本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體地說，涉及一種豬ApoE基因敲除打靶載體及其構建方法和應用。

背景技術：

基因打靶技術的主要原理是外源DNA序列與受體細胞內染色體上同源的DNA序列之間可以發(fā)生同源重組，該技術可以對基因組進行定點的精細修飾。自2000年首例體細胞基因打靶克隆羊誕生之后，體細胞基因打靶技術結合核移植技術被廣泛應用于對大動物基因組進行定點的精細修飾。

載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是一種多態(tài)性蛋白，參與脂蛋白的轉化與代謝過程，載脂蛋白E主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中，正常人血漿ApoE濃度為0.03～0.05g/L。ApoE的濃度與血漿甘油三酯含量呈正相關。ApoE與個體血脂水平與動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)發(fā)生發(fā)展密切相關。

小鼠、大鼠食性與人相近,成本低，是主要動物模型之一，然而他們對外源性膽固醇吸收率低,難致As病變。特別是小鼠的頸動脈和冠狀動脈過小造成了取材的困難，且血液動力學指標和人的極不相同，很難真正模擬人類的病理過程。

兔雖然對外源性膽固醇吸收率高,肝內低密度脂蛋白(LDL)含量高,但是肝臟合成的載脂蛋白與人類不同。同時家兔食餌性As模型，常出現全身性的脂質沉積，導致動物在實驗過程中時常死亡，給研究帶來了不必要的損失。

非人靈長類動物，如大猩猩等、進化程度與人類接近；有些品系對膽固醇敏感；有些能自發(fā)As。但As的發(fā)生位置多樣；試驗費用昂貴和實驗操作困難；且涉及倫理問題，給研究帶來不便。

由于心血管系統(tǒng)在解剖學和生理學上與人的相似性，豬被廣泛應用于心血管系統(tǒng)的手術操作和機理研究。包括在介入性導管裝置的測試、心肌梗死、冠狀動脈血流、心臟電生理和心血管外科方面的研究等。目前公認豬是動脈硬化研究的首選動物，因此與人類相似性極高的小型豬動脈硬化疾病模型的構建顯得尤其重要。

因此，亟待開發(fā)一種對ApoE進行基因打靶的載體，并利用該載體構建小型豬動脈硬化疾病模型，從而為開展動脈粥樣硬化病理研究、藥物篩選、藥效評價等研究提供支持。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種豬ApoE基因敲除打靶載體及其構建方法。

本發(fā)明的另一目的是提供所述打靶載體在制備豬ApoE基因敲除動物模型中的應用。

為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種豬ApoE基因敲除打靶載體，所述打靶載體是以載體pLoxPneo作為骨架載體，所述打靶載體上包括正篩選元件、負篩選標記基因以及豬ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂；

其中，所述正篩選元件包括順次連接的重組酶識別序列-正篩選標記基因-重組酶基因-重組酶識別序列；

所述正篩選元件的一端與所述豬ApoE基因的3’同源臂連接，另一端與所述豬ApoE基因的5’同源臂連接；在所述豬ApoE基因的3’同源臂的外側連接有負篩選標記基因。

本發(fā)明在構建的基因打靶載體時，采用的是正負篩選策略，因此能夠很大程度上排除隨機整合的細胞，提高打靶細胞富集效率。

通過在正篩選基因兩側引入重組酶識別序列，以方便后續(xù)的標記基因的刪除。

本發(fā)明涉及的正篩選標記基因包括編碼新霉素磷酸轉移酶(neo)、潮霉素B磷酸轉移酶(hph)、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(hprt)或嘌呤霉素乙酰轉移酶(puro)等的基因；優(yōu)選的，所述正篩選標記基因為neo。

本發(fā)明涉及的負篩選基因是編碼白喉毒素(DTA)或胸腺去氧核苷等的基因；優(yōu)選的，所述負篩選基因為DTA。

本發(fā)明涉及的重組酶基因包括編碼Cre酶或Flp酶的基因；優(yōu)選的，所述重組酶基因為帶有tACE特異性啟動子的Cre基因。

優(yōu)選地，所述正篩選元件為loxP-Neo-Cre-loxP。

本發(fā)明涉及的豬ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和2所示。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，構建的打靶載體其完整的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明還提供所述豬ApoE基因敲除打靶載體的構建方法，包括以下步驟：

S1、通過酶切連接的方法，在載體pLoxPneo(即ploxp)中引入負篩選標記基因，得到載體ploxp-1；

S2、以豬基因組DNA為模板，設計PCR引物，分別擴增得到豬ApoE基因的5’同源臂和3’同源臂；將PCR擴增產物分別連接至pEASY-T載體中，然后進行測序；

S3、將測序正確的5’同源臂和3’同源臂，采用酶切連接的方法依次連接至載體ploxp-1上，得到載體ploxp-2；

S4、將正篩選元件引入載體ploxp-2中，即構建得到豬ApoE基因敲除打靶載體。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，S4是利用基因抓捕技術將帶有特異性啟動子的Cre基因導入標記基因中，完成整個打靶載體的構建。該技術效率高、操作簡單、不依賴酶切連接，提高了基因打靶載體構建的效率。

本發(fā)明還提供所述打靶載體在制備豬ApoE基因敲除動物模型中的應用。

將所述打靶載體轉染豬胎兒成纖維細胞，通過正負篩選獲得中靶的陽性克隆細胞系，以所述陽性克隆細胞系為核移植供體細胞，成熟的豬卵母細胞為核移植受體細胞，通過體細胞核移植技術獲得克隆胚胎；將克隆胚胎移入發(fā)情期的受體母豬子宮內妊娠，獲得ApoE基因敲除F0代豬，將所得F0代豬進行雜交繁育，獲得的純合子作為豬ApoE基因敲除動物模型。

本發(fā)明進一步提供一種豬ApoE基因敲除前體細胞系，用上述構建的豬ApoE基因敲除打靶載體轉染豬胎兒成纖維細胞，獲得的中靶陽性細胞克隆，即為豬ApoE基因敲除前體細胞系。

通過含有與正篩選標記基因相應藥物的培養(yǎng)基篩選得到陽性細胞。

其中，用于鑒定中靶陽性細胞克隆的特異性PCR引物包括：

SARM-S-F:5’-GGCTTTGGTTCCAGAGTTCACAGTC-3’

CRE-NHE1-R:

5’-TTCGAGAACTGCTAGCGGATCTCGGGGCAAGACAAATGTC-3’。

利用本發(fā)明方法成功獲得了健康存活的ApoE基因敲除的純合子小型豬，為心血管疾病的新藥創(chuàng)制奠定基礎，同時為開展病理研究、藥物篩選、藥效評價等提供保障。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中豬ApoE基因敲除打靶載體ApoE KO II(即pAPOEKO-NEO-CRE-DTA-AMP)的構建流程圖。

圖2為本發(fā)明實施例1中打靶載體ApoE KO II的酶切鑒定結果。

圖3為本發(fā)明實施例3中ApoE基因敲除克隆豬的PCR(A)和Southern Blot(B)鑒定結果；A中1-6為ApoE基因敲除的克隆豬，PCR擴增得到5kb大小的條帶；B中1-6為ApoE基因敲除克隆豬，能夠雜交到7kb和5.3kb大小的條帶，野生型豬(WT)只能得到7kb的條帶。

圖4為本發(fā)明實施例3中ApoE基因敲除雜合子克隆豬的血脂測定的統(tǒng)計結果；其中，TG：膽固醇；TC：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白；LDL-C：低密度脂蛋白。

圖5為本發(fā)明實施例3中利用Western Blot檢測了基因打靶克隆豬雜合子以及純合子的血清中ApoE蛋白的表達水平。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1豬ApoE基因敲除打靶載體的構建

包括以下步驟：

第一步：通過酶切-連接的方法，改造打靶載體pLoxPneo(即ploxp)，引入負篩選基因DTA，得到載體ploxp-DTA。

第二步：利用高保真PCR方法以小型豬的基因組DNA為模板，擴增2.4kb的片段作為5’同源臂，同時擴增一段5.7kb的片段作為3’同源臂，將PCR產物連接至T載體中測序，5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

擴增5’同源臂的引物序列如下(5′-3′)：

SARM-F：GAATTCAGGCTTTGGTTCCAGAGTTCACAG

SARM-R：GTCGACAGGCAACAACGCATTAGAAACAG

其中，下劃線分別為EcoRI和SalI酶切位點；

擴增3’同源臂的引物序列如下(5′-3′)：

LARM-F：GCGGCCGCACCAGGGAACTCCATCCTTTCTAACTCTG

LARM-R：GCGGCCGCGTGAGACTCCAGGGATGGTAAAGGAG

其中，下劃線為NotI酶切位點。

第三步：在獲得正確的5’同源臂和3’同源臂之后，采用酶切-連接的方法先后將5’同源臂和3’同源臂連接至載體ploxp-DTA上，得到重組載體ApoE KO。

第四步：利用基因抓捕技術將帶有特異性啟動子的Cre基因導入載體ApoE KO中，完成整個打靶載體的構建，將構建得到的豬ApoE基因敲除打靶載體命名為ApoE KO II(即pAPOEKO-NEO-CRE-DTA-AMP，SEQ ID NO:3)。打靶載體ApoE KO II的構建流程見圖1，酶切鑒定結果見圖2。

實施例2豬胎兒成纖維細胞轉染及細胞篩選與鑒定

采用德國Lonza公司生產的核酸轉染儀，將3μg經過線性化的打靶載體ApoE KO II轉入豬胎兒成纖維細胞中。

細胞轉染48h后，胰酶消化法將細胞從T75細胞培養(yǎng)瓶中消化下來，每100mm細胞培養(yǎng)皿接4×10⁵個細胞，并用G418濃度為500μg/mL的細胞培養(yǎng)基篩選細胞7-9天。

用細胞克隆環(huán)將具有G418抗性的細胞克隆點挑選出來接種到48孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞培養(yǎng)至80％匯合，胰酶消化后，接種到12孔細胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，原來48孔細胞培養(yǎng)板中的未被消化下來的細胞也繼續(xù)培養(yǎng)以供提取細胞基因組DNA，之后細胞繼續(xù)培養(yǎng)至長滿6孔板的一孔，采用PCR擴增的方法對細胞克隆點進行鑒定。

PCR引物序列如下：

SARM-S-F:5’-GGCTTTGGTTCCAGAGTTCACAGTC-3’

CRE-NHE1-R:

5’-TTCGAGAACTGCTAGCGGATCTCGGGGCAAGACAAATGTC-3’

PCR擴增體系如下：

PCR程序如下：95℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃270s，35個循環(huán)；72℃5min；4℃∞。

經鑒定，得到3個陽性細胞克隆點。細胞篩選結果以及中靶效率統(tǒng)計見表1。

表1細胞轉染以及基因打靶效率統(tǒng)計結果

注：黑3代表小黑豬3號細胞系，黑4代表小黑豬3號細胞系，CEPEF3代表小型豬3號細胞系，CEPEF6代表小型豬6號細胞系，11PB5-2代表小型豬5-2號細胞系，11PB5-3代表小型豬5-3號細胞系。

實施例3轉基因克隆豬純合子的生產與鑒定

1、轉基因克隆豬的生產

1)豬卵母細胞體外成熟：從屠宰場取卵巢，放入28℃-35℃含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中，2小時內運回實驗室，用配有18號針頭的20毫升注射器抽吸卵巢上直徑3-6毫米的卵泡，將抽取液放于50毫升離心管中，37℃水浴中靜置15分鐘，去上清，加入HEPES重懸沉淀，再靜置15分鐘，重復一次，將重懸液放入直徑60毫米的塑料培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下，用口吸管挑選卵丘包裹2層以上、致密、胞質均勻的卵丘細胞-卵母細胞復合體，用成熟培養(yǎng)液洗滌3遍，轉入在培養(yǎng)箱中至少已經平衡4小時的培養(yǎng)液滴內(每100微升液滴放25枚)；每一直徑35毫米的塑料培養(yǎng)皿中做4個液滴，用胚胎級礦物油覆蓋，將卵丘細胞-卵母細胞復合體先在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)20±2小時，然后轉移到無hCG以及eCG的成熟液中繼續(xù)培養(yǎng)20±2小時。

2)供體體細胞的準備：將經過鑒定為陽性的細胞克隆鋪到6孔板進行培養(yǎng)，待其生長至80％匯合時，進行血清饑餓處理，即將培養(yǎng)液中的FBS濃度從20％降至0.5％繼續(xù)培養(yǎng)2-5天，按常規(guī)方法消化，離心洗滌，最后加1毫升顯微操作液重懸細胞沉淀備用。

3)受體卵母細胞去核以及供體細胞核移植：利用盲吸法進行成熟卵母細胞去核，即成熟40-44小時的豬卵母細胞，脫卵丘后選擇胞質均勻、卵周隙清晰、胞膜完整的卵母細胞放入無Ca²⁺、Mg²⁺、HEPES的NCSU-23緩沖液中備用，轉移到顯微操作液滴內(核移植前1小時制備，直徑60毫米的細胞培養(yǎng)皿蓋中央，液滴50-80微升、2-3毫米寬、8-10毫米長、石蠟油覆蓋)，作用15-30分鐘，將供體細胞以及成熟卵母細胞同時轉入其中于39℃、5％CO₂、100％濕度平衡15分鐘，安裝顯微固定管以及去核/注射針，調節(jié)好操作系統(tǒng)位置在裝配有顯微操作儀及恒溫臺的倒置顯微鏡下,40倍顯微鏡下用固定管(內徑25-35微米,外徑100-120微米)吸持卵母細胞，用內徑15-25微米的去核/注射針撥動卵母細胞，使第一極體處于鐘表1點鐘位置，200倍顯微鏡下，從鐘表3點處將去核/注射針刺過透明帶，吸出第一極體及其附近少許細胞質，退出去核/注射針，將第一極體以及少許胞質吐出，挑選直徑15-20微米、折光性強、圓形、光滑的體細胞，200倍顯微鏡下用去核/注射針吸取一個供體細胞，從去核進針處將體細胞注射到透明帶下的卵周隙內，用注射針點壓透明帶，使供體細胞與受體卵胞質的細胞膜彼此緊密接觸，每批25-30個卵母細胞，構建完成后將供體細胞-卵胞質構成的細胞對(重構卵)轉移到含有4mg/mlBSA的NCSU-23培養(yǎng)液中，39℃、5％CO₂、100％濕度培養(yǎng)箱中修復1-2小時。

4)重構胚融合與激活：將恢復好的重構卵分批轉移到融合液中平衡3分鐘，用融合/激活液洗滌3遍后，每批5個放入已經鋪滿融合液的融合槽內，用拉制的且尖端很細的實心玻璃針撥動重組卵,使供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與電極平行，用ECM2001融合儀施加一個30μs,2.0kv/cm的直流電脈沖誘導融合同時激活，用含有4mg/ml BSA的NCSU-23％洗滌5遍，立即轉入礦物油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液中，39℃、5％CO₂、100％濕度培養(yǎng)0.5～1小時后取出，在體視顯微鏡下判定融合。

5)囊胚發(fā)育：在開始顯微操作前至少4小時預先做好培養(yǎng)液滴：在超凈臺內取35毫米培養(yǎng)皿，做6-8個30微升大的液滴，小心加入2.5-3毫升礦物油覆蓋，做好標記后放入CO₂培養(yǎng)箱內平衡將上述融合的重構胚用胚胎培養(yǎng)液洗滌5遍后轉入30微升的液滴，每個液滴培養(yǎng)8-10個重構胚。

6)胚胎移植：挑選自然發(fā)情母豬，將在CO₂養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-30小時的1-2細胞期的克隆胚取出，裝入2.5毫升細管內，用滅菌的錫箔紙包裝好，做好標記，放到恒溫運輸箱中運到豬移植地點，用40-60毫升(1mg/100kg體重)生理鹽水溶解1-1.5毫克硫噴妥鈉和地西泮，耳靜脈注射20毫升，待受體豬初步麻倒后，將其抬到手術架上仰臥(青年后備母豬)或者側臥(經產母豬)，用繩子綁定，對后備母豬，在腹部下面第1對和第2對乳頭之間，腹中線局部15×10cm²面積內清潔刮毛，先碘酒消毒，后酒精棉脫碘(對經產母豬，在腹部肷窩部15×10cm²的范圍內清潔，刮毛，碘酒消毒后酒精脫碘)在準備動刀切開腹中線之前，將前面余下的麻醉藥再酌情注射20-30毫升，沿腹中線切開一個長約8-10厘米的口，打開腹腔，探進去一只手，取出卵巢后用潤濕的滅菌脫脂紗布蓋上(對經產母豬:沿側腹部做一個與腹中線面垂直的長約10厘米的切口)，在手術人員即將取出卵巢，調整好輸卵管傘之際，將裝在吸管內的胚胎取出放在熱臺上，體視顯微鏡下將胚胎裝入移植管內，手術人員和胚胎移植人員相互協(xié)調，將移植管從輸卵管傘部探入輸卵管至少5厘米，大致到了壺腹-峽部結合處，一邊推動注射器，以便外撤移植管，移植后體視鏡下觀察胚胎是否仍滯留在移植管內，確認沒有后，開始卵巢回位，術口縫合，胚胎移植后第10天肌肉注射800IU的hCG，13天注射500IU的PMSG。

2、ApoE基因敲除打靶克隆雜合子豬的分子鑒定

用PCR和Southern Blot的方法對6頭出生的單敲除打靶克隆豬進行基因型鑒定，PCR鑒定方法如實施例2所述，Southern Blot所用的探針為同源斷臂上的一段序列，實驗結果表明，該6頭均為ApoE基因單敲除陽性豬，結果如圖3所示。

3、ApoE基因敲除打靶雜合子克隆豬的血脂檢測

為了檢測ApoE基因敲除打靶雜合子克隆豬個體是否會引起動脈硬化相關疾病變化，本發(fā)明檢測了部分雜合子個體的血清水平，檢測結果初步表明雜合子克隆豬個體血脂四項并無顯著性差異(圖4)，可能雜合子個體由于補償作用導致表現不明顯。進一步實驗需要獲得雙敲除純合子個體。

4、基因敲除打靶雜合子以及純合子克隆豬的ApoE蛋白表達水平檢測

本發(fā)明利用Western Blot檢測了基因打靶克隆豬雜合子以及純合子的血清中ApoE蛋白的表達水平。在轉基因克隆豬雜合子(ApoE^+/-)的血清中仍然能夠檢測到ApoE蛋白的表達，而在ApoE敲除純合子(ApoE^-/-)中，血清中檢測不到ApoE蛋白的表達，結果如圖5所示。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。