專利名稱：包含含有不可水解共價鍵的聚合物結(jié)合劑的藥物組合物及其在治療乳糜瀉中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含聚合物結(jié)合劑的藥物組合物及其使用方法。更具體地, 本發(fā)明涉及用于結(jié)合谷蛋白或麥醇溶蛋白和/或源自谷蛋白或麥醇溶蛋白 降解的肽的不可消化合成聚合物及其使用方法。
背景技術(shù)：
乳糜瀉，又稱為谷蛋白不耐受，是一種在遺傳性易感對象中以接觸面 筋的麥醇溶蛋白級分或大麥和黑麥的類似醇溶性蛋白(谷醇溶蛋白)之后 的小腸粘膜損傷為特征的綜合征。乳糜瀉是一種普通的自身免疫病癥，其 具有遺傳、環(huán)境和免疫上的因素。此疾病與編碼人白細胞抗原DQ2和DQ8 的基因密切相關(guān)(1)。鑒別出a-麥醇溶蛋白的一種33個單位的片段，其 具有幾個特征表明其為乳糜瀉患者中對谷蛋白炎性應答的可能引發(fā)劑 (2)。
乳糜瀉的癥狀可為從輕度虛弱、骨痛和口瘡性口炎到慢性腹瀉、■ 以及進行性體重減輕(3)。由于廣泛的癥狀，乳糜瀉的存在可能難于診斷。 那些受影響的患者遭受其腸固有層和隱窩區(qū)域的絨毛損傷(變短和絨毛扁 平化)(3)。此外，在患有未治療或難治療乳糜瀉的患者中多達15%JtA 成胃腸道癌或淋巴瘤(4)。不含谷蛋白的飲食可預防此疾病的幾乎所有并 發(fā)癥(5)。這樣的飲食涉及避免所有含有小麥、黑麥、大麥或其任何衍生 物的產(chǎn)品。這是個困難的任務，因為在很多加工食品的成分中可發(fā)現(xiàn)許多 隱藏的谷蛋白源。
迄今，除了從乳糜瀉患者的飲食中排除含有谷蛋白的食物以外，還沒 有可用于乳糜瀉患者的藥物療法。出人意料地，相對為數(shù)不多的治療策略 目前正在探索中?；诳贵w耐受性和T細胞介導的對麥醇溶蛋白毒性肽的
應答或者基于阻斷IL-15介導的小腸粘膜變化的抗IL-15的中和抗體的開 發(fā)的方法正在研究中(6)。 一個有希望的途徑在于外源性酶的發(fā)現(xiàn)，所述 外源性酶可在原位迅速降解毒性肽(7 )。然而，與大自酶生產(chǎn)相關(guān)的高 成本和口服后可能的活性損失是其商業(yè)化的潛在限制。旨在干M蛋白活 性T細胞的活化的互補性策略包括抑制谷蛋白肽與人白細胞抗原(HLA) DQ2 (或DQ8)的結(jié)合。HLA在乳糜瀉t艮中的關(guān)鍵作用使得其成為治 療干預的明顯標靶。最近解出的與脫^J^蛋白肽^的HLA-DQ2的X-射線晶體結(jié)構(gòu)已提供了用于開發(fā)阻斷HLA-DQ2的化合物的重要信息(8 )。 已提議連蛋白拮抗劑作為乳糜瀉的治療劑。連蛋白是一種涉及調(diào)節(jié)小腸內(nèi) 分子間緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)。其表^4乳糜瀉急性期期間已顯示出增加，所 述乳糜瀉急性期，滲透性增加的臨床病況(9)。
對于具有低含量或不含免疫毒性序列但又具有合理的烘焙質(zhì)量的谷類 的開發(fā)研究也已進行?？梢酝ㄟ^對古老小麥品種的選擇性培養(yǎng)(IO)、通過 涉及導致免疫激活序列的序列突變的轉(zhuǎn)基因技術(shù)(11)或通過將無毒的谷 蛋白基因引入無害的有機體比如稻米內(nèi)(12)而開發(fā)這些谷類。盡管這些 谷類在技術(shù)上對工程師來說是有希望的，但存在著這樣的可能性含有谷 蛋白的谷類的交叉授粉可能會導致再51入免疫毒性序列，這些谷類的可獲 得性會給患有乳糜瀉的患者帶來營養(yǎng)上較好的飲食。
聚合物結(jié)合劑(polymeric binder)
大量的聚合物結(jié)合劑已經(jīng)用于治療或預防某些疾病。
聚合物結(jié)合劑的經(jīng)典實例是消膽胺，其為一種在腸內(nèi)多價螯合膽酸并
因此降低膽固醇血液水平的陽離子樹脂。近來，鹽酸司維拉姆(一種不含
鋁和鈣、具有可忽略的副作用的新型聚合磷酸酯結(jié)合劑)已被商業(yè)化用于
治療透析患者中的高磷血癥。也許在該領(lǐng)域中最讓人感興趣的發(fā)現(xiàn)是陰離
子的高分子量聚合物GT160-246,其表現(xiàn)出在體外和在體內(nèi)均中和 帥梭
菌(C7m加W/"附力j^c,7e) A毒素的活性(13 )。此內(nèi)毒素最常被確認為是
感染性醫(yī)院腹瀉的原因。GT160-246提供了一種有前途且安全的非抗微生 物的治療和預防人類中艱難梭菌結(jié)腸炎的方法。
高分子量聚合物可在乳糜瀉中有潛在用途的這一想法源于 Auricchio等的研究(14)，這一研究證實了甘露聚糖(甘露糖同多糖) 和乙酰葡萄糖胺低聚物顯示出對患有活性乳糜瀉患者的腸粘膜樣品的 保護作用(14)。這些發(fā)現(xiàn)表明，凝集且有毒的肽被這些碳水化合物所
結(jié)合。Secimdo等(26)探索了另一種多糖——糊精——對麥醇溶蛋白 二級結(jié)構(gòu)的作用，并猜測糊精可用于制備用于患有乳糜瀉的患者的無毒 食品衍生物。雖然有這些令人感興趣的初步數(shù)據(jù)，但還未進行進一步的 研究以在體內(nèi)證實這些發(fā)現(xiàn)。天然碳水化合物的主要缺點在于其在體內(nèi) 條件下的可降解性，這將導致其在原位失活。
本發(fā)明試圖滿足這些需要以及其它的需要。
本說明書參考了大量文獻，這些文獻的內(nèi)容均通過引用整體并入本文。
發(fā)明內(nèi)容
更具體地，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種包含聚合物結(jié)合劑 和藥學可接受載體的藥物組合物，所述聚合物結(jié)合劑包含具有由不可水 解的共價鍵構(gòu)成的主鏈的高分子量合成聚合物，所述聚合物能在pH低 于谷蛋白和源自谷蛋白降解的肽的等電點時形成靜電鍵，并且能在胃腸 道中與谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽結(jié)合。
在所述藥物組合物的一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合劑能與 谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽形成疏水性相互作用。在所述藥物組合物 的另一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合劑能形成氫鍵。在所述藥物 組合物的另 一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合劑能在胃腸道中特異 性地與谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽結(jié)合。在所述藥物組合物的另一個 具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合劑能在腸道中與谷蛋白或源自谷蛋白 降解的肽結(jié)合。在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述聚合 物結(jié)合劑是曱基丙烯酸羥乙酯(HEMA)與4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物 (SStNa)的共聚物。在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所 述聚合物結(jié)合劑是4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物(SStNa)的聚合物。在所 述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合劑是曱基丙烯 酸磺酸丙酯鉀鹽(SPMAK)的聚合物。
在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合劑是 線型的。在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合 劑是星形的。在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述聚合物 結(jié)合劑是3至18臂星形共聚物。在所述藥物組合物的另一個具體實施 方案中，所述聚合物結(jié)合劑是5至18臂星形共聚物。在所述藥物組合
物的另一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合劑是5臂星形共聚物。在 所述藥物組合物的另 一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié)合劑是8臂星 形共聚物。在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述聚合物結(jié) 合劑是18臂星形共聚物。在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中， 所述聚合物結(jié)合劑是HEMA與SStNa的共聚物，且HEMA/SStNa的摩 爾百分比之比為93.5/6.5到約1/99。在所述藥物組合物的另一個具體實 施方案中，所述共聚物是線型的HEMA/SStNa (51.5/48.5，摩爾％)。在 所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述共聚物是線型的 HEMA/SStNa ( 43/57,摩爾％)。在所述藥物組合物的另一個具體實施 方案中，所述共聚物的HEMA/SPMAK摩爾百分比之比為約93.5/6.5到 約1/99(%)。在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述共聚 物的HEMA/SPMAK摩爾百分比之比為約86/14到約1/99。
在所述藥物組合物的另一個具體實施方案中，所述共聚物是線型的 HEMA/SPMAK ( 45/55，摩爾％ )。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物還包含連蛋白拮抗 劑或HLA DQ2抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明的另 一個方面，提供了使用本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑的方 法，包括給患有乳糜瀉的患者施用藥物有效量的所述聚合物結(jié)合劑。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法用于在患者內(nèi)結(jié)合谷蛋白或 源自谷蛋白降解的肽。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法用于減少谷蛋白在患者體 內(nèi)降解成毒性肽。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法用于減少谷蛋白或源自谷 蛋白降解的肽與患者的胃腸道粘膜的相互作用。
在本發(fā)明另 一個具體實施方案中，所述施用在所述患者進食含有谷 蛋白的膳食之前或期間進行。在本發(fā)明方法的另一個具體實施方案中， 所述施用在所述患者進食含有谷蛋白的膳食之后進行。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑在制備藥物 中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑用于在有此 需要的患者的胃腸道內(nèi)結(jié)合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑在制備用于 在有此需要的患者的胃腸道內(nèi)結(jié)合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽的藥 物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑用于減少谷 蛋白或源自谷蛋白降解的肽與有此需要的患者的胃腸道粘膜的相互作 用的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑在制備用于 減少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽與有此需要的患者的胃腸道粘膜的 相互作用的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑用于減少谷 蛋白在有此需要的患者的胃腸道內(nèi)降解成毒性肽的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑在制備用于 減少谷蛋白在有此需要的患者的胃腸道內(nèi)降解成毒性肽的藥物中的用 途。
在本發(fā)明的用途的一個具體實施方案中，所述患者患有乳糜瀉。 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑的食
物o
在本發(fā)明的食物的一個具體實施方案中，所述食物是含有谷蛋白的 食物。在本發(fā)明的食物的一個具體實施方案中，所述食物是面包。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種使用本發(fā)明的食物的方法，包 括給患有乳糜瀉的患者在其進食期間施用所述食物。在一個具體實施方 案中，本發(fā)明的方法用于結(jié)合所述患者的膳食中所含有的谷蛋白或源自 谷蛋白降解的肽。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法用于減少所 述患者的膳食中所含有的谷蛋白降解成毒性肽。在一個具體實施方案 中，本發(fā)明的方法用于減少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽與所述患者的 胃腸道粘膜的相互作用。
根據(jù)本發(fā)明的另 一方面，提供了 一種制備供給患有乳糜瀉的患者的 食物的方法，所述方法包括將本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑加入到所述食物 中。在本發(fā)明方法的一個具體實施方案中，所述食物是含有谷蛋白的食物。
本發(fā)明涉及高分子量的惰性、不可吸收的聚合物結(jié)合劑，其用來吸 附谷蛋白和/或其降解產(chǎn)物。這樣的體系將有助于預防或減少谷蛋白對 胃腸道粘膜的有害作用。不受此限制，猜測肽與所述聚合物的結(jié)合有兩 個作用。首先，所述酶解和毒性片段的產(chǎn)生通過谷蛋白和/或其降解產(chǎn) 物吸附到惰性支持物上而減緩。其次，與高分子量聚合物的絡合減少了 肽的吸收和隨后的免疫應答。因此，此體系提供了一種供面臨不能確定 不存在谷蛋白殘留或不可獲得不含谷蛋白的膳食的情況的患者的預防 佐劑。
盡管在本文中提出了具體的不可消化的合成聚合物，但本發(fā)明并非 限定于此。如本文中所使用的，當用于限定本發(fā)明的聚合物時，術(shù)語"不 可消化"意指具有由不可水解的共價鍵構(gòu)成的主鏈的聚合物。相信本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員可容易地確定可根據(jù)本發(fā)明使用的其它不可消化的合 成聚合物。同樣，可最優(yōu)化本文中所具體描述的聚合物以使其與谷蛋白 及谷蛋白降解產(chǎn)物的親和力最大化并使其與其它蛋白的結(jié)合最小化。當 然， 一定比例的這些蛋白/肽將免于被吸附到本發(fā)明的聚合物上，但已
表明，每日攝取4-14mg的麥醇溶蛋白不會引起乳糜瀉患者的小腸粘膜 損傷(15)。當然，這一體系不會作為主要療法取代不含谷蛋白的飲食。 然而，當患者面臨不能確定不存在谷蛋白殘留或不可獲得不含谷蛋白的 膳食的情況時，其可偶爾用作預防佐劑。
本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑可有利地減少谷蛋白和源于谷蛋白的肽的 口服吸收。這些聚合物結(jié)合劑在胃腸道中起作用而不被吸收到血流中， 從而使聚合物本身引起不良反應的可能性最小化。在低于谷蛋白和源于 谷蛋白的肽的等電點的pH下，所述聚合物結(jié)合劑帶負電荷而這些蛋白 和肽帶正電荷，這使得可形成靜電相互作用。這些聚合物結(jié)合劑還可與 這些蛋白和肽形成疏水性相互作用。在具體實施方案中，本發(fā)明的聚合 物結(jié)合劑還具有形成氫鍵的能力。盡管最后的性質(zhì)可能是所希望的，但 表明其并非是必需的，因為發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的某些不具備此性質(zhì)的聚合物 (例如曱基丙烯酸磺酸丙酯鉀鹽(SPMAK)的均聚物)也能與谷蛋白 結(jié)合。不受此限制，可使用下表l中列出的單體合成這些聚合物結(jié)合劑。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可選擇這些(或其它)單體中的一種或更多種的組 合以形成本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑
苯乙烯衍生物
-苯乙烯磺酸鹽/酯
-苯乙烯硫酸鹽/酯
-苯乙烯磺胺酸鹽/酯
-磺苯基丙氨酸
-酪氨酸硫酸鹽/酯
-磺基苯乙基丙烯酰胺
-磺基苯乙基甲基丙烯酰胺
-乙烯基萘磺酸鹽/酯
-乙烯基萘硫酸鹽/酯
畫乙烯基聯(lián)苯磺酸鹽/酯
國乙烯基聯(lián)^it酸鹽/酯
-茴香腦磺酸鹽/酯
-具有冠醚部分的苯乙烯
-被N,N-二烷基酰氨基取代的苯乙烯 -4-甲氧基苯乙烯
4-P-(N，N-二甲基氨基)乙基)苯乙烯
一P-(N,N-二甲基氨基)甲基)苯乙烯
-4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙基)苯乙烯
-4-二(]\,1^-二乙基氨基)膦基-a-甲基苯乙烯
-4-乙烯基苯酚
-3-乙烯基兒茶酚
-4-乙烯基苯乙酮
-4-乙烯基苯甲酸
-3-乙烯基苯曱酸
-2-(4-乙烯基苯基)-l，3-二氧戊環(huán)
-2-(4-乙烯基苯基)-1，3-二氧雜環(huán)己烷
-4-二甲氧基甲基苯乙烯-(4-乙烯基苯甲醛二甲基縮醛)
-2-(2-乙烯基苯基)-l,3-二氧戊環(huán)
-2-(3-乙烯基苯基)-1,3-二氧戊環(huán)
畫l畫(4-乙烯基苯基)-4-甲基-2,6，7-三氧雜二環(huán)[2.2.2辛烷
-4-(2-羥乙基)苯乙烯
-4-(3-羥丙基)苯乙烯
-4-{[4-(4-乙烯基苯基)丁氧基甲基}-1-甲基-2,6,7-三氧雜二環(huán)[2.2.2辛烷
-4-乙烯基苯石危酚
-4-(2-巰基乙基)苯乙烯
-2-(4-乙烯基苯基)-2-嚅唑啉
-N，N-二乙基-4-乙烯基苯磺酰胺
-N-曱基-N，- [(4-乙烯基苯基)磺?；?/b>哌噢
-4-氨基苯乙烯
-3-氨基苯乙烯
-4-氨基曱基苯乙烯
-3-氨基甲基苯乙烯
-4-(2-氨基乙基)苯乙烯
帶有羥基的苯乙烯
-(對乙烯基苯甲酰氨基)-P-殼二糖
-(對乙烯基苯甲酰氨基)-p-乳糖
-N-(對乙烯基節(jié)基)-L-古洛糖酸酰胺(gulonamide)
-N-(對乙烯基節(jié)基)-6-D-葡糖二酸酰胺(glucaramide)
-N-(對乙烯基節(jié)基)-6-D-葡糖二酸酰胺-l-酯
-4-丙烯酰氨基苯基-p-乳糖普
-N-(對乙烯基爺基)-D-葡萄糖醛酸酰胺(glucoronamide)
-4-乙烯基節(jié)基-D-葡萄糖(D-甘露糖)己糖醇
-對P-[N-(對乙烯基千基)氨甲酰基乙基苯基a-D-吡喃甘露糖苷
-對[2-[N-(對乙烯基節(jié)基)氨甲?；?/b>乙基苯基p-D-吡喃甘露糖苷
國N-(對乙烯基爺基)-5
\-丙烯?；?氨基乙氧基4-0-(p-D-吡喃半乳糖基)-p-D-吡喃葡萄糖苷 (及硫酸化衍生物)
-N-馬來酰胺-2-脫氧-葡萄糖鈉鹽
-N-馬來酰胺-l-脫氧-乳糖醇鈉鹽
-巖藻糖-7-氧雜降水片烯衍生物
-C-Glc-7-氧雜降水片烯衍生物
-C-Man-7-氧雜降冰片烯衍生物
含不對稱葡萄糖的7-氧雜降水片烯衍生物
-O-Glc-7-氧雜降水片烯衍生物
-O-Man-7-氧雜降水片烯衍生物
含不對稱甘露糖的7-氧雜降水片烯衍生物
-O-Man降水片烯衍生物
-糖衍生的聚(7-氧雜降水片烯)
-糖衍生的聚(降水片烯)
當本發(fā)明的聚合物結(jié)合劑具有由不可水解的共價鍵構(gòu)成的主鏈時，
其也可包含含有可水解共價鍵的側(cè)鏈。
本文中所用的術(shù)語"谷蛋白"指在各種谷物中所發(fā)現(xiàn)的蛋白族
(protein group )?？蓪⒐鹊鞍追旨墳橐掖伎扇艿墓却既艿鞍缀鸵掖疾?溶的麥谷蛋白。來自小麥、黑麥、大麥和可能的燕麥的醇溶性谷醇溶蛋 白在乳糜瀉患者中是有毒的。小麥谷醇溶蛋白的共同特征是高含量的谷 氨酰胺(>30%)和脯氨酸(>15%)。小麥谷醇溶蛋白被分為a/p、 y和 o)麥醇溶蛋白，其含有富含谷氨酰胺和脯氨酸的相似或重復的肽抗原決 定簇，所述肽抗原決定簇似乎是所觀察到的谷蛋白毒性的原因。
本文中所用的術(shù)語"源自谷蛋白降解的肽"指在谷蛋白攝取后會合 乎需要地與本發(fā)明的聚合物結(jié)合的任何源自谷蛋白降解的肽。不受此限 制，其包括列于Ciccocioppo中的所有肽(23 )。
本文中所用的術(shù)語"高分子量聚合物"指分子量為5000-5000000 g/mol的聚合物。
本文中所用的術(shù)語"藥學可接受載體"指利用常用賦形劑(比如在 Modern Pharmaceutics (27)中描述的那些)制備的溶液、混懸液、乳 液、片劑或膠嚢。
本文中所用的術(shù)語本發(fā)明聚合物的"藥物有效量，，指在有此需要的 患者攝取谷蛋白后可有效降低谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽與胃腸道 粘膜的相互作用的量。不受此限制，本發(fā)明聚合物的有效量可為約200 mg至約15 g每天(例如200 mg^ 250 mg^ 300 mg^ 500 mg^ 750 mgs lg^ 1.5 g;2g; 2.5 g; 3 g， 5 g; 7.5 g)。
本文在表述"特異性地與谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽結(jié)合的聚合 物結(jié)合劑"中所用的術(shù)語"特異性結(jié)合，，指在胃腸道中相比于與其它的食 物蛋白(比如酪蛋白和/或白蛋白)的結(jié)合，所述聚合物與源自食物攝 入的疏水性的蛋白質(zhì)或肽(比如谷蛋白和源自谷蛋白的肽)結(jié)合得更多 的能力。
本發(fā)明包括線型或星形的聚合物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，星 形聚合物具有3~18個臂。
本文中所用的術(shù)語"有此需要的患者，，指受乳糜瀉影響的人，其正在 食用或已經(jīng)食入含有谷蛋白的膳食。
本文中不用數(shù)詞表示或者冠以"所述(該/此)"指一個或多于一個(即
至少一個)的如此限定的語法對象。
本文中所用的術(shù)語"包括"和"包含"指表述"包括但不限于"和"包含 但不限于"，并可互換使用。
本文中所用的術(shù)語"比如(例如)"意指"比如(例如)但不限于"， 并可互換使用。
在閱讀以下僅通過實例方式給出并參考附圖對本發(fā)明具體實施方 案所作的非限制性描述時，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和特征將更加顯而 易見。
在附圖中
圖l表示用于合成本文中所述的聚合物的線型和多官能團的ATRP 引發(fā)劑的化學結(jié)構(gòu)。(i) PEG-二溴代大分子引發(fā)劑(macroinitiator); (ii) -1,2,3,4,6-五-0-異丁酰溴-11-0-葡萄糖；(iii)十八-O-異丁酰溴-R-環(huán)糊精；(iv)八-O-異丁酰溴-蔗糖；
圖2表示三份相同的在pH 6.8下白蛋白和a-麥醇溶蛋白與聚 (HEMA-共-SStNa)結(jié)合的SDS-PAGE (實施例10): ( A)蛋白標準物； (B)白蛋白和a-麥醇溶蛋白混合物；(C)白蛋白(40mg/L)、 a-麥醇溶 蛋白(40 mg/L)和聚(HEMA-共-SStNa)(160 mg/L)的混合物；
圖3是線型聚(HEMA-共-SStNa)與麥醇溶蛋白、白蛋白以及酪蛋白 在pH 1.2和6.8下的結(jié)合語，其中每個點對應于實施例5~10和12~13 的每個聚合物；
圖4是線型聚(HEMA-共-SPMAK)與麥醇溶蛋白和白蛋白在pH 1.2 和6.8下的結(jié)合鐠，其中每個點對應于實施例17~21的每個聚合物；
圖5以圖示表示在中性pH下聚合物結(jié)構(gòu)對麥醇溶蛋白的結(jié)合的影 響(SStNa = 25-31摩爾％; ^見實施例9、 14、 15和16);
圖6以圖示表示在中性pH下聚合物結(jié)構(gòu)對麥醇溶蛋白的結(jié)合的影 響(SPMAK= 16-19摩爾％;參見實施例18、 22、 23和24);
圖7表示在模擬腸條件下本發(fā)明聚合物對麥醇溶蛋白消化的影響。 在(a)不存在聚合物和(b)存在聚合物的情況下用胃蛋白酶、胰蛋白 酶和胰凝乳蛋白酶(PTC)消化的麥醇溶蛋白的比較HPLC譜圖。色鐠
圖(c)對應于未處理的a-麥醇溶蛋白；
圖8表示在采用PEG (Mn: 35，000;空心圓形)、PVP ( Mw: 58,000; 實心矩形)、聚(HEMA-共-SStNa)(實施例10;空心三角形)和作為對 照的完全培養(yǎng)基(實心星形)的溶液孵育后Caco-2單層的跨上皮細胞 電阻(TEER)的變化。將細胞保持在添加了 10% FBS的DMEM細胞 培養(yǎng)基中。聚合物濃度固定在lg/L;和
圖9表示兩種含有約50% SStNa并具有兩個不同分子量的線型聚 (HEMA-共-SStNa)(實施例10和11)在pH 1.2和6.8下與麥醇溶蛋白 和白蛋白的結(jié)合鐠。
具體實施例方式
材料
a-麥醇溶蛋白由lnstitut National de la Recherche Agronomique， (Nantes, France)惠供。其如Popineau等人所i^4M^小麥(soft wheat) 中純化而得(16-21)。簡而言之，在將來自M (從面粉中分離)的粗麥 醇溶蛋白提取后，將麥醇溶蛋白亞族分離并依次通過離子交換色譜、尺寸 排阻色譜和最后的疏水性相互作用色鐠進行純化。
牛白蛋白購自Serological Proteins(Kankakee, IL)。 a-酪蛋白(來自牛 奶)、SStNa、 HEMA、 SPMAK、 R-D-葡萄糖、a-環(huán)糊精7JC合物、蔗糖(98%)， 聚(乙二醇)(PEG) (Mn 2000)、 2-溴代異丁酰溴、溴化銅Cu(I)Br和2，2，聯(lián) 吡咬均購自Sigma-Aldrich (St Louis, MO)并原樣使用。Eppendorff管、吸 液頭和96孑L^L( Maximum Recovery )由Axygen Scientific (Union City, CA) 提供。
引發(fā)劑的合成
由PEG、 R-D-葡萄糖、蔗糖和(x-環(huán)糊精制備原子轉(zhuǎn)移自由基聚合 (ATRP)引發(fā)劑(圖1)。最后三個分子的溴官能化通過由 Stenzel-Rosenbaum及合作者們所描述的方法而實現(xiàn)(22 )。
通過以下非限定性實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
實施例1
PEG 二溴代大分子引發(fā)劑(i)的合成 將HO醒PEG-OH (Mn 2000,10 g， 5 mmol)和三乙胺(10 g， 0.1 mol)在
70 ml無水甲苯中的溶液在水水浴中稍微冷卻。然后，向所述Jl應混合物 中緩慢加入2-溴代異丁酰溴(4.91 mL， 0.04 mol )。將溶液溫熱至室溫并攪 拌48小時。過濾混合物，蒸發(fā)一半的溶劑并在冷乙醚中沉淀PEG大分子 引發(fā)劑(圖1 (i))。
沉淀后的產(chǎn)率卯％。白色固體。ifl[ NMR (5， ppm， CDC13): 3.50 (188H)， 1.80 (12H,s)。
實施例2
1,2,3，4,6-五-0-異丁酰溴-R-D-葡萄糖(ii)的合成
將2-溴代異丁酰溴(50 g, 0.22 mol)緩慢加入到在氯仿(100 mL )和 吡咬(50 mL )的無水混合物中的R-D-葡萄糖溶液(5.0 g, 0.028 mol)中。 將溶液回流3小時并同時保持無水氣氛，然后于室溫下再攪拌12個小時。 然后將其依次以冰冷的水、NaOH (0.1 M)和水清洗，并以無水MgS04 干燥。將粗產(chǎn)物從曱醇中重結(jié)晶而得到白色晶體(圖1 (ii))。
產(chǎn)率70o/o。
1H NMR (CDCI3): 1.85-2.04 (m, 30H, H-7), 6.42 (d,1H, H-
U 5.25 (dd,1H， H-2), 5.69 (t, 1H, H-3), 5.35 (t, 1H， H~4)， 4.38 (m. 3H, H-5/6).
實施例3
十八-O-異丁酰溴-R-環(huán)糊精(iii)的合成
通過向R-環(huán)糊精(5.0 g, 0.005 mol)在無水吡咬(150 mL)中的溶液 中緩慢加入2-溴代異丁酰溴(50 g, 0.22 mol)而合成十zVO-異丁酰溴-R-環(huán)糊精。在無水氣氛下于室溫下攪拌溶液24小時。然后將其分別以水冷的 水、NaOH (0.1 M)和水清洗，然后以無水MgS04干燥。將粗產(chǎn)物從甲醇 /H20 (3:1,v/v)中重結(jié)晶而得到白色晶體(圖1 (iii))。
產(chǎn)率55%。1H NMR (CDCI3>: 1.95 (m, 108H, H-7), 5,84 (d， 12H， H-
1), 4.46 (dd, 6H， H-2>, 5.7 (m， 6H, H-3)， 5.13/5.38 (t/dd, 6H, H~4). 4.78 (dd, 6H, H-5), 4.45 (m, 6H， H-6).
實施例4
八-O-異丁酰溴-蔗糖(iv)的合成
通過向蔗糖(5.0 g， 0.014 mol)在無水吡咬(150 mL )中的溶液中緩 慢加入2-溴代異丁酰溴(50 g, 0.22 mol)而合成八-O-異丁酰溴蔗糖。在無
水氣氛下于室溫下攪拌溶液24小時。然后將其分別以水冷的水、NaOH (0.1 M)和水清洗，然后以無水MgS04干燥。將粗產(chǎn)物從甲醇/1120 (3:l,v/v) 中重結(jié)晶而得到白色晶體(圖1 (vi))。
產(chǎn)率.50o/o。 1H NMR (CDCls): 1.99 (m, 48H， H-7)， 4,15 (d, 1H, H-5')，
4.46 (m, 5H, H-67175)' 4.68 <dt, 2H， H-6)， 4.81 (d, 1H, H-3')， 5.13 (dd， 1H， H-2), 5.38 (t, 1H, H4')， 5.67 (t， 1H, H~4), 5.76 (t,1H, H-3)， 5.85 (d, 1H, H-1).
實施例5
線型甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA) /4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物(SStNA)
共聚物(純化后93.5/6.5摩爾％ )的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg )、 SStNa (0.375 g)和HEMA (7.12 g)溶于46 mL甲醇/水(1/4)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在 攪拌下于20'C下加入Bpy (20.28 mg) 、 Cu(I)Br (7.2 mg)和Cu(II)Br2 (3.35 mg)。 24小時后，將溶液暴露于空氣中，深褐色溶液變成藍色，這 表明Cu(I)被氧化成了 Cu(II)。通過將甲醇/水溶液通過皿柱(除去Cu(II) 催化劑)而純化所述聚合物。將聚合物逆水透析(Spectra/PorTMno.l，截留 分子量6000-8000, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) 48小 時，然后凍干直至4吏用。Mw = 318700 g/mol; Mw/Mn = 2.54。
實施例6
線型甲基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物
共聚物(純化后卯.3/9.7摩爾％ )的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg )、 SStNa (0.375 g)和HEMA (7.12 g)溶于46 mL曱醇/水(1/4 )混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在 攪拌下于20。C下加入Bpy (21.84 mg) 、 Cu(I)Br (7.2 mg)和Cu(II)Br2 U.48mg)。 24小時后，將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方 法純化聚合物。Mw = 331528, Mw/Mn = 2.9。
實施例7
線型甲基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽7K合物 共聚物(純化后87.8/12.2摩爾％)的合成 將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg )、 SStNa (0.75 g)和HEMA ( 6.747g)
溶于46 mL甲醇/水(1/4 )混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌 下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和Cu(I)Br (7.2 mg)。 24小時后，將溶 液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw = 283600 g/mol; Mw/Mn = 2.57。
實施例8
線型曱基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物
共聚物(純化后82.4/17.6摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg )、 SStNa (1.125 g)和HEMA ( 6.426 g)溶于46 mL甲醇/水(1/4)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在 攪拌下于20。C下加入Bpy (15.6mg)和Cu(I)Cl (5mg)。 24小時后，將 溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw = 275500 g/mol; Mw/Mn = 2.5。
實施例9
線型甲基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物
共聚物(純化后69/31摩爾％ )的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg )、 SStNa (1.5 g)和HEMA ( 5.99 g) 溶于46 mL曱醇/水(1/4 )混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌 下于20。C下加入Bpy (15.6mg)和Cu(I)Cl (5mg)。 24小時后，將溶液 暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。MW = NA; Mw/Mn =NA。 Mn "MR) = 58100 g/mol。
實施例10
線型甲基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物
共聚物(純化后51.5/48.5摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg )、 SStNa (3.2 g)和HEMA (3.95 g) 溶于46 mL甲醇/水(1/4)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌 下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和Cu(I)Br (7.2 mg )。 24小時后，將溶 液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw = 122000 g/mol; Mw/Mn = 2.23。
實施例11
線型甲基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽7JC合物
共聚物(純化后43/57摩爾％ )的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg )、 SStNa (2.4 g)和HEMA (1 g) 溶于23 mL甲醇/水(1/4 )混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌 下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和Cu(I)Br (7.2 mg)。 24小時后，將溶 液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mn (nmr)= 55000 g/mol。
實施例12
線型甲基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物
共聚物(純化后28/72摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg )、 SStNa (4.8 g)和HEMA (1.975 g)溶于46 mL甲醇/水(1/4)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在 攪拌下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和Cu(I)Br (7.2 mg )。 24小時后， 將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw = 65200 g/mol;Mw/Mn = 1.95。
實施例13
線型聚(4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50 mg)和SStNa ( 6.4 g)溶于46 mL水中 并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌下于20。C下加入Bpy (15.6 mg)和 Cu(I)Br (7.2 mg )。 24小時后，將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘 述的方法純化tl^合物。Mw = NA ; Mw/Mn = NA。 Mn (nmr) = 20000 g/mol。
實施例14
線型聚(4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (50.3 mg)和SStNa (1.56 g)溶于20 mL 水中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌下于20。C下加入Bpy (15.6 mg) 和Cu(I)Br ( 7.2 mg )。 24小時后，將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中 敘述的方法純化聚合物。Mw = NA ; Mw/Mn = NA。 Mn (nmr) = 57500 g/mol。
實施例15
5臂星形曱基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽7jC合物
共聚物(純化后69/31摩爾％ )的合成
將ATRP引發(fā)劑ii(圖1)(142.6 mg )、 SStNa( 1.55 g )和HEMA( 4.616 g)溶于30 mL曱醇/水(8/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在 攪拌下于20。C下加入Bpy (230.75 mg)和Cu(I)Br (106 mg )。反應1小 時后，加入IO mL水，然后將溶液在室溫保持24小時。最后按實施例5 中敘述的方法純化相應的共聚物。Mw = 85000 g/mol; Mw/Mn = 1.79。
實施例16
8臂星形甲基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽7jC合物
共聚物(純化后75/25摩爾％ )的合成
將ATRP引發(fā)劑iv (圖1) (141 mg )、 SStNa (1.5 g)和HEMA (4.616 g)溶于30 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在 攪拌下于20。C下加入Bpy (230.8 mg)和Cu(I)Br (106 mg )。反應1小時 后，加入10mL水，然后將溶液在室溫保持24小時。最后按實施例5中 敘述的方法純化相應的共聚物。Mw = 210000 g/mol; Mw/Mn = 2.03。
實施例17
18臂星形甲基丙烯酸羥乙酯/4-苯乙烯磺酸鈉鹽7jC合物
共聚物(純化后69/31摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑iii (圖1) (153.5 mg )、 SStNa (1.5 g)和HEMA (4.62 g)溶于30 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在 攪拌下于20。C下加入Bpy (230.75 mg)和Cu(I)Br (106 mg )。反應1小 時后，加入IO mL水，然后將溶液在室溫保持24小時。最后按實施例5 中敘述的方法純化相應的共聚物。Mw = 206000 g/mol; Mw/Mn = 2.6。
實施例18
線型甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA) /甲基丙烯酸磺酸丙酯鉀鹽(SPMAK)
共聚物(純化后86/14摩爾％ )的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (100.3 mg )、 SPMAK (1.85 g)和HEMA (5.62 g)溶于30 mL甲醇中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌下于20'C 下加入Bpy (31.96 mg)和Cu(I)Br (15.1 mg)。 24小時后，將溶^J^露 于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。MW = NA;MW/Mn = NA。 Mn (N證)=66500 g/mol。
實施例19
線型甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA) /甲基丙烯酸磺酸丙酯鉀鹽(SPMAK)
共聚物(純化后83/17摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (102.1 mg )、 SPMAK (1.90 g)和HEMA (5.62 g )溶于30 mL曱醇中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌下于20'C 下加入Bpy (31.24 mg)和Cu(I)Br (14.34 mg)。 24小時后，將溶液暴露 于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw = NA ; Mw/Mn = NA。 Mn(NMR)= 84000 g/mol。
實施例20
線型甲基丙烯酸羥乙酯/甲基丙烯酸磺酸丙酯鉀鹽
共聚物(純化后74/26摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (100.5 mg )、 SPMAK (3.75 g)和HEMA (5.622 g)溶于46 mL甲醇/水(1/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。 然后在攪拌下于20。C下加入Bpy (32 mg)和Cu(I)Br (15.1 mg)。 24小 時后，將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw =NA ; Mw/Mn = NA。 Mn ,) = ll卯OO g/mol。
實施例21
線型甲基丙烯酸羥乙酯/曱基丙烯酸磺酸丙酯鉀鹽
共聚物(純化后45/55摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (100.7 mg )、 SPMAK (5.64 g)和HEMA (1.752 g)溶于46 mL甲醇/水(1/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。 然后在攪拌下于20。C下加入Bpy (32 mg)和Cu(I)Br (15.1 mg)。 24小 時后，將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw =NA ; Mw/Mn = NA。 Mn ,r) = 108500 g/mol。
實施例22
線型聚(甲基丙烯酸磺酸丙酯鉀)的合成
將ATRP引發(fā)劑i (圖1) (100.7 mg)和SPMAK (7.5 g)溶于46 mL 甲醇/水(1/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在攪拌下于20'C下 加入Bpy (32 mg )和Cu(I)Br (15.1 mg )。 24小時后，將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw = NA ; Mw/Mn = NA。 Mn(NMR)= 120000 g/mol。
實施例23
5臂星形曱基丙烯酸羥乙酯/甲基丙烯酸磺酸丙酯鉀
共聚物(純化后82.4/17.6摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑ii(圖1)(143 mg )、 SPMAK( 1.87 g )和HEMA( 4.61 g)溶于60 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然后在 攪拌下于20。C下加入Bpy (230.6 mg)和Cu(I)Br (108 mg )。 24小時后， 將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw = 161000 g/mol; Mw/Mn = 2.4。
實施例24
8臂星形甲基丙烯酸羥乙酯/曱基丙烯酸磺酸丙酯鉀
共聚物(純化后81/19摩爾％ )的合成
將ATRP引發(fā)劑iv (圖1) (70.5 mg )、 SPMAK (0.935 g)和HEMA (2.3 g)溶于60 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。然 后在攪拌下于20'C下加入Bpy (115.8 mg)和Cu(I)Br (53.9 mg )。 24小 時后，將溶液暴露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。Mw =227000 g/mol; Mw/Mn = 2.27。
實施例25
18臂星形曱基丙烯酸羥乙酯/曱基丙烯酸磺酸丙酯鉀
共聚物(純化后82.4/17.6摩爾％)的合成
將ATRP引發(fā)劑iii (圖1) (75.3 mg )、 SPMAK (0.923 g)和HEMA (2.31 g)溶于60 mL甲醇/水(8/1)混合物中并在氬氣下脫氣15分鐘。 然后在攪拌下于20。C下加入Bpy (115.8 mg)和Cu(I)Br (53.9 mg)。 24 小時后，將溶^L&露于空氣中，并按實施例5中敘述的方法純化聚合物。 Mw = 342000 g/mol; Mw/Mn = 2.28。
實施例26
聚合物-麥醇溶蛋白結(jié)合的評價
通過十二烷^i^酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )，使用15 %(W/V)分離凝膠評價麥醇溶蛋白與合成聚合物的結(jié)合選擇性和親和力。此
外，還對聚合物對對照蛋白(即牛白蛋白和/或牛S^白)的反應性分別進 行了篩選。在pH 1.2和6.8時分別使用鹽酸和磷酸鹽緩沖液進行結(jié)合研究。 在pH 1.2和6.8時將聚合物(80 mg/L)和蛋白質(zhì)(40 mg/L )混合在一起 并孵育2小時。然后將溶液在15000 g下離心30分鐘以從溶液中殘留的游 離蛋白中分離出不溶性#物。然后通過SDS-PAGE分析上清液以測定游 離蛋白質(zhì)的量。
實施例27
聚(HEMA-共-SStNa)與麥醇溶蛋白結(jié)合的選擇性
如實施例26中所述，通過SDS-PAGE評價麥醇溶蛋白與不同線型聚 (HEMA-共-SStNa)(在實施例5~10和12-14中報道了合成)的結(jié)合親和 力，并與在腸pH (6.8)和胃pH (1.2)下白蛋白和酪蛋白的結(jié)合親和力 進行比較(圖3顯示了實施例5 10和12-13 )。 一般來說，在兩個pH值 下，相比于對照蛋白，聚合物都表現(xiàn)出了對麥醇溶蛋白更大的親和力。還 必須指出，由于絲白在酸性糾下的不溶性，因此未在pHl,2下研究與 S^白的^^。如圖3所示，可通過共聚物組成調(diào)節(jié)與麥醇溶蛋白的^。 圖2還顯示了當使共聚物與兩種蛋白一起孵育時，在SDS-PAGE上麥醇溶 蛋白和線型聚(HEMA-共-SStNa)之間的選擇性結(jié)合(實施例10),而白蛋 白仍然游離于溶液中。如實施例26所述，通過SDS-PAGE評價麥醇溶蛋 白對實施例14的線型聚(HEMA-共-SStNa)聚合物的結(jié)合親和力并與白蛋 白的親和力進行比較。結(jié)果如下在pH1.2和6.8下與白蛋白的^分別 為78.8 %和11.23 。/。；在pH 1.2和6.8下與麥醇溶蛋白的#分別為100 % 和71.3 %。
實施例28
聚(HEMA-共-SPMAK)組合物與麥醇溶蛋白結(jié)合的選擇性
如實施例26所述，通過SDS-PAGE評價麥醇溶蛋白與不同線型聚 (HEMA-共-SPMAK)(在實施例18-22中報道了合成)的結(jié)合親和力并與 在腸pH (6.8)和胃pH (1.2)下白蛋白的親和力進行了比較(圖4)。當 將SStNa單體以SPMAK替代(特別是在pH 6.8下)時，觀察到與麥醇 溶蛋白的更少結(jié)合(圖4)。對于50~100摩爾％比例的SPMAK,得到與 麥醇溶蛋白的最佳^。
實施例29
共聚物結(jié)構(gòu)對與麥醇遂:蛋白結(jié)合的影響
分別使用源自葡萄糖、蔗糖和環(huán)糊精的引發(fā)劑合成5臂、8臂和18臂 的星形聚(HEMA-共-SStNa)(實施例15~17)和聚(HEMA-共-SPMAK)(實 施例23~25 )。將其結(jié)合麥醇溶蛋白的能力與其線型對應部分(分別為實施 例9和18 )進行比較。結(jié)果示于圖5和圖6。對于約30摩爾％的SStNa 固定百分比而言，8臂星形聚(HEMA-共-SStNa)的結(jié)合效率好于線型共聚 物或其它星形共聚物(圖5)。在17摩爾％的SPMAK固定比例下，沒有 觀察到在麥醇溶蛋白與線型或星形聚(HEMA-共-SPMAK)的結(jié)合上有顯 著差別(圖6 )。
結(jié)論
HEMA和SStNa或SPMAK的線型或星形無規(guī)共聚物表明在模擬胃腸 道的pH ^下結(jié)合a-麥醇溶蛋白。
實施例30
共聚物分子量對與麥醇溶蛋白結(jié)合的影響
在pH 1.2和6.8下，均測試了^^有約50% SStNa的兩個不同重量的聚 (HEMA-共-SStNa)(實施例10和11)與麥醇溶蛋白和白蛋白的結(jié)合。在 本實驗中，對每種蛋白分別測試。結(jié)果示于圖9。發(fā)現(xiàn)與麥醇溶蛋白的結(jié) 合和結(jié)合的選擇性受到所述聚合物分子量的影響。
實施例31
共聚物對麥醇溶蛋白的誇艮降解的預防
麥醇溶蛋白的胃蛋白酶-胰蛋白酶消化物的制備
采用均粘附于瓊脂糖上的胃蛋白酶(Sigma P0609; St Louis， Missouri, USA)和胰蛋白酶(Sigma T1763 )，以及來自牛胰臟的a-胰凝乳蛋白酶 (Sigma C4129 )進行a-麥醇溶蛋白的逐步Sl^水解。將a-麥醇溶蛋白(10 mg )溶于5 mLpH=1.2的鹽酸緩沖液(10 mM)中并加入胃蛋白酶(38 U )。 在37。C磁力攪拌混合物2小時，這時以0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8， 并加入胰蛋白酶(0.75 U)和a-胰凝乳蛋白酶(0.5 U )。在20。C和6000 g 下將消化物離心30分鐘。然后在上清液中收集麥醇溶蛋白肽并通過0.2 jim 的GHP過濾器過濾。
采用配有1525 二元泵、2487雙波長吸收檢測器和Breeze Chromatography SoftwareTM (Waters, Midford, MA)的WatersTM高效液 相色鐠HPLC系統(tǒng)，分析所得的麥醇溶蛋白的胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳 蛋白酶消化物。在36。C下以1 mL/分鐘的流速、215 nm的檢測波長和50 jil 的進樣量洗脫樣品。三氟乙酸用作離子配對劑，以經(jīng)60分鐘從100%緩沖 液A至100。/。緩沖液B的線性梯度進行洗脫。緩沖液A由0.1%三氟乙酸、 95%水和5%乙腈組成，緩沖液B由0.1%三氟乙酸、5%7^和95%乙腈組 成。將每個樣品上清液的一部分在水中稀釋并在ds反相柱(Waters Nova-packTM C18, 60 A， 4 jim, 3.9x300 mm)上分析。
麥醇溶蛋白-聚合物絡合物的膝化降解
將聚(HEMA-共-SStNa)(實施例10 ) (4 g/L)和麥醇溶蛋白(2 g/L) 在pH2下混合在一起并孵育2小時。然后，按以上所述進行麥醇溶蛋白-聚合物絡合物的逐步i^降解。按以上所述，使用HPLC分析聚合物結(jié)合 劑對麥醇溶蛋白降解的作用(圖7)。
當所述麥醇溶蛋白與所述聚合物^時，檢測到明顯較少的降解產(chǎn)物 (圖7)。
實施例32
聚合物對Caco-2單層完整性的作用
評價聚(HEMA-共-SStNa)(實施例10 )對Caco-2細胞單層完整性的 作用并將其與PEG (35kDa)和PVP (58kDa)進行比較(圖8 )。
以2.5 x 105細胞/cm2的播種密度在12孔Transwelf聚碳酸酯過濾器 (Corning, Acton，MA)上播種細胞。在添加了 10% (v/v)胎牛血清、非必 需^J^酸溶液(0.1 mM )、 pH 7.4的Hepes緩沖劑(10 mM)和青霉素-鏈霉素(相當于100 U/mL和100 ng/mL)的Dulbecco，s改良的必需培養(yǎng) 基(DMEM)中培養(yǎng)Caco-2。每72小時更新培養(yǎng)基一次。將細胞在37。C、 5% C02下培養(yǎng)21-28天以在實驗前形成分化的單層。在完全DMEM培養(yǎng) 基中進行毒性研究。采用MillicellTM Electrical Resistance System( Millipore Corp. Bedford, MA), 4吏用單電極(World Precision Instruments, Sarasota, FL)在預定的時間點讀和夸上皮細胞電阻(TEER)的讀數(shù)。
在聚(HEMA-共-SStNa)和對照聚合物(PVP、 PEG)中，24小時后 測定的TEER均顯示了初始值10。/。的減小(圖8 X這些結(jié)果表明聚(HEMA-
共-SStNa)似乎并不強烈地干擾Caco-2細胞單層的完整性。
實施例33
聚合物結(jié)合劑對降低麥醇溶蛋白和麥醇溶蛋白降解產(chǎn)物
的毒性的作用的體內(nèi)測試
通過測量已對谷蛋白或其降解產(chǎn)物敏感的動物的免疫應答而體內(nèi)評 價所述聚合物降低谷蛋白毒性的能力。在存在或不存在聚合物結(jié)合劑的情 況下，在表達HLA-DQ8的轉(zhuǎn)基因小鼠(24) 口月艮谷蛋白或其降解產(chǎn)物后， 在該小鼠中測量免疫應答。
實施例34
向食物中加入聚合物結(jié)合劑
可將聚合物結(jié)合劑加入到受乳糜瀉影響的個體所用的含有谷蛋白的 食物中。然后當食物被吞下時，在這些食物中的聚合物結(jié)合劑可對抗食物 中所含谷蛋白的有害效應。不受此限制，這樣的食物包括煮熟的盤菜、谷 物、焙烤品比如面包、糕點、餅、蛋糕、松餅、餅干等?？梢韵蜻@些食物 中以0.01 %~10% (w/w)的濃度加入所述聚合物結(jié)合劑。還可將所述聚合物 結(jié)合劑加入到不含谷蛋白的食物中以在含有含谷蛋白食物的膳食中消費。 不受此限制，這些不含谷蛋白的食物包括涂抹食物比如乳酪、果醬、黃油 或可在含谷蛋白食物上或與含谷蛋白食物一起食用的任何食物。
雖然以上已經(jīng)通過具體實施方案的方式對本發(fā)明進行了描述，但可 以在不背離如所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和實質(zhì)的情況下對其 進行修改。
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權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含聚合物結(jié)合劑和藥學可接受載體，所述聚合物結(jié)合劑包含具有由不可水解的共價鍵構(gòu)成的主鏈的高分子量合成聚合物，所述聚合物能在pH低于谷蛋白和源自谷蛋白降解的肽的等電點時形成靜電鍵，并且能在胃腸道中與谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽結(jié)合。
2. 權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑能與谷蛋白 或源自谷蛋白降解的肽形成疏水性相互作用。
3. 權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑能形成氫鍵。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑 能在胃腸道中特異性地與谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽結(jié)合。
5. 權(quán)利要求1至4的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑能在腸道 中與谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽結(jié)合。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑 是甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)和4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物(SStNa) 的共聚物。
7. 權(quán)利要求1至5中任一項的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑 是曱基丙烯酸羥乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸磺酸丙酯鉀鹽(SPMAK) 的共聚物。
8. 權(quán)利要求1至5中任一項的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑 是4-苯乙烯磺酸鈉鹽水合物(SStNa)的聚合物。
9. 權(quán)利要求1至5中任一項的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑 是甲基丙烯酸磺酸丙酯鉀鹽(SPMAK)的聚合物。
10. 權(quán)利要求1至9中任一項的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合 劑是線型的。
11. 權(quán)利要求1至9中任一項的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合 劑是星形的。
12. 權(quán)利要求ll的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑是3 18臂 的星形共聚物。
13. 權(quán)利要求ll的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑是5 18臂 的星形共聚物。
14. 權(quán)利要求ll的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑是5臂星形 共聚物。
15. 權(quán)利要求ll的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑是8臂星形 共聚物。
16. 權(quán)利要求ll的藥物組合物，其中所述聚合物結(jié)合劑是18臂星 形共聚物。
17. 權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述HEMA和SStNa的共聚 物的HEMA/SStNa的摩爾百分比之比是約93.5/6.5至約1/99。
18. 權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述HEMA和SStNa的共聚 物是線型的HEMA/SStNa ( 51.5/48.5摩爾％ )。
19. 權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述HEMA和SStNa的共聚 物是線型的HEMA/SStNa ( 43/57摩爾％ )。
20. 權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述HEMA和SPMAK的共 聚物的HEMA/SPMAK摩爾百分比之比是約93.5/6.5至約1/99。
21. 權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述HEMA和SPMAK的共 聚物的HEMA/SPMAK摩爾百分比之比是約86/14至約1/99。
22. 權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述HEMA和SPMAK的共 聚物是線型的HEMA/SPMAK ( 45/55摩爾％ )。
23. 權(quán)利要求1~22中任一項的藥物組合物，其還包含連蛋白拮抗 劑或HLADQ2抑制劑。
24. —種使用權(quán)利要求1 22中任一項的聚合物結(jié)合劑的方法，包 括給患有乳糜瀉的患者施用藥物有效量的所述聚合物結(jié)合劑。
25. 權(quán)利要求24的方法，其用于在所述患者體內(nèi)結(jié)合谷蛋白或源自 谷蛋白降解的肽。
26. 權(quán)利要求24的方法，其用于減少谷蛋白在所述患者體內(nèi)降解成 毒性肽。
27. 權(quán)利要求24的方法，其用于減少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽 與所述患者胃腸道粘膜的相互作用。
28. 權(quán)利要求24 27中任一項的方法，其中所述施用在所述患者進 食含有谷蛋白的膳食之前或期間進行。
29. 權(quán)利要求24 27中任一項的方法，其中所述施用在所述患者進 食含有谷蛋白的膳食之后進行。
30. 權(quán)利要求1~23中任一項的聚合物結(jié)合劑在制備藥物中的用途。
31. 權(quán)利要求1~22中任一項的聚合物結(jié)合劑用于在有此需要的患 者的胃腸道內(nèi)結(jié)合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽的用途。
32. 權(quán)利要求1~22中任一項的聚合物結(jié)合劑在制備用于在有此需 要的患者的胃腸道內(nèi)結(jié)合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽的藥物中的用 途。
33. 權(quán)利要求1~22中任一項的聚合物結(jié)合劑用于減少谷蛋白或源 自谷蛋白降解的肽與有此需要的患者的胃腸粘膜相互作用的用途。
34. 權(quán)利要求1~22中任一項的聚合物結(jié)合劑在制備用于減少谷蛋 白或源自谷蛋白降解的肽與有此需要的患者的胃腸粘膜相互作用的藥 物中的用途。
35. 權(quán)利要求1 22中任一項的聚合物結(jié)合劑用于減少谷蛋白在有 此需要的患者的胃腸道內(nèi)降解成毒性肽的用途。
36. 權(quán)利要求1~22中任一項的聚合物結(jié)合劑在制備用于減少谷蛋 白在有此需要的患者的胃腸道內(nèi)降解成毒性肽的藥物中的用途。
37. 權(quán)利要求31~36中任一項的用途，其中所述患者患有乳糜瀉。
38. —種食物，其含有權(quán)利要求1 22中任一項的聚合物結(jié)合劑。
39. 權(quán)利要求38的食物，其中所述食物是含有谷蛋白的食物。
40. 權(quán)利要求39的食物，其中所述食物是面包。
41. 一種使用權(quán)利要求38-40中任一項的食物的方法，包括給患有 乳糜瀉的患者在所述患者進食期間施用所述食物。
42. 權(quán)利要求41的方法，用于結(jié)合所述患者的膳食中所含有的谷蛋 白或源自谷蛋白降解的肽。
43. 權(quán)利要求41的方法，用于減少所述患者的膳食中所含有的谷蛋 白降解成毒性肽。
44. 權(quán)利要求41的方法，用于減少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽與所述患者的胃腸粘膜的相互作用。
45. —種制備供患有乳糜瀉的患者使用的食物的方法，包括向所述 食物中加入權(quán)利要求1~22中任一項的聚合物結(jié)合劑。
46. 權(quán)利要求41的方法，其中所述食物是含有谷蛋白的食物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含聚合物結(jié)合劑和藥學可接受載體的藥物組合物，所述聚合物結(jié)合劑包含具有由不可水解的共價鍵構(gòu)成的主鏈的高分子量合成聚合物，所述聚合物能在pH低于谷蛋白和源自谷蛋白降解的肽的等電點時形成靜電鍵，并且能在胃腸道中與谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽結(jié)合。本發(fā)明還涉及使用所述聚合物結(jié)合劑用于結(jié)合谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽、用于減少谷蛋白降解成毒性肽或用于減少谷蛋白或源自谷蛋白降解的肽與胃腸道粘膜的相互作用的方法。
文檔編號A61K31/74GK101360505SQ200680050656
公開日2009年2月4日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日
發(fā)明者穆罕默德·納塞爾·埃丁, 讓-克里斯托弗·勒魯 申請人:瓦洛里塞森-勒謝什有限合伙公司