下：

將SmIS1這個基因構建在上述表達載體上,構建流程見圖14。

用引物S1、S2通過PCR擴增目的基因SmIS1,結果見圖15。由于該目的基因內部沒有BglII和PstI這兩個酶切位點，故而可用BglII和PstI對目的基因的PCR產(chǎn)物和PEXP-DR載體進行雙酶切。后將二者純化后用T4連接酶進行連接之后即完成了該基因的植物過表達載體的構建，結果見圖16。

上述實施例1-4中具體涉及到的一些擴增、純化等的具體操作過程如下：

具體操作：

a、通過PCR得到目的片段

50μl PCR體系：

PCR程序：30個循環(huán)

對PCR產(chǎn)物進行純化的過程：

對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，同時進行切膠回收。

稱取0.3g瓊脂糖，用30mlTAE電泳緩沖液加熱融化，待其冷卻至不燙手后加入2μl EB，混勻后倒入模具中，待冷卻凝固后放置電泳槽中，倒入緩沖液，點樣。

切膠回收：

●稱取兩個滅過菌的EP管，標記清楚重量(0.88g、0.88g)。

●將單一的目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入事先稱量好的EP管中,并再次稱重(0.96g、0.92g)。

●瓊脂糖凝膠濃度為1％，因此向裝有膠塊的EP管中加入三倍體積的Buffer A，(如凝膠重為100mg，其體積可視為100μl，依次類推)。

●將EP管放在漂上，放在事先預熱好的水浴鍋中，50℃孵育10min，期間每隔2-3min溫和地上下顛倒EP管，以確保膠塊充分溶解。

●加入1.5倍體積的BufferB。

●加入凝膠的一倍體積的異丙醇，將液體吹打混勻后，轉移至Spin column(每管每次最多750微升液體，可以分步轉移)。

●12000g離心1分鐘，棄去離心柱內液體。

●加Washing BufferA 500μl，12000g離心30秒，棄去離心柱內液體。

●加Washing BufferB 700μl，12000g離心30秒，棄去離心柱內液體。

●離心12000g，1分鐘。迅速將Spin column管轉移至離心管內。

●向Spin column管的濾膜中央加入60℃預熱的Elution Buffer 10微升。60℃溫浴3分鐘。

●12000g離心1分鐘，將離心管底部DNA溶液吸置濾膜中，重復一次，收集離心管底部的DNA溶液備用。

b、將純化后的目的片段與載體連接轉化并篩選陽性轉化子

目的片段與PEASY-T1-SimpLe的連接

在超凈工作臺中將上述收集的DNA和PEASY-T1-SimpLe置于PCR管中，在25℃的水浴鍋中進行30分鐘的連接。

DNA 4μl

PEASY-T1simpLe 1μl

轉化

●在超凈工作臺中，將連接產(chǎn)物5ul加入Trans5α感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘。

●水浴鍋中42℃熱激90秒。

●立刻取出，放入冰盒中，冰浴2分鐘。

●工作臺中，向其中加入800μl LB液體培養(yǎng)基。

●轉移至37℃恒溫搖床，先慢搖30分鐘，后快搖30分鐘。

●4000rmp離心2分鐘。

●在超凈工作臺內去掉600μl的液體，留下200μl的液體，將沉淀的菌體懸浮，吸打混勻。

●將剩下的液體吸置帶有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基的平板上,用涂布棒輕輕涂勻至干。

●將平板封好，放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)(12-16小時)。

篩選陽性轉化子

將長出轉化子的平板做好標記，進行印跡、菌落PCR、質粒PCR和酶切鑒定。

印跡：將長出的轉化子用接種環(huán)挑取單菌落，在含有卡那霉素抗性的固體LB培養(yǎng)板上進行印跡。放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16小時。

菌落PCR 20μl PCR體系

PCR程序：30個循環(huán)

對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

在培養(yǎng)好的印跡菌板上，用接種環(huán)挑取單菌落，放入含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在37℃恒溫搖床中進行擴大培養(yǎng)，同時進行菌種的保存。

菌種的保存

·首先，將菌液的濃度培養(yǎng)到OD值為0.5-0.6時，在無菌操作的條件下向EP管中先加入事先滅好菌的87％的甘油100μL(純甘油太稠)，再加入900μL菌液，上下顛倒混勻。

·將EP管放入液氮中進行速凍，然后迅速將其放入冰箱-70℃中能夠保存2年或3年。

快速提取質粒法(提取質粒的試劑盒)：

●準備工作：檢查Buffer P1中是否已經(jīng)加入RNaseA。檢查Wash Solution中是否已經(jīng)加入乙醇。檢查Buffer P2和P3中是否有沉淀。

●取1.5-5ml培養(yǎng)好的菌液，8000g離心2分鐘收集菌體，棄盡培養(yǎng)基。

●在沉淀中加入250μl Buffer P1,使菌體徹底懸浮。

●加入250μl Buffer P2，馬上溫和顛倒離心管5-10次混勻，室溫靜置2-4分鐘。

●加入350μl Buffer P3,立刻溫和顛倒離心管5-10次使其完全混勻。

●12000g離心5-10分鐘，將上清液移入吸附柱中，8000g離心30秒，倒掉收集管中的液體。

●空吸附柱于9000g離心1分鐘。

●將吸附柱放到一個干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入50μl Elution Buffer，室溫靜置1分鐘后，離心2分鐘，保存管中DNA溶液備用。

將上述提取好的質粒進行瓊脂糖凝膠電泳。確定提取質粒的量。

進行質粒PCR:20μl質粒PCR體系

PCR程序：30個循環(huán)

對該PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

將質粒進行雙酶切，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱4小時，后對酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

20μl雙酶切體系：

通過一系列的鑒定，將提取的質粒10μl送去華大基因公司進行測序。

c、目的片段與目的載體的連接與轉化及陽性克隆子的篩選

將上述經(jīng)過測序鑒定正確的質粒和目的載體的質粒根據(jù)實驗中所設計的酶切位點進行雙酶切。

20μl雙酶切體系：

對雙酶切的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，同時進行切膠回收。

稱取0.3g瓊脂糖，用30mlTAE電泳緩沖液加熱融化，待其冷卻至不燙手后加入2μl EB，混勻后倒入模具中，待冷卻凝固后放置電泳槽中，倒入緩沖液，點樣。

切膠回收：

●稱取兩個滅過菌的EP管，標記清楚重量(0.88g、0.88g)。

●將單一的目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入事先稱量好的EP管中,并再次稱重(0.96g、0.92g)。

●瓊脂糖凝膠濃度為1％，因此向裝有膠塊的EP管中加入三倍體積的Buffer A，(如凝膠重為100mg，其體積可視為100μl，依次類推)。

●將EP管放在漂上，放在事先預熱好的水浴鍋中，50℃孵育10min，期間每隔2-3min溫和地上下顛倒EP管，以確保膠塊充分溶解。

●加入1.5倍體積的BufferB。

●(該步驟為選做步驟)加入凝膠的一倍體積的異丙醇，將液體吹打混勻后，轉移至Spin column(每管每次最多750微升液體，可以分步轉移)。

●12000g離心1分鐘，棄去離心柱內液體。

●加Washing BufferA 500μl，12000g離心30秒，棄去離心柱內液體。

●加Washing BufferB 700μl，12000g離心30秒，棄去離心柱內液體。

●離心12000g，1分鐘。迅速將Spin column管轉移至離心管內。

●向Spin column管的濾膜中央加入60℃預熱的Elution Buffer 10微升。60℃溫浴3分鐘。

●12000g離心1分鐘，將離心管底部DNA溶液吸置濾膜中，重復一次，收集離心管底部的DNA溶液備用。

目的片段與目的載體的連接：

目的片段與目的載體的連接

在超凈工作臺中將上述收集的目的片段和目的載體置于PCR管中，在25℃的水浴鍋中進行15分鐘的連接。

目的片段 6μl

目的載體 3μl

T4連接酶 1ul

轉化

●在超凈工作臺中，將連接產(chǎn)物10ul加入Trans5α感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘。

●水浴鍋中42℃熱激90秒。

●立刻取出，放入冰盒中，冰浴2分鐘。

●工作臺中，向其中加入800μl LB液體培養(yǎng)基。

●轉移至37℃恒溫搖床，先慢搖30分鐘，后快搖30分鐘。

●4000rmp離心2分鐘。

●在超凈工作臺內去掉600μl的液體，留下200μl的液體，將沉淀的菌體懸浮，吸打混勻。

●將剩下的液體吸置帶有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基的平板上,用涂布棒輕輕涂勻至干。

●將平板封好，放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)(12-16小時)。

篩選陽性轉化子

將長出轉化子的平板做好標記，進行印跡、菌落PCR、質粒PCR和酶切鑒定。

印跡：將長出的轉化子用接種環(huán)挑取單菌落，在含有卡那霉素抗性的固體LB培養(yǎng)板上進行印跡。放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16小時。

菌落PCR 20μl PCR體系

PCR程序：30個循環(huán)

對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

在培養(yǎng)好的印跡菌板上，用接種環(huán)挑取單菌落，放入含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在37℃恒溫搖床中進行擴大培養(yǎng)，同時進行菌種的保存。

菌種的保存

·首先，將菌液的濃度培養(yǎng)到OD值為0.5-0.6時，在無菌操作的條件下向EP管中先加入事先滅好菌的87％的甘油100μL(純甘油太稠)，再加入900μL菌液，上下顛倒混勻。

·將EP管放入液氮中進行速凍，然后迅速將其放入冰箱-70℃中能夠保存2年或3年。

快速提取質粒法(提取質粒的試劑盒)：

●準備工作：檢查Buffer P1中是否已經(jīng)加入RNaseA。檢查Wash Solution中是否已經(jīng)加入乙醇。檢查Buffer P2和P3中是否有沉淀。

●取1.5-5ml培養(yǎng)好的菌液，8000g離心2分鐘收集菌體，棄盡培養(yǎng)基。

●在沉淀中加入250μl Buffer P1,使菌體徹底懸浮。

●加入250μl Buffer P2，馬上溫和顛倒離心管5-10次混勻，室溫靜置2-4分鐘。

●加入350μl Buffer P3,立刻溫和顛倒離心管5-10次使其完全混勻。

●12000g離心5-10分鐘，將上清液移入吸附柱中，8000g離心30秒，倒掉收集管中的液體。

●空吸附柱于9000g離心1分鐘。

●將吸附柱放到一個干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入50μl Elution Buffer，室溫靜置1分鐘后，離心2分鐘，保存管中DNA溶液備用。

將上述提取好的質粒進行瓊脂糖凝膠電泳。確定提取質粒的量。

進行質粒PCR:20μl質粒PCR體系

PCR程序：30個循環(huán)

對該PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

將質粒進行雙酶切，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱4小時，后對酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

20μl雙酶切體系：

通過一系列的鑒定，將提取的質粒10μl送去華大基因公司進行測序。

上述實驗操作中所用的試劑：

Trans5α感受態(tài)細胞和T4連接酶購自北京全式金公司，所有涉及到的限制性內切酶和rTaq酶購買自大連寶生物公司，高純度質粒小提試劑盒購自上海生工公司，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自康為試劑生物科技公司，測序由華大基因測序公司完成。

上述構建過程中涉及到的所有引物序列：

TP5，<400>5所示序列：5’GGAAGATCTATGGCTTCTATGATATCCTC 3’

TP6，<400>6所示序列：5’GGAATTCCATATGGGATCCGCACTTTACTCTTCCACCAT 3’

PA1，<400>7所示序列：5’GGTACCCCGTGCGGGCCCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAAT 3’

PA2，<400>8所示序列：5’GAGCTCAAGCTTTCTAGACCCGATCTAGTAACATAGAT 3’

35S1，<400>9所示序列：5’GGTACCGAATTCGTCGACGCTAGAGCAGCTTGCCAAC 3’

35S2，<400>10所示序列：5’AGATCT CCGGGATCTGCGAAAGCTCG 3’

DR1，<400>11所示序列:5’GGAAGATCTGGATCCCCCGGGAGTGTACGGCGTGGCACGG3’

DR2，<400>12所示序列:5’GGAATTCCATATGCAGCATTTTCCATACATTCTTCCAC3’

DR序列為<400>13所示序列

SG1，<400>14所示序列:5'GAAGATCTATGAGTTTGGTGAATTCTACTGC 3'

SG2，<400>15所示序列:5'GGAATTCCATATGTTAATTATCCCTGTAAGCAATATAA3'

S1，<400>16所示序列:5'GAAGATCTATGAGCTGGTGGTGGAAAAG3'

S2,<400>17所示序列:5'AACTGCAGCTATGGGATAAATTTGAAGTCTCTC3'

SmGPPS,<400>18所示序列

SmIS1,<400>19所示序列。

上述參照具體實施方式對該植物中間表達載體及其構建方法與應用進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內。