專利名稱：針對erb－b1受體的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含不同分子，優(yōu)選單克隆抗體，所述分子各包含可以同時與相同ErbB受體結(jié)構(gòu)域，特別是ErbB1受體結(jié)構(gòu)域中不同表位結(jié)合的位點。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的抗體是各自為鼠、嵌合或人源化形式的MAb 425和MAb 225。本發(fā)明涉及所述組合物在改善治療，優(yōu)選腫瘤治療中的用途和方法。
背景技術(shù)：
在超過20年的時間里，已知針對腫瘤細(xì)胞表面上的多種受體和其它抗原的生物分子，諸如單克隆抗體(MAb)或其它蛋白質(zhì)/多肽，以及小化學(xué)化合物適用于腫瘤治療。關(guān)于抗體方法，這些MAb大多數(shù)是被嵌合化的或人源化的以改善人類免疫系統(tǒng)的耐受性。MAb或上述化學(xué)體與其在腫瘤細(xì)胞上和大多數(shù)情況下也存在于正常組織上的靶結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，并可導(dǎo)致依賴于其表位特異性和/或特定抗原的功能特性的不同效應(yīng)。針對孤兒受體(orphan receptor)或其它無功能的細(xì)胞表面分子的MAb以及針對功能活性受體(例如具有激酶活性的生長因子受體)的配體-結(jié)合位點外部結(jié)構(gòu)的MAb被預(yù)期可誘導(dǎo)主要針對靶細(xì)胞的免疫效應(yīng)子作用(抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，補體依賴細(xì)胞毒性(CDC))。此外，根據(jù)抗原和Mab的特性，抗體的結(jié)合可導(dǎo)致受體的交聯(lián)。由此引起的受體-抗體復(fù)合物內(nèi)在化可導(dǎo)致細(xì)胞表面上受體密度的長時期下調(diào)。
與配體-結(jié)合位點內(nèi)的或其直接鄰域中的表位結(jié)合的MAb或小化學(xué)化合物競爭天然配體與其受體的結(jié)合，由此降低或完全抑制配體結(jié)合，并可置換已與其受體結(jié)合的配體。該受體的阻斷抑制了配體依賴性受體活化和下游信號傳導(dǎo)。例如，ErbB受體，諸如表皮生長因子受體(EGFR)被單克隆抗體阻斷會導(dǎo)致多種細(xì)胞效應(yīng)，包括抑制DNA合成和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡以及抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成作用。
在二十世紀(jì)八十年代，ErbB受體是癌癥所涉及的典型受體酪氨酸激酶。酪氨酸激酶是一類酶，其催化腺苷三磷酸的末端磷酸向蛋白質(zhì)底物中的酪氨酸殘基轉(zhuǎn)移。據(jù)信酪氨酸激酶通過底物磷酸化在許多細(xì)胞功能的信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。雖然信號傳導(dǎo)的確切機(jī)理仍不清楚，但是酪氨酸激酶在細(xì)胞增殖，癌發(fā)生和細(xì)胞分化中顯示出是重要的起作用因子。
酪氨酸激酶可分為受體型和非受體型。受體型和非受體型兩種酪氨酸激酶都參與細(xì)胞信號途徑，這些途徑可導(dǎo)致許多病理狀況，包括癌癥，牛皮癬和超免疫反應(yīng)。許多酪氨酸激酶參與細(xì)胞生長及血管生成。
非受體型酪氨酸激酶也由許多亞家族組成，包括Src，F(xiàn)rk，Btk，Csk，Abl，Zap70，F(xiàn)es/Fps，F(xiàn)ak，Jak，Ack和LIMK。這些亞家族的每一個還可再分成不同的受體。例如，Src亞家族是最大的亞家族之一，其包括Src，Yes，F(xiàn)yn，Lyn，Lck，Blk，Hck，F(xiàn)gr和Yrk。Src亞家族中的酶與腫瘤形成有關(guān)。對非受體型酪氨酸激酶的更詳細(xì)的討論，參見BolenOncogene，82025-2031(1993)。
受體型酪氨酸激酶具有細(xì)胞外，跨膜和細(xì)胞內(nèi)部分，而非受體型酪氨酸激酶完全是細(xì)胞內(nèi)的。受體連接的酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其包含細(xì)胞外配體結(jié)合域，跨膜序列，以及胞質(zhì)酪氨酸激酶域。受體型酪氨酸激酶由大量具有不同生物活性的跨膜受體組成。
已經(jīng)鑒定出了不同亞家族的受體型酪氨酸激酶。涉及的酪氨酸激酶包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體，ErbB主要家族類型中的表皮生長因子(EGF)受體和血小板衍生生長因子(PDGF)受體。還涉及神經(jīng)生長因子(NGF)受體，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)受體，以及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)受體和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4(NT-4)受體。
一個受體型酪氨酸激酶亞家族，被命名為HER或ErbB亞家族，由EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2或p185neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)組成。此受體亞家族的配體包括表皮生長因子(EGF)，TGF-a，雙調(diào)蛋白(amphiregulin)，HB-EGF，β-細(xì)胞調(diào)節(jié)素(betacellulin)、heregulin及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白。PDGF亞家族包括由激酶插入域受體(KDR)組成的FLK家族。
EGFR，由ErbB1基因編碼，其與人類惡性腫瘤因果相關(guān)。特別是，在乳腺，膀胱，肺，頭，頸和胃部癌癥以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中已經(jīng)觀察到EGFR的表達(dá)增強(qiáng)。EGFR受體表達(dá)的增強(qiáng)常常伴隨有同一腫瘤細(xì)胞中EGFR配體，即轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)的產(chǎn)生增加，從而經(jīng)自分泌刺激途徑引起受體激活(Baselga and Mendelsohn，Pharmac.Ther.64127-154(1994))。
EGF是一種分子量為170,000的跨膜糖蛋白，并發(fā)現(xiàn)其存在于許多上皮細(xì)胞類型上。其可以被至少三種配體--EGF，TGF-α(轉(zhuǎn)化生長因子α)和雙調(diào)蛋白激活。經(jīng)證明表皮生長因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)都能與EGF受體結(jié)合進(jìn)而引起細(xì)胞增殖和腫瘤生長。這些生長因子不能與HER2結(jié)合(Ulrich and Schlesinger，1990，Cell 61，203)。與借助自身二聚化性質(zhì)誘導(dǎo)受體二聚化的幾個生長因子家族(如PDGF)不同，單體生長因子如EGF具有2個受體結(jié)合位點，因此，其原則上可以交聯(lián)兩個鄰近的EGF受體(Lemmon等，1997，EMBO J.16，281)。
近期研究(J.Schlessinger，2002，Cell 110，669)顯示出受體二聚化由受體-受體相互作用介導(dǎo)，其中從鄰近受體突出的環(huán)介導(dǎo)受體二聚化和活化。
受體二聚化對激活生長因子受體的內(nèi)在催化活性以及對生長因子受體在酪氨酸殘基上的自磷酸化是必需的。后者可作為多種銜接蛋白質(zhì)或酶的停泊位點，這些蛋白質(zhì)或酶可同時啟動許多信號級聯(lián)。在高等真核細(xì)胞中，簡單的線性通路演化為充分交互作用的多層網(wǎng)絡(luò)，其中組分的組合表達(dá)和活化使得可以在發(fā)育的自始至終形成背景特異性的生物反應(yīng)。ErbB網(wǎng)絡(luò)不僅能整合其自身的輸入信號，還能整合異源信號，包括激素，淋巴因子，神經(jīng)遞質(zhì)和應(yīng)激誘導(dǎo)物。
應(yīng)當(dāng)指出的是受體蛋白酪氨酸激酶(PTK)既能進(jìn)行同二聚化，也能進(jìn)行異二聚化，其中同二聚體受體組合的促有絲分裂和轉(zhuǎn)化作用(不啟動或弱啟動信號發(fā)生)低于相應(yīng)的異二聚體組合。包含ErbB2的異二聚體是最有效的復(fù)合物(參見如下綜述Yarden and Sliwkowski，2001，NatureReviews，Molecular cell Biology，volume 2，127-137；Tzahar and Yarden，1998，BBA 1377，M25-M37)。
已經(jīng)證明抗EGF受體的抗體在阻斷EGF和TGF-α與受體結(jié)合的時候，顯示出對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用?？紤]到這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)研制出很多小鼠和大鼠單克隆抗EGF受體抗體，并在體內(nèi)和體外檢測了它們對腫瘤細(xì)胞生長進(jìn)行抑制的能力(Modjtahedi and Dean，1994，J.Oncology 4，277)。人源化單克隆抗體425(hMAb 425，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合型單克隆抗體225(cMAb 225)都是針對EGF受體的，而且在臨床試驗中均顯示有效。已經(jīng)證明C225抗體(Cetuximab)可在體外抑制由EGF介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長，以及在裸鼠體內(nèi)抑制人腫瘤的形成。而且，最重要的是，該抗體以及一般地所有抗EGFR抗體在異種移植小鼠模型中還顯示出可與某些化療劑(即阿霉素(doxorubicin，adriamycin)，紫杉醇和順鉑)協(xié)同作用體內(nèi)根除人腫瘤(見例如，EP0667165)。Ye等(1999，Oncogene 18，731)報道通過聯(lián)合應(yīng)用嵌合MAb225和針對HER2受體的人源化MAb 4D5可以對人卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行成功地治療。
ErbB家族的第二個成員-HER2(ErbB2或p185neu)，其最初被鑒定為來自經(jīng)化學(xué)處理的大鼠的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)化基因產(chǎn)物。neu原癌基因的激活形式由該編碼蛋白的跨膜區(qū)中的點突變(纈氨酸變成谷氨酸)引起?？稍谌橄俸吐殉舶┌Y中觀察到neu人同系物的擴(kuò)增，其與預(yù)后不良有關(guān)(Slamon等，Science，235177-182(1987)；Slamon等，Science，244707-712(1989)；US4,968,603)。ErbB2(HER2)的分子量為大約185,000，雖然至今對HER2的特異性配體尚未明確確定，但ErbB2(HER2)與EGF受體(HER1)有相當(dāng)高的同源性。
進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)針對HER2受體的抗體4D5使過表達(dá)ErbB2的乳腺腫瘤細(xì)胞系對TNFα的細(xì)胞毒性效應(yīng)敏感(US 5,677,171)。鼠抗-ErbB2抗體4D5的人源化重組體(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2或HERCEPTIN；US 5,821,337)在已接受過大量抗癌前期治療的患有ErbB2-過表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者中具有臨床活性(Baselga等，J.Clin.Oncol.14737-744(1996))。HERCEPTIN在1988年被正式批準(zhǔn)上市用于治療患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌(其腫瘤過表達(dá)ErbB2蛋白)的患者。
除抗ErbB抗體外，還已知多種小化學(xué)分子為ErbB受體分子的有效抑制劑，其能阻斷天然配體的結(jié)合位點(參見詳細(xì)的描述)，或阻斷受體激酶的結(jié)合位點的酪氨酸殘基，由此阻止磷酸化和進(jìn)一步的級聯(lián)信號傳導(dǎo)。
在臨床試驗中顯示出高效能的一個代表物是IressaTM(ZD-1839)，其可以被用于NSCLC適應(yīng)癥(非小細(xì)胞肺癌)。
雖然已有一些處于開發(fā)中和已經(jīng)上市用于治療腫瘤的有希望的藥物和方法，但仍需要具有改進(jìn)的特性和增高的功效的其它藥劑和藥物組合物和組合。
發(fā)明概述本發(fā)明基于本發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)某些受體酪氨酸激酶諸如ErbB受體抗體分子，優(yōu)選ErbB1受體(EGFR)抗體分子(其在患病細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞表面上過表達(dá))在天然配體結(jié)合域內(nèi)具有特異性表位位點，不同抗體分子可與這些位點同時結(jié)合，而不會出現(xiàn)或僅存在可忽略的相互阻礙。顯然，這些抗體分子具有在三維構(gòu)型方面與受體分子的結(jié)合域的完整大小相比相對較小的結(jié)合表位。這些抗體分子可誘導(dǎo)對信號通路活性的增加調(diào)節(jié)，優(yōu)選增加對ErbB受體的阻斷，并由此增加對整個信號級聯(lián)的阻斷。本發(fā)明首次描述了該腫瘤治療的新概念，即對個體施用可以阻斷或抑制ErbB受體，優(yōu)選EGF受體(EGFR)(ErbB1)的一種或多種生物學(xué)上和治療上有效的藥劑，通過所述藥劑與至少第一和第二不同表位(優(yōu)選位于相同受體的天然配體域內(nèi))結(jié)合來實施治療?？梢园l(fā)現(xiàn)，例如，兩種或多種，優(yōu)選兩種，不同受體-拮抗性分子可同時與相同受體結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選相同受體分子的)結(jié)合，而不會出現(xiàn)相互阻礙或競爭，由此使得較高密度的拮抗劑可與受體結(jié)合并導(dǎo)致(通過降低的與天然(激動性)配體諸如EGF或TGFa結(jié)合的能力)對單體或二聚體單位形式的相應(yīng)受體分子的信號級聯(lián)產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制作用。這應(yīng)導(dǎo)致對腫瘤生長更強(qiáng)的抑制和/或?qū)е聦嶓w瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的凋亡增加。所述分子可以是小化學(xué)和合成化合物或蛋白質(zhì)、多肽或肽、免疫球蛋白，諸如抗體或其片段、或免疫綴合物。
優(yōu)選分子是抗-ErbB抗體，尤其是如上面和下面描述的抗-EGFR和抗-Her2抗體，及其片段，優(yōu)選F(ab′)2。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，對個體施用兩種不同的抗EGFR抗體，優(yōu)選人源化、嵌合或鼠型MAb 425或其片段，諸如F(ab′)2，和人源化、嵌合或鼠型MAb 225或其片段，諸如F(ab′)2。最優(yōu)選的是人源化MAb 425和嵌合MAb 225以完整抗體或F(ab′)2片段形式聯(lián)合施用。
但是也可以使用衍生自所述抗體結(jié)構(gòu)的相對短的合成(多)肽，所述肽包含相應(yīng)抗體的一、二或三個CDR的氨基酸序列，其中，任選地，為了增加對受體的親和性和/或親合力，可通過(優(yōu)選)置換對抗原結(jié)合位點內(nèi)或與其緊鄰的某些氨基酸(1-5個氨基酸)進(jìn)行修飾。以與相應(yīng)抗體相當(dāng)?shù)姆绞胶褪荏w結(jié)合的這種合成肽具有制備簡單且較價廉的優(yōu)勢。還可以合成單一肽，其包含源于第一分子以及第二分子的CDR的氨基酸序列，例如包含來源于MAb 425的1-3個CDR和MAb 225的1-3個CDR的氨基酸序列的(多)肽。
已發(fā)現(xiàn)，與僅包含所述結(jié)合位點之一的單一分子相比，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物能夠增強(qiáng)不同或相同ErbB受體的交聯(lián)/二聚化，增強(qiáng)對ErbB受體的阻斷/抑制，增強(qiáng)對ErbB受體-特異性信號通路調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)。換言之例如，MAb 425和MAb 225的混合物與將MAb 425或225作為單獨藥劑以相同濃度進(jìn)行施用相比，前者能引發(fā)增強(qiáng)的對EGFR的抑制和下調(diào)。
雖然上述發(fā)現(xiàn)是僅對將ErbB受體作為靶受體分子而做出的，應(yīng)當(dāng)指出的是由本發(fā)明人所揭示的如上述和下述的科學(xué)原則也適用于ErbB之外的其它生物受體。
任選地，本發(fā)明的組合物還包含可以支持和增強(qiáng)上述分子的功效的其它治療活性化合物。
所述藥劑可以是細(xì)胞毒性劑，優(yōu)選是拮抗性分子，諸如酪氨酸激酶拮抗劑、其它ErbB拮抗劑、生長激素受體拮抗劑、蛋白激酶拮抗劑、抗血管生成劑、或細(xì)胞因子。下面將更詳細(xì)地具體描述可用于本發(fā)明的此類分子。
本發(fā)明所述的治療活性劑也可以以包含如下包裝的藥物試劑盒的形式提供，此包裝中包含置于各單獨容器內(nèi)的或在單一容器內(nèi)的一種或多種所述拮抗劑。利用該聯(lián)合的治療方法可以任選地包括放射性治療。大抵上，此藥物施用可與放射治療伴隨進(jìn)行，其中放射治療可與藥物施用基本上同時或在之前或在之后進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合療法中的不同藥劑的施用也可以基本上同時進(jìn)行或相繼進(jìn)行。細(xì)胞表面上有參與腫瘤血管形成的受體的腫瘤可用本發(fā)明聯(lián)合療法成功地治療。
已知腫瘤的發(fā)育和生長有多條可替換的路線。如果一條路線被阻斷，則它們常能通過表達(dá)和使用其他受體和信號途徑而轉(zhuǎn)換到另一條路線上。因此，由于本發(fā)明的藥物聯(lián)合可以阻斷幾種這樣的可能腫瘤發(fā)育策略，因而具有多種優(yōu)點。本發(fā)明的聯(lián)合可用于治療和預(yù)防那些通過激活存在于腫瘤細(xì)胞表面上的相關(guān)激素受體而發(fā)育和生長的腫瘤、腫瘤樣疾病和瘤形成性疾病以及腫瘤轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明聯(lián)合中的不同藥劑優(yōu)選以低劑量聯(lián)合應(yīng)用，即，低于臨床條件下常規(guī)使用的劑量。在給個體施用本發(fā)明的化合物、組合物、藥劑和治療的時候，降低劑量的優(yōu)點包括降低了高劑量相關(guān)副反應(yīng)的發(fā)生率。例如，通過降低如上文和下文所述藥劑的劑量，與高劑量條件下觀察到的效果相比，惡心和嘔吐的頻率和嚴(yán)重程度都得到降低。預(yù)期降低副反應(yīng)發(fā)生率將能改善癌癥患者的生活質(zhì)量。降低副反應(yīng)發(fā)生率的優(yōu)點還包括改善患者的依順性，降低因治療副反應(yīng)產(chǎn)生的需要住院的次數(shù)，減少在醫(yī)治副反應(yīng)帶來的疼痛時所需止痛劑的使用。另外，本發(fā)明的方法和聯(lián)合還能使較高劑量時的治療效果最大化。
根據(jù)本發(fā)明的組合顯示出令人驚異的協(xié)同作用。臨床研究顯示使用該藥物聯(lián)合可使腫瘤出現(xiàn)真實的縮小和解體，同時沒有檢測到明顯的藥物不良反應(yīng)。
具體地，本發(fā)明涉及.藥物組合物，其包含能夠與ErbB受體分子的結(jié)合域中不同表位結(jié)合的一種或多種生物學(xué)上和/或治療上有效的抗體分子(或其片段)，其中所述一種或多種抗體分子包含至少一個與所述受體結(jié)合域的第一特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點及至少另一個與相同ErbB受體結(jié)合域的第二特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點。
.相應(yīng)的藥物組合物，其包含兩種或多種抗體分子，其中一種抗體分子至少包含與所述受體域的第一特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點，而至少另一種抗體分子至少包含與相同受體結(jié)合域的第二特異性表位結(jié)合的另一結(jié)合位點。
.相應(yīng)的藥物組合物，其中至少一種所述抗體分子與受體的天然配體所結(jié)合的受體結(jié)合域內(nèi)的表位相結(jié)合。
.相應(yīng)的藥物組合物，其與僅包含所述結(jié)合位點之一的單一分子相比，能增強(qiáng)對ErbB受體的阻斷和/或抑制，并增強(qiáng)對ErbB受體-特異性信號通路調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)。
.相應(yīng)的藥物組合物，其能增強(qiáng)對具有相同或不同特異性的不同受體分子的交聯(lián)和/或二聚化的誘導(dǎo)。
.相應(yīng)的藥物組合物，其中所述ErbB受體是EGF受體(EGFR)。
.相應(yīng)的藥物組合物，其包含各自針對EGF受體的不同表位的第一和第二單克隆抗體或其生物活性片段。
.相應(yīng)的藥物組合物，其中第一抗體是鼠的、嵌合的或人源化的MAb425。
.相應(yīng)的藥物組合物，其中第二抗體是鼠的、嵌合的或人源化的MAb225。
.相應(yīng)的藥物組合物，其中所述第一抗體是人源化MAb 425(h425)和所述第二抗體是嵌合MAb 225(c225，Cetuximab)。
.相應(yīng)的藥物組合物，其還包含細(xì)胞毒性藥。
.藥物試劑盒，其包含(i)第一包裝，其至少包含與ErbB受體分子的結(jié)合域中第一特異性表位結(jié)合的第一生物學(xué)活性抗體分子，或其片段，和(ii)第二包裝，其至少包含與相同ErbB受體分子的結(jié)合域中不同的第二特異性表位結(jié)合的第二抗體分子，或其片段。
.相應(yīng)的藥物試劑盒，其中至少一種所述抗體分子與受體的天然配體所結(jié)合的受體結(jié)合域內(nèi)的表位相結(jié)合。
.相應(yīng)的藥物試劑盒，其中所述第一抗體分子是鼠的、嵌合的或人源化的單克隆抗體425或其生物活性片段，而所述第二抗體分子是鼠的、嵌合的或人源化的單克隆抗體225或其生物活性片段。
.相應(yīng)的藥物試劑盒，其包含第一包裝和第二包裝，第一包裝包含人源化MAb 425(h425)，第二包裝包含嵌合MAb 225(c225)。
.相應(yīng)的藥物試劑盒，其還包含第三包裝，該包裝包含能夠增加第一和第二包裝所提供的藥物的功效的其它藥物。
.相應(yīng)的藥物試劑盒，其中所述其它藥物是細(xì)胞毒性藥。
.一種治療患者中腫瘤相關(guān)疾病的方法，包括對所述患者施用治療上有效量的(i)至少第一抗體分子(或其片段)——該分子與ErbB受體分子的結(jié)合域中的第一特異性表位結(jié)合，和(ii)至少第二抗體分子——該分子與相同ErbB受體分子的結(jié)合域中的不同第二特異性表位結(jié)合。
.相應(yīng)的方法，其中至少一種所述抗體分子與受體的天然配體所結(jié)合的受體結(jié)合域內(nèi)的表位相結(jié)合。
.相應(yīng)的方法，其中與所述表位結(jié)合的所述抗體分子阻斷和/或抑制該受體，由此誘導(dǎo)對受體-特異性信號通路的調(diào)節(jié)。
.相應(yīng)的方法，其中所述抗體分子的結(jié)合誘導(dǎo)具有相同或不同特異性的不同受體分子交聯(lián)和/或二聚化。
.相應(yīng)的方法，其中所述第一抗體分子是人源化單克隆抗體425(h425)或其生物活性片段，而所述第二分子是嵌合或單克隆抗體225(c225)或其生物活性片段。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，ErbB受體是EGF受體(EGFR)，而針對該受體上不同表位的抗體是抗EGFR抗體。
因此，本發(fā)明具體涉及.藥物組合物，其包含能夠與位于相同或不同ErbB受體分子類型上的不同表位結(jié)合的第一和第二抗體分子或其部分，其中所述第一抗體分子或其部分包含與ErbB1受體分子類型上的第一特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點，而所述第二抗體分子包含與相同ErbB1受體分子類型上的第二特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點。
.藥物組合物，其中至少ErbB1受體分子類型上的所述第一或所述第二表位位于ErbB1受體結(jié)合域內(nèi)。
.藥物組合物，其中ErbB1受體分子類型上的所述第一和所述第二表位位于ErbB1受體結(jié)合域內(nèi)。
.藥物組合物，其中所述受體結(jié)合域是所述ErbB1受體分子類型的天然配體的結(jié)合域。
.藥物組合物，其中第一和第二抗體或其片段與所述ErbB1受體分子類型的天然配體的結(jié)合域內(nèi)的不同表位結(jié)合。
.藥物組合物，其中與包含僅和所述ErbB1受體分子類型上所述第一或所述第二表位結(jié)合的單一抗體分子的組合物相比，所述藥物組合物增強(qiáng)對ErbB受體的阻斷和/或抑制和對ErbB受體-特異性信號通路下調(diào)的誘導(dǎo)。
.藥物組合物，其中與包含僅和所述ErbB1受體分子類型上所述第一或所述第二表位結(jié)合的單一抗體分子的組合物相比，所述藥物組合物增強(qiáng)對具有相同或不同特異性的ErbB受體分子的交聯(lián)和/或二聚化的誘導(dǎo)。
.藥物組合物，其中所述ErbB受體分子參與交聯(lián)和/或二聚化，且選自ErbB1和ErbB2(Her-2)。
.藥物組合物，其中所述第一和/或所述第二抗體是單特異性抗體。
.藥物組合物，其中第一抗體是鼠的、嵌合的或人源化的MAb 425。
.藥物組合物，其中第二抗體是鼠的、嵌合的或人源化的MAb 225。
.藥物組合物，其中所述第一抗體是人源化MAb 425(h425)而所述第二抗體是嵌合MAb 225(c225)。
.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項的藥物組合物，其還包含細(xì)胞毒性劑。
.藥物組合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是化療劑。
.藥物組合物，其中所述化療劑選自順鉑、阿霉素、吉西他濱、多西他賽(docetaxel)、紫杉醇、博來霉素。
.藥物組合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是ErbB受體抑制劑、VEGF受體抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、蛋白激酶A抑制劑、抗血管生成劑，或細(xì)胞因子。
.藥物組合物，其中所述第一和/或所述第二抗體分子是免疫綴合物，其中抗體部分經(jīng)其C末端，任選地借助接頭肽與生物學(xué)上有效的肽、多肽或蛋白質(zhì)融合.藥物組合物，其中蛋白質(zhì)是細(xì)胞因子。
.藥物試劑盒，其包含(i)第一包裝，該包裝包含含有與ErbB1受體分子上存在的第一特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點的第一抗體分子或其部分，和(ii)第二包裝，該包裝包含含有與相同ErbB1受體分子類型上的第二不同特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點的第二抗體分子。
.藥物試劑盒，其中至少ErbB1受體上的所述第一或所述第二表位位于ErbB1受體結(jié)合域內(nèi)。
.藥物試劑盒，其中ErbB1受體上的所述第一和所述第二表位位于ErbB1受體結(jié)合域內(nèi)。
.藥物試劑盒，其中至少一種所述分子與ErbB1受體的天然配體所結(jié)合的受體結(jié)合域內(nèi)的表位相結(jié)合。
.藥物試劑盒，其中所述第一抗體分子是鼠的、嵌合的或人源化的單克隆抗體425，而所述第二分子是鼠的、嵌合的或人源化的單克隆抗體225。
.藥物試劑盒，其包含第一包裝和第二包裝，第一包裝包含人源化MAb 425(h425)，第二包裝包含嵌合MAb 225(c225)。
.根據(jù)權(quán)利要求19-24任一項的藥物試劑盒，其還包含第三包裝，該包裝包含細(xì)胞毒性劑。
.藥物試劑盒，其中所述細(xì)胞毒性劑是化療劑。
.藥物試劑盒，其中所述化療劑選自順鉑、阿霉素、吉西他濱、多西他賽、紫杉醇、博來霉素。
.藥物試劑盒，其中所述細(xì)胞毒性藥是ErbB受體抑制劑、VEGF受體抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、蛋白激酶A抑制劑、抗血管生成劑，或細(xì)胞因子。
.如上述和權(quán)利要求任一項所述的藥物組合物或藥物試劑盒在制備用于治療與ErbB，尤其是ErbB1受體過表達(dá)相關(guān)的腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移或腫瘤相關(guān)疾病的藥物中的用途。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于如下認(rèn)識，具有針對不同免疫原性結(jié)構(gòu)的特異性的兩種或多種不同的分子，優(yōu)選單克隆抗體(MAb)，可與其表位同時且無阻礙地結(jié)合，所述表位可位于相同ErbB(優(yōu)選ErbB1)受體域上，例如位于ErbB(ErbB1)配體-結(jié)合域內(nèi)。與僅用一種單特異性抗體的治療效果相比，施用具有所述特性的兩種或多種化學(xué)或生物分子，諸如單特異性MAb或針對相同或不同受體的抗體聯(lián)合，可極大改進(jìn)治療效果.兩種或多種Mabs獨立地結(jié)合其靶受體(例如EGFR)上的不同表位。
.由于獨立地結(jié)合不同受體表位，故使用相同抗體劑量或濃度可以增加每一受體和由此每一細(xì)胞所結(jié)合的抗體量。在每一抗體具有飽和濃度或劑量的最適條件下，當(dāng)使用針對不同表位的兩種抗體時，每一受體和每一細(xì)胞所結(jié)合的抗體分子的數(shù)量在理論上加倍。隨著每增加應(yīng)用一種抗體，每一受體和每一細(xì)胞所結(jié)合的抗體蛋白可以線性增加。
.對于具有的抗原密度低于抗體依賴性免疫效應(yīng)子功能所需的密度閾值的細(xì)胞(其在正常條件下對抗體治療不敏感)，在用兩種或多種針對同一受體的不同表位的抗體處理后，其表面上的抗體量將增加，并由此可能易受ADCC和CDC的影響。
.與僅用一種單一抗體所得到的受體阻斷功效相比，使用具有不同表位特異性的兩種或多種單特異性抗體——所述不同表位位于配體結(jié)合域內(nèi)或鄰近配體-結(jié)合域——明顯地增加了受體阻斷功效。
.因為由針對相同受體域的不同抗體的聯(lián)合引起的受體阻斷比僅由一種單一抗體引起的受體阻斷更有效，故可得到對配體-結(jié)合更有效的抑制作用，從而導(dǎo)致更有效的受體失活。
.該更有效的受體失活導(dǎo)致對下游受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)更有效的抑制，并由此導(dǎo)致對配體-依賴性細(xì)胞功能的影響增強(qiáng)。
.由于該更有效的受體阻斷，故可降低所使用的各抗體的劑量(或濃度)而不會損失功效。當(dāng)使用的治療性抗體低于最適治療劑量仍顯示出劑量限制性毒性或副作用時，這可能是非常有意義的。
.與受體的單一一種表位相互作用的單特異性抗體僅允許形成由兩個受體分子組成的聚集物。與之相反，由針對不同表位的兩種或多種抗體所誘導(dǎo)的受體交聯(lián)可導(dǎo)致包含明顯更多數(shù)量受體的受體-抗體復(fù)合物。
.通過使用兩種或多種抗體誘導(dǎo)較大受體-抗體復(fù)合物形成，可以改善受體的內(nèi)在化，并由此可以更有效地從細(xì)胞表面除去受體和隨后下調(diào)受體-依賴性細(xì)胞功能。
.兩種或多種針對相同或不同受體的抗體的聯(lián)合可用于治療帶有適宜受體的腫瘤。EGFR陽性腫瘤是一個典型的實例，但是本發(fā)明所述的治療原則的應(yīng)用并不限于該適應(yīng)癥。由此，采用相同的原則可以治療帶有其它受體、受體家族或其它抗原性結(jié)構(gòu)的種類繁多的腫瘤。
.應(yīng)用兩種或多種針對相同或不同受體上不同抗原的抗體的聯(lián)合療法還可以與化療藥和/或放射聯(lián)合應(yīng)用。
.應(yīng)用針對相同或不同受體上不同抗原的兩種或多種抗體的聯(lián)合療法還可以與其它治療原則聯(lián)合使用，所述其它治療原則包括但不限于應(yīng)用激素拮抗劑或激素激動劑、血管生成抑制劑的治療和其它治療。
本文中以對EGFR陽性腫瘤的治療為例，描述了應(yīng)用具有對相同或不同受體上抗原結(jié)構(gòu)的不同特異性的適宜分子，優(yōu)選抗體進(jìn)行的聯(lián)合治療原則。但是，該原則并不限于EGFR，其可適用于任何其它靶抗原。
若沒有另外的說明，本發(fā)明使用的術(shù)語和詞語具有下面給出的含義和定義。而且，這些定義和含義更詳細(xì)地描述了本發(fā)明，包括優(yōu)選實施方案。
“受體”或“受體分子”是指可溶的或膜結(jié)合/相關(guān)的蛋白或糖蛋白，其含有一個或多個可與配體結(jié)合以形成受體-配體復(fù)合物的域。通過與可能是激動劑或拮抗劑的配體結(jié)合，受體可以被激活或者失活，由此可以啟動或阻斷信號通路。
術(shù)語“受體分子類型”或“ErbB(ErbB1)受體分子類型”是指具體的受體類型諸如ErbB1，ErbB2等，但不指該受體類型的具體的單分子。如果本文提及在本發(fā)明聯(lián)合中根據(jù)本發(fā)明的抗體與特定ErbB受體分子類型結(jié)合，則這的確包括抗體與同一所述ErbB受體類型的相同或不同分子結(jié)合。由此，可能是，第一抗體與ErbB1受體分子個體上的特異性表位結(jié)合，而第二抗體與相同ErbB1受體分子個體上的另一不同表位結(jié)合。然而，也可能是第二抗體與相同受體類型的另一受體分子個體的相同不同表位結(jié)合。
“配體”或“受體配體”是指這樣的天然或者合成的化合物，它可以和受體分子結(jié)合形成受體-配體復(fù)合物。術(shù)語配體包括激動劑、拮抗劑以及具有部分激動劑/拮抗劑活性的化合物。
“激動劑”或“受體激動劑”是指這樣的天然或者合成的化合物，它和受體結(jié)合形成受體-激動劑復(fù)合物，激活所述受體或受體-激動劑復(fù)合物而啟動信號通路及進(jìn)一步的生物學(xué)過程。
“拮抗劑”或“受體拮抗劑”是指具有與激動劑相反的生物學(xué)效應(yīng)的天然或者合成的化合物。拮抗劑和受體結(jié)合，通過和激動劑競爭受體而阻斷受體激動劑的作用。拮抗劑是根據(jù)它阻斷激動劑的作用的能力來定義的。受體拮抗劑也可以是抗體或是其具有免疫治療活性的片段。下面將舉出并論述本發(fā)明優(yōu)選的拮抗劑。
“ErbB受體”是指屬于(如上述)ErbB受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(ErbB1)，ErbB2，ErbB3和ErbB4受體以及此家族中有待于在將來進(jìn)行鑒別的其他成員。ErbB受體一般含有一個可與ErbB配體結(jié)合的細(xì)胞外域；一個親脂性的跨膜域；一個保守的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域；以及一個含有若干可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號域。ErbB受體可以是“天然序列的”ErbB受體，或其“氨基酸序列變異體”。優(yōu)選的ErbB受體是天然序列的人ErbB受體。ErbB1是指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因。最優(yōu)選的是EGF受體(EGFR，Her1)?！癊rbB1”和“HER1”和“EGFR”在本文可互換使用且均指人HER1蛋白?！癊rbB2”和“HER2”在本文可互換使用且均指人HER2蛋白。本發(fā)明優(yōu)選ErbB1受體(EGFR)。
“ErbB配體”是結(jié)合并且/或者激活ErbB受體的多肽。與EGFR結(jié)合的ErbB配體包括例如EGF，TGF-α，雙調(diào)蛋白，β細(xì)胞調(diào)節(jié)素(betacellulin)，HB-EGF和表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)，優(yōu)選EGF和TGF-α。
在本發(fā)明的上下文中，“ErbB受體結(jié)合域”是ErbB受體的局部區(qū)域(結(jié)合序列/環(huán)/袋)，該區(qū)域與天然配體或拮抗劑或激動劑結(jié)合。該區(qū)域不僅可以包含一種特異性結(jié)合位點或表位，還可包含兩種或多種表位或結(jié)合位點。該域內(nèi)的一種特異性結(jié)合表位與一類拮抗劑或激動劑或配體結(jié)合。然而，不同藥劑與相同受體類型結(jié)合域內(nèi)的或鄰近結(jié)合域的不同表位結(jié)合，被認(rèn)為通常會通過抑制或活化作用導(dǎo)致該受體所典型的獨特唯一信號通路。此外，應(yīng)當(dāng)指出本說明書和權(quán)利要求書中所使用的術(shù)語“結(jié)合域內(nèi)”也包括緊鄰相應(yīng)天然配體的真實結(jié)合域的位置。
“ErbB結(jié)合表位或結(jié)合位點”是指ErbB受體的結(jié)合域內(nèi)的或與結(jié)合域緊鄰的氨基酸的構(gòu)象和/或構(gòu)型，所述結(jié)合域與配體或受體拮抗劑/激動劑結(jié)合。
“相同的ErbB/ErbB1受體分子”不一定意指同一個受體分子，而是也包括相同類型的其它受體分子。優(yōu)選，意指同一個受體分子。
術(shù)語“ErbB受體拮抗劑/抑制劑”是指能結(jié)合并阻斷或抑制ErbB受體的生物學(xué)上有效的分子。因此，通過阻斷受體，拮抗劑阻止ErbB配體(激動劑)的結(jié)合以及激動劑/配體受體復(fù)合物的活化。ErbB拮抗劑可針對HER1(ErbB1，EGFR)，HER2(ErbB2)和ErbB3和ErbB4。本發(fā)明優(yōu)選的拮抗劑針對EGF受體(EGFR，HER1)。ErbB受體拮抗劑可以是抗體或抗體的免疫治療活性片段或非免疫生物學(xué)分子，諸如肽、多肽蛋白?；瘜W(xué)分子也包括在內(nèi)，但是本發(fā)明優(yōu)選的拮抗劑為抗EGFR抗體和抗HER2抗體。
本發(fā)明優(yōu)選的抗體為抗HER1和抗Her2抗體，更優(yōu)選抗HER1抗體。優(yōu)選的抗HER1抗體為Mab 425，優(yōu)選人源化的Mab 425(hMAb 425，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合MAb 225(CETUXIMAB)。最優(yōu)選的是單克隆抗體h425，在單藥物治療中它已顯示出高療效和降低的不良反應(yīng)和副反應(yīng)。最優(yōu)選的抗Her2抗體是Genentech/Roche上市的HERCEPTIN。
本發(fā)明的有效EGF受體拮抗劑還可以是天然或合成的化學(xué)化合物。此類優(yōu)選分子的一些實例包括有機(jī)化合物、有機(jī)金屬化合物、有機(jī)化合物和有機(jī)金屬化合物的鹽。HER2受體化學(xué)拮抗劑的實例有苯乙烯基取代的雜芳基化合物(US 5,656,655)；雙單環(huán)和/或雙環(huán)芳基雜芳基、碳環(huán)和雜碳環(huán)化合物(US 5,646,153)；三環(huán)的嘧啶化合物(US 5,679,683)；具有受體酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物(US 5,616,582)；雜芳基乙烯二基或雜芳基乙烯二基芳基化合物(US 5,196,446)；名稱為6-(2，6-二氯代苯基)-2-(4-(2-二乙基-氨基乙氧基)苯基氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3)-5-嘧啶-7-酮的化合物(Panek，等，1997，J.Pharmacol.Exp.Therap.283，1433)，其可以抑制EGFR、PDGFR和FGFR受體家族。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“酪氨酸激酶拮抗劑/抑制劑”是指天然或者合成的能夠抑制或阻斷酪氨酸激酶(包括受體酪氨酸激酶)的試劑。因此，該術(shù)語本身包括上述ErbB受體拮抗劑/抑制劑。除了上文和下文所提及的抗ErbB受體抗體以外，此定義下更優(yōu)選的酪氨酸激酶拮抗劑是在單藥物治療中表現(xiàn)出對乳腺癌和前列腺癌有效的化學(xué)化合物。適宜的吲哚并咔唑型酪氨酸激酶抑制劑可利用如美國專利5,516,771；5,654,427；5,461,146；5,650,407等文獻(xiàn)的信息獲得。美國專利5,475,110；5,591,855；5,594,009和WO 96/11933公開了吡咯并咔唑型酪氨酸激酶抑制劑和前列腺癌。文中最有希望的一種抗癌劑是gefitinib(IRESSA，Astra Zeneca)，其已被報道對患有非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)以及晚期頭頸癌的患者具有顯著的治療效果和良好的耐受性。
上面定義的化學(xué)性酪氨酸激酶抑制劑的優(yōu)選劑量為每天1pg/kg體重到1g/kg體重。更優(yōu)選地，酪氨酸激酶抑制劑的劑量為每天0.01mg/kg體重到100mg/kg體重。
根據(jù)本發(fā)明的生物分子優(yōu)選是抗體或其片段或抗體的任何變體諸如免疫綴合物。
在本文中，術(shù)語“抗體”或“免疫球蛋白”有最廣義的含義，特別包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少2個完整抗體構(gòu)成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段，只要其顯示出具有所需的生物學(xué)活性即可。此術(shù)語一般包括由2個或多個具有不同結(jié)合特異性的抗體或抗體片段連接在一起構(gòu)成的雜合抗體。
根據(jù)抗體恒定區(qū)的氨基酸序列，完整的抗體可被劃分成不同的“抗體(免疫球蛋白)類型”。完整抗體有5個主要類型IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可以被進(jìn)一步劃分成“亞類”(同種型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。相應(yīng)于不同抗體類型的重鏈恒定區(qū)分別稱為α，δ，ε，γ和μ。本發(fā)明優(yōu)選的抗體主要類型是IgG，更具體的說是IgG1和IgG2。
抗體常常是分子量約150,000的糖蛋白，由2條同樣的輕(L)鏈和2條同樣的重(H)鏈組成。每條輕鏈都通過一個共價二硫鍵和重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈都在一端有一個可變區(qū)(VH)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈都在一端上有一個可變區(qū)(VL)，在另一端上有一個恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)并列，輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)并列。據(jù)信特定氨基酸殘基構(gòu)成輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的介面。可將脊椎動物物種的抗體“輕鏈”劃分為2種明確不同的類型，稱為卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)，這取決于它們恒定區(qū)的氨基酸序列。
本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上均質(zhì)的抗體群中獲得的抗體，即，除了可能的天然發(fā)生的突變——此突變可能小量存在——以外，抗體群內(nèi)的每一株抗體都是相同的。單克隆抗體具有高度的特異性，它針對單一的抗原位點。而且，和多克隆抗體制品不同，多克隆抗體含有針對不同決定簇(表位)的不同抗體，而每個單克隆抗體都僅針對抗原上的一個決定簇。除了其特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)越之處還在于可以合成無其他抗體污染的單克隆抗體。單克隆抗體的制備方法包括Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495)和“單克隆抗體技術(shù)，嚙齒類和人類雜交瘤的制備和表征”(1985，Burdon等，Eds，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam)中描述的雜交瘤法，或者可以用眾所周知的重組DNA方法進(jìn)行制備(實例可參見US 4,816,567)。也可采用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，22258，1-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離單克隆抗體。
術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類型或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，然而鏈的其余部分則與來自另一物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，該術(shù)語還指此種抗體的片段，只要其具有所需的生物學(xué)活性即可(例如US 4,816,567；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。生產(chǎn)嵌合型和人源化抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，制備嵌合抗體的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)(US 4,816,397；US 4,816,567)的專利中描述的方法。
“人源化抗體”是非人(如嚙齒類)嵌合抗體形式的抗體，其含有最低量的源于非人免疫球蛋白的序列。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區(qū)(CDR)的殘基被替換成非人物種(如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類)(供體抗體)的、具有所需的特異性、親和性和性能的高變區(qū)殘基。有時，人免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體還可以含有受體抗體和供體抗體上均沒有的殘基。這些修飾可以進(jìn)一步精細(xì)化抗體的性能。通常，人源化抗體含有基本上所有的可變區(qū)(至少一個，一般兩個可變區(qū))，其中所有或基本上所有的高變環(huán)都對應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而所有或基本上所有的FR都具有人免疫球蛋白序列。人源化抗體也可任選地含有至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型的是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。人源化抗體的制備方法描述在例如Winter，US 5,225,539和Boss(Celltech，US 4,816,397)中。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v和Fc片段，雙抗體(diabody)，線性抗體，單鏈抗體分子；以及由抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體?！蓖暾笨贵w是指包含結(jié)合抗原的可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2和CH3)的抗體。
優(yōu)選地，完整抗體具有一個或多個效應(yīng)子功能。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生2個相同抗原結(jié)合片段(稱之為“Fab”片段，每個片段含有一個抗原結(jié)合位點和一個CL區(qū)和一個CH1區(qū))以及一個殘余的“Fc”片段(其名稱反映了其易于結(jié)晶的能力)。
抗體的“Fc”區(qū)一般含有CH2，CH3和IgG1或IgG2抗體主要類型的鉸鏈區(qū)。鉸鏈區(qū)是具有約15個氨基酸殘基的基團(tuán)，它把CH1區(qū)和CH2-CH3區(qū)結(jié)合起來。
胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個“F(ab′)2”片段，其含有2個抗原結(jié)合位點并仍具有交聯(lián)抗原的能力。
“Fv”是最小的抗體片段，其含有一個完整的抗原識別和抗原結(jié)合位點。此區(qū)域由一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)通過緊密的非共價連接形成的二聚體組成。在此構(gòu)型中每個可變區(qū)的3個高變區(qū)(CDR)相互作用在VH-VL二聚體表面上確定出一個抗原結(jié)合位點?？偟恼f來，6個高變區(qū)賦予了抗體的抗原結(jié)合特異性。但是，甚至僅一個可變區(qū)(或僅含有3個抗原特異性高變區(qū)的一半Fv)也有識別并結(jié)合抗原的能力，雖然它比完整的結(jié)合位點的親合力低。
“Fab”片段還包括輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)并僅具有一個抗原結(jié)合位點?！癋ab′”片段和Fab片段的不同之處在于在重鏈CH1區(qū)的羧基端多了幾個殘基，包括一個或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。
F(ab′)2抗體片段最初以Fab′片段對的形式產(chǎn)生，這兩個Fab′片段之間有半胱氨酸鉸鏈。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的(例如參見Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996；US4,342,566)。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的V，和V，區(qū)，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其可使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。單鏈FV抗體也可從例如Plückthun(The Pharmacology Of Monoconal Antibodies，Vol.113，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994))，WO 93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science 240，1038)獲知。
術(shù)語“可變”或“FR”是指如下事實，即抗體與抗體之間在可變區(qū)的某些部分具有十分不同的序列，這些部分用于各特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，此可變性并非均勻地分布在抗體的整個可變區(qū)。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個稱為高變區(qū)的區(qū)段中?？勺儏^(qū)的較高保守部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)每一個都包含四個FR(FR1-FR4)，其主要采用β-折疊構(gòu)型，由三個高變區(qū)連接，高變區(qū)形成環(huán)連接這些β-折疊結(jié)構(gòu)，且有時形成β-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的高變區(qū)通過FR緊鄰地保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat等，Sequences Of Proteins OfImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National InstitutesOf Health，Bethesda，MD.(1991)。雖然恒定區(qū)不直接參與抗體和抗原的結(jié)合，但其顯示出多種效應(yīng)子功能，如參與抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。本文所用的術(shù)語“高變區(qū)”或“CDR”是指負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)一般包含“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變區(qū)的24-34位(L1)，50-56位(L2)和89-97位(L3)殘基，重鏈可變區(qū)的31-35位(H1)，50-65位(H2)和95-102位(H3)殘基)；和/或“高變環(huán)”的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變區(qū)的26-32位(L1)，50-52位(L2)和91-96位(L3)殘基，重鏈可變區(qū)的26-32位(H1)，53-55位(H2)和96-101位(H3)殘基；Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196901-917(1987))?！皹?gòu)架區(qū)”或“FR”殘基是指除本處定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變區(qū)殘基。
術(shù)語“單特異性”是指根據(jù)本發(fā)明的抗體，其中抗體的兩個結(jié)合位點具有相同的特異性，由此，能夠結(jié)合受體上的相同表位。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物包含單特異性抗體。
“雙特異性抗體(BAbs)”是單個、雙價的抗體(或其免疫治療活性片段)，其含有2個不同特異性的抗原結(jié)合位點。根據(jù)本發(fā)明，BAbs的特征在于BAb<MAb1，MAb2>，其中<MAb1>和<MAb2>命名源自MAb1和MAb2的抗原結(jié)合位點。例如，第一個抗原結(jié)合位點針對血管生成受體(例如整聯(lián)蛋白或VEGF受體)，而第二個抗原結(jié)合位點針對ErbB受體(例如EGFR或Her2)。雙特異性抗體可用化學(xué)方法(例如參見Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,5807)或“polydoma”技術(shù)(參見US 4,474,893)或重組DNA技術(shù)制備，所有這些技術(shù)均為實質(zhì)上已知的技術(shù)。其他方法在WO 91/00360，WO 92/05793和WO 96/04305中有描述。雙特異性抗體還可用單鏈抗體來制備(例如參見Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879；Skerra和Plueckthun(1988)Science 240，1038)。這些是以單條多肽鏈形式產(chǎn)生的抗體可變區(qū)類似物。為了構(gòu)成雙特異性結(jié)合劑，單鏈抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的化學(xué)方法或遺傳工程方法偶聯(lián)在一起。本發(fā)明的雙特異性抗體也可以用亮氨酸拉鏈序列來制備。此序列可來自于轉(zhuǎn)錄因子Fos和Jun的亮氨酸拉鏈區(qū)(Landschulz等，1988，Science 240，1759；綜述見，Maniatis和Abel，1989，Nature 341，24)。亮氨酸拉鏈?zhǔn)羌s20-40個殘基長的特殊氨基酸序列，典型地每7個殘基就有一個亮氨酸。此拉鏈序列形成兩親性α-螺旋，亮氨酸殘基在疏水側(cè)上排成一線以便形成二聚體。與Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈相應(yīng)的肽優(yōu)先形成異二聚體(O′Shea等，1989，Science 245，646)。含有拉鏈的雙特異性抗體及其制備方法在WO 92/10209和WO 93/11162中有公開。
術(shù)語“融合蛋白”是指由上述一種或多種分子組成的天然或合成分子，其中具有不同特異性的兩種或多種基于肽或蛋白質(zhì)(包括糖蛋白)的分子任選的通過化學(xué)的或基于氨基酸的接頭分子融合在一起。該連接可通過C-N融合或N-C融合(以5′→3′方向)，優(yōu)選C-N融合而實現(xiàn)。
然而，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的融合蛋白質(zhì)是如下述的免疫綴合物。
術(shù)語“免疫綴合物”指融合蛋白，且意指通過共價鍵與非免疫學(xué)效應(yīng)分子融合在一起的抗體或免疫球蛋白或其免疫學(xué)活性片段。此融合伙伴(partner)優(yōu)選為可被糖基化的肽或蛋白質(zhì)。所述非抗體分子能連接到抗體重鏈恒定區(qū)的C末端或連接到輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的N末端。此融合伙伴可以通過接頭分子連接，一般這種接頭分子是含3-15個氨基酸殘基的肽。本發(fā)明的免疫綴合物是由針對ErbB受體的免疫球蛋白或其有免疫治療效果的片段與優(yōu)選地細(xì)胞因子，諸如TNFα、IFNγ或IL-2，或其它毒性劑組成的融合蛋白。優(yōu)選地，這些基于肽或蛋白質(zhì)的分子通過其N末端與所述免疫球蛋白的C末端(，即其Fc部分)相連。
“雜合抗體”是基本上由常規(guī)地通過化學(xué)交聯(lián)劑而被融合在一起的兩個或多個抗體或抗體結(jié)合片段組成的融合蛋白，這些抗體中每個都具有不同的結(jié)合特異性。雜合抗體可以通過將兩個或多個抗體或抗體片段綴合在一起而制備。
優(yōu)選的雜合抗體由交聯(lián)的Fab/Fab′片段組成。很多偶聯(lián)或交聯(lián)試劑可用于抗體的綴合。例如蛋白A，碳二亞胺，N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)和N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)丙酸酯(SPDP)(例如參見Karpovsky等(1984)J.EXP.Med.160，1686；Liu等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，8648)。其他的方法還有Paulus，BehringInst.Mitt.，No.78，118(1985)；Brennan等(1985)Science 30，81或Glennie等(1987)J.Immunol.139，2367描述的方法。另一種方法使用鄰亞苯基二馬來酰亞胺(oPDM)將三個Fab′片段偶聯(lián)在一起(WO 91/03493)。
本發(fā)明中多特異性抗體也是適用的，并可例如按照WO 94/13804和WO 98/50431的教導(dǎo)進(jìn)行制備。本發(fā)明優(yōu)選的雜合抗體是包含如所述連接在一起的兩種抗EGFR抗體(各抗體均針對相同受體的不同表位)的融合蛋白(例如MAB 425-MAB 225)。
術(shù)語“細(xì)胞因子”是對由一個細(xì)胞群釋放的作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。這類細(xì)胞因子的實例有淋巴因子、單核因子以及傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長激素如人生長激素，N-甲硫氨?；松L激素以及牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)，促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGFβ；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGFα和TGFβ；紅細(xì)胞生成素(EPO)；干擾素如IFNα，IFNβ和IFNγ；集落刺激因子如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素如IL-1，IL-1a，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；和TNFα或TNFβ。本發(fā)明優(yōu)選的細(xì)胞因子為干擾素和TNFα和IL-2。
抗體“效應(yīng)子功能”是指由抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))引起的那些生物活性?？贵w效應(yīng)子功能的實例包括補體依賴的細(xì)胞毒性，F(xiàn)c受體結(jié)合，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)，吞噬作用，細(xì)胞表面受體(如B細(xì)胞受體)的下調(diào)等。
術(shù)語“ADCC”(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用)是指這樣一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(如天然殺傷(NK)細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)識別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體并隨后引起靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞-NK細(xì)胞只表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞可表達(dá)FcγRI，F(xiàn)cγRII和FcγRIII。為估計目的分子的ADCC活性，可利用例如現(xiàn)有技術(shù)(US 5,500,362；US 5,821,337)中描述的體外ADCC實驗來進(jìn)行。此實驗中有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的受體(γ受體)并包括FcγRI，F(xiàn)cγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。對FcR的綜述可參見例如，Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92(1991)。
作為一個具體的實施方案，本發(fā)明的治療方法包括其它治療上有效的藥劑的施用，該其它藥劑能輔助期望的效應(yīng)，例如腫瘤毒性或細(xì)胞抑制功效，或減少或防止不需要的副作用。因此，本發(fā)明包括此類藥劑與上文和下文所述的藥物組合物的聯(lián)合，其中所述藥劑通?？梢允瞧渌麰rbB受體拮抗劑、VEGF受體拮抗劑、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子免疫綴合物、抗血管生成劑、抗激素劑、或細(xì)胞毒性劑。本發(fā)明的一個目的還在于根據(jù)已知方法將本文所述的組合物與放射治療聯(lián)合。
本文中所使用的術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”具有非常廣泛的定義，其是指這樣的物質(zhì)，該物質(zhì)能抑制或防止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞(細(xì)胞死亡)，和/或產(chǎn)生抗腫瘤的/抗增殖的作用，例如，直接或間接防止瘤性腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展、成熟或擴(kuò)散。該術(shù)語表達(dá)性地還包括這樣的藥劑，其僅導(dǎo)致細(xì)胞抑制作用而無純粹的細(xì)胞毒性作用。該術(shù)語包括下面詳細(xì)描述的化療劑，以及其它ErbB拮抗劑(諸如抗ErbB抗體)，抗血管生成劑，酪氨酸激酶抑制劑，蛋白激酶A抑制劑，細(xì)胞因子家族成員，放射性同位素，和毒素諸如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素。
術(shù)語“化療劑”是術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”的子集，其具體指具有抗腫瘤效果，優(yōu)選直接作用于腫瘤細(xì)胞上，和較少地間接經(jīng)過諸如生物反應(yīng)修飾等機(jī)制起作用的化學(xué)藥劑。本發(fā)明適宜的化療劑優(yōu)選為天然或合成的化學(xué)化合物。大量的現(xiàn)有處于商業(yè)使用、臨床評價和臨床前研發(fā)階段的抗瘤形成化療劑都可包括在本發(fā)明內(nèi)，用于通過與本發(fā)明提到的受體拮抗劑相聯(lián)合來治療腫瘤/贅生物。應(yīng)當(dāng)指出化療劑可任選地與本發(fā)明的所述ErbB受體拮抗劑，優(yōu)選所述抗EGFR抗體一起施用。
化療劑的實例包括烷化劑，如氮芥，吖丙啶化合物，烷基磺酸酯以及其他具有烷基化作用的化合物如亞硝基脲，順鉑和達(dá)卡巴嗪；抗代謝物如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑如長春花生物堿和鬼臼毒素衍生物；細(xì)胞毒性抗生素和喜樹堿衍生物。
優(yōu)選的化療劑包括氨磷汀(ethyol)，順鉑，達(dá)卡巴嗪(DTIC)，放線菌素D，氮芥，鏈脲霉素，環(huán)磷酰胺，carrnustine(BCNU)，環(huán)己亞硝脲(CCNU)，阿霉素，阿霉素微脂體(doxil)，吉西他濱(gemzar)，柔紅霉素，柔紅霉素微脂體(daunoxome)，甲基芐肼，絲裂霉素，阿糖胞苷，足葉乙甙，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)，長春花堿，長春新堿，博來霉素，紫杉醇(taxol)，泰索帝(taxotere)，阿地白介素(aldesleukin)，天冬酰胺酶，白消安，卡鉑，克拉立平，喜樹堿，CPT-11，10-羥基-7-乙基-喜樹堿(SN38)，gefitinib(Iressa)，達(dá)卡巴嗪，氟尿苷，氟達(dá)拉濱，羥基脲，異環(huán)磷酰胺，伊達(dá)比星，巰乙磺酸鈉，干擾素α，干擾素β，伊立替康(irinotecan)，米托蒽醌，托泊替堪，亮丙瑞林，甲地孕酮，抗瘤氨酸，巰嘌呤，普卡霉素(plicamycin)，氯苯二氯乙烷，天冬酰胺酶(pegaspargase)，噴司他丁(pentostatin)，哌酰溴烷，普卡霉素，鏈脲霉素，他莫西芬，替尼泊甙，睪內(nèi)酯，硫鳥嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，維諾利賓，苯丁酸氮芥及其組合。
本發(fā)明最優(yōu)選的化療劑是順鉑，吉西他濱，阿霉素，紫杉醇(taxol)和博來霉素。
“抗血管生成劑”是指天然或合成的化合物，其可在一定程度上阻斷或干擾血管的發(fā)育。例如，抗血管生成分子可以是與生血管生長因子或生長因子受體結(jié)合并將其阻斷的生物分子。此處優(yōu)選的抗血管生成分子可以與受體結(jié)合，優(yōu)選與整聯(lián)蛋白受體或與VEGF受體結(jié)合。本發(fā)明中此術(shù)語還包括所述血管生成劑的前體藥物。該術(shù)語還包括具有所述活性并也可被分類為細(xì)胞毒性劑，優(yōu)選化療劑的藥劑。
有很多結(jié)構(gòu)和來源不同的分子都可以引起抗血管生成性質(zhì)。本發(fā)明中適宜的血管生成抑制劑或阻斷劑的大多數(shù)相關(guān)類型是，例如(i)抗有絲分裂劑，例如氟尿嘧啶，絲裂霉素C，紫杉醇；(ii)雌激素代謝物如2-甲氧基雌二醇；(iii)抑制鋅金屬蛋白酶的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑(例如，betimastat，BBl6，TIMPs，二甲胺四環(huán)素，GM6001，或在“基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制治療應(yīng)用”中論及的那些(物質(zhì))(Golub，Annals of the NewYork Academy Of Science，Vol.878a；Greenwald，Zucker(編)，1999)；(iv)抗血管生成的多功能藥劑和因子，如IFNα(US 4,530,901；US4,503,035；5,231,176)；血管他丁和纖溶酶原片段(例如kringle 1-4，kringle5，kringle 1-3(O′Reilly，M.S.等，Cell(Cambridge，Mass.)79(2)315-328，1994；Cao等，J.Biol.Chem.27129461-29467，1996；Cao等，J.Biol Chem 27222924-22928，1997)；內(nèi)皮生長抑素(endostatin)(O′Reilly，M.S.等，Cell 88(2)，277，1997和WO 97/15666)，血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1；Frazier，1991，Curr Opin Cell Biol 3(5)792)；血小板因子4(PF4)；(v)纖溶酶原激活物/尿激酶抑制劑；(vi)尿激酶受體拮抗劑；(vii)肝素酶；(viii)煙曲霉素類似物如TNP-470；(ix)酪氨酸激酶抑制劑如SU 10(上面和下面提到的很多ErbB受體拮抗劑(EGFR/Her 2拮抗劑)也是酪氨酸激酶抑制劑，因此其分別可以顯示出抗EGF受體阻斷活性從而導(dǎo)致腫瘤生長受抑制，及顯示出抗血管生成的活性從而導(dǎo)致血管發(fā)育和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育受抑制)；(x)蘇拉明和蘇拉明類似物；(xi)制管張性(angiostatic)類固醇；(xii)VEGF和bFGF拮抗劑；(xiii)VEGF受體拮抗劑如抗VEGF受體抗體(DC-101)；(xiv)flk-1和flt-1拮抗劑；(xv)環(huán)加氧酶-II抑制劑如COX-II；(xvi)整聯(lián)蛋白拮抗劑和整聯(lián)蛋白受體拮抗劑如αv拮抗劑和αv受體拮抗劑，例如，抗αv受體抗體和RGD肽。本發(fā)明優(yōu)選整聯(lián)蛋白(受體)拮抗劑。
術(shù)語“整聯(lián)蛋白拮抗劑/抑制劑”或“整聯(lián)蛋白受體拮抗劑/抑制劑”是指天然或者合成的分子，其阻斷并抑制整聯(lián)蛋白受體。有時，此術(shù)語包括針對所述整聯(lián)蛋白受體的配體(例如對于αvβ3玻連蛋白，纖維蛋白，纖維蛋白原，馮·維勒布蘭德因子，血小板反應(yīng)蛋白，層粘連蛋白；對于αvβ5玻連蛋白；對于αvβ1纖連蛋白和玻連蛋白；對于αvβ6纖連蛋白)的拮抗劑。
本發(fā)明優(yōu)選針對整聯(lián)蛋白受體的拮抗劑。整聯(lián)蛋白(受體)拮抗劑可以是天然或合成的肽，非肽，肽模擬物(pepetidomimetica)，免疫球蛋白例如抗體或抗體的功能性片段，或免疫綴合物(融合蛋白)。
本發(fā)明優(yōu)選的整聯(lián)蛋白抑制劑為針對αv整聯(lián)蛋白受體(例如，αvβ3，αvβ5，αvβ6和亞類)的抑制劑。優(yōu)選的整聯(lián)蛋白抑制劑為αv拮抗劑，尤其是αvβ3拮抗劑。本發(fā)明優(yōu)選的αv拮抗劑是RGD肽、肽模擬物(非肽)拮抗劑和抗整聯(lián)蛋白受體抗體如阻斷αv受體的抗體。示例性非免疫性的αvβ3拮抗劑在US 5,753,230和US 5,766,591中有教導(dǎo)。優(yōu)選的拮抗劑為含RGD的線性和環(huán)型肽。環(huán)肽通常更穩(wěn)定且在血清中的半衰期更長。然而，本發(fā)明最優(yōu)選的整聯(lián)蛋白拮抗劑是環(huán)(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(EMD121974，Cilengitide，Merck KgaA，德國；EP 0770 622)，其可有效地阻斷整聯(lián)蛋白受體αvβ3、αvβ1、αvβ6、αvβ8、αnbβ3。
科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中均描述過αvβ3/αvβ5/αvβ6整聯(lián)蛋白受體的適宜肽類拮抗劑及肽模擬(非肽)拮抗劑。例如，可參見Hoekstra和Poulter，1998，Curr.Med.Chem.5，195；WO 95/32710；WO 95/37655；WO97/01540；WO 97/37655；WO 97/45137；WO 97/41844；WO 98/08840；WO 98/18460；WO 98/18461；WO 98/25892；WO 98/31359；WO 98/30542；WO 99/15506；WO 99/15507；WO 99/31061；WO 00/06169；EP 0853 084；EP 0854140；EP 0854145；US 5,780,426；和US 6,048,861。公開了也適用于本發(fā)明的苯并氮雜唑及相關(guān)的苯并二氮雜唑和苯并環(huán)庚烯αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑的專利包括WO 96/00574，WO 96/00730，WO 96/06087，WO96/26190，WO 97/241 19，WO 97/24122，WO 97/24124，WO 98/15278，WO 99/05107，WO 99/06049，WO 99/15170，WO 99/15178，WO 97/34865，WO 97/01540，WO 98/30542，WO 99/11626和WO 99/15508。在WO98/08840；WO 99/30709；WO 99/30713；WO 99/31099；WO 00/09503；US 5,919,792；US 5,925,655；US 5,981,546；和US 6,017,926中描述了具有主鏈構(gòu)象環(huán)約束特征的其他整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。在US 6,048，861和WO00/72801中公開了一系列的壬酸衍生物，它們是有效的αvβ3整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。WO 00/38665中公開了其他化學(xué)小分子整聯(lián)蛋白拮抗劑(多數(shù)為玻連蛋白拮抗劑)。其它αvβ3受體拮抗劑已被證實可有效地抑制血管生成。例如，合成的受體拮抗劑如(S)-10，11-二氫-3-[3-(吡啶-2-基氨基)-1-丙氧基]-5H-二苯并[a，d1環(huán)庚烯-10-乙酸(命名為SB-265123)已經(jīng)在很多哺乳動物模型系統(tǒng)中實驗過。(Keenan等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.8(22)，3171；Ward等，1999，Drug Metab.Dispos.27(11)，1232)。適用作拮抗劑的整聯(lián)蛋白拮抗劑的甄選實驗在如Smith等，1990，J.Biol.Chem.265，12267中以及參考專利文獻(xiàn)中有描述。
抗整聯(lián)蛋白受體的抗體也是眾所周知的?？蓪m宜的抗整聯(lián)蛋白(如αvβ3，αvβ5，αvβ6)的單克隆抗體進(jìn)行修飾，以包括其抗原結(jié)合片段(包括F(ab)2，F(xiàn)ab和工程化的Fv或單鏈抗體)。針對整聯(lián)蛋白受體αvβ3的一個合適的且優(yōu)選使用的單克隆抗體被鑒定為LM609(Brooks等，1994，Cell 79，1157；ATCC HB 9537)。在WO 97/45447中公開了一個強(qiáng)特異性抗αvβ5抗體，P1 F6，其也優(yōu)選用于本發(fā)明。另一合適的αvβ6選擇性抗體是選擇性針對整聯(lián)蛋白受體的αv鏈的MAb 14D9.F8(WO 99/37683，DSM ACC2331，Merck KGaA，德國)以及MAb 17.E6(EP 0719 859，DSM ACC2160，Merck KGaA)。另一個適宜的抗整聯(lián)蛋白抗體是已上市的Vitraxin。
如此處所用的，術(shù)語“抗激素劑”包括天然或合成的有機(jī)或肽化合物，其作用是調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用。更具體地來說，“抗激素劑”(1)抑制血清雄激素的產(chǎn)生，(2)阻斷血清雄激素與雄激素受體的結(jié)合，或者(3)抑制睪酮轉(zhuǎn)化為DHT，或兩種或多種所述化合物的聯(lián)合。本發(fā)明的抗激素劑一般包括類固醇受體拮抗劑，更具體來說抗雌激素劑，如包括他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，氫萘吡苯酮，keoxifene，LY117018，奧那斯酮和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素劑，如氟他胺(flutamide)，尼魯他胺(nilutamide)，比卡魯胺，亮丙瑞林(leuprolide)和性瑞林(goserelin)；以及上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。該術(shù)語還包括糖蛋白激素-如促卵泡成熟激素(FSH)，促甲狀腺素(TSH)和黃體生成素(LH)和LHRH(黃體生成激素釋放激素)的激動劑和/或拮抗劑?？捎糜诒景l(fā)明的LHRH激動劑是醋酸性瑞林，其商品名稱為ZOLADEX(Zeneca)。適用的LHRH拮抗劑的另一實例是GANIRELIX(Roche/Akzo Nobel)。類固醇抗雄激素劑的實例是醋酸環(huán)丙孕酮(CPA)和醋酸甲地孕酮，其商品為MEGACE(Bristol-Myers，Oneology)。類固醇抗雄激素劑可阻斷前列腺雄激素受體。它們還可抑制LH的釋放。優(yōu)選給人類患者施用的CPA劑量為100mg/天-250mg/天。非類固醇抗雄激素阻斷雄激素受體。它們也可引起血清LH水平和血清睪酮水平的增加。優(yōu)選的非類固醇抗雄激素劑是氟他胺(2-甲基-N-[4-20硝基-3-(三氟甲基)苯基丙酰胺]，其商品名為EULEXIN(Schering Corp.)。氟他胺發(fā)揮的是抗雄激素作用，其抑制雄激素攝取，抑制靶組織中雄激素的核結(jié)合或兩者兼而有之。另一個非類固醇抗雄激素劑是尼魯他胺，其化學(xué)名稱為5，5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4’-硝基苯基)-4，4-二甲基-咪唑烷-二酮。在本發(fā)明的一些實施方案中，抗激素劑是LHRH激動劑如醋酸亮丙瑞林和抗雄激素劑如氟他胺或尼魯他胺的聯(lián)合。如，可通過皮下注射、肌肉注射或靜脈注射施用醋酸亮丙瑞林，并同時可以口服氟他胺。本發(fā)明的抗激素劑包括，如上述，類固醇/甲狀腺激素受體的拮抗劑，其中包括了其它非許可(non-permissive)的受體-如RAR，TR，VDR等的拮抗劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地理解，多種合成的和天然的視黃酸受體(RAR)拮抗劑可根據(jù)本發(fā)明而進(jìn)行使用。
概括而言，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物和試劑盒可以優(yōu)選包括以下藥物組合(i)針對EGF受體的不同表位的兩種不同的單克隆抗體(MAb)，其片段或免疫綴合物(優(yōu)選免疫細(xì)胞因子)。
(ii)各自針對EGF受體的不同表位的MAb 425和MAb 225或其片段或免疫綴合物(優(yōu)選免疫細(xì)胞因子)。
(iii)各自針對EGF受體的不同表位的人源化MAb 425和嵌合225或其片段或免疫綴合物(優(yōu)選免疫細(xì)胞因子)。
(iv)(i)-(iii)聯(lián)合一種或多種細(xì)胞毒性劑。
(v)(i)-(iii)，尤其是鼠、嵌合或鼠型MAb 425和MAb 225或其片段或免疫綴合物(優(yōu)選免疫細(xì)胞因子)，聯(lián)合一種或多種化療劑，優(yōu)選順鉑、吉西他濱或紫杉醇。
(vi)(i)-(iii)，尤其是鼠、嵌合或鼠型MAb 425和MAb 225或其片段或免疫綴合物(優(yōu)選免疫細(xì)胞因子)，聯(lián)合其它ErbB拮抗劑。
(vii)(i)-(iii)，尤其是鼠、嵌合或鼠型MAb 425和MAb 225或其片段或免疫綴合物(優(yōu)選免疫細(xì)胞因子)，聯(lián)合針對ErbB-2(優(yōu)選Herceptin)或ErbB-3、ErbB-4的抗體。
(viii)(i)-(iii)，尤其是鼠、嵌合或鼠型MAb 425和MAb 225或其片段或免疫綴合物(優(yōu)選免疫細(xì)胞因子)，聯(lián)合選自以下的藥物.酪氨酸激酶抑制劑，諸如Iressa；.抗血管生成劑，優(yōu)選整聯(lián)蛋白抑制劑，更優(yōu)選RGD肽，包括環(huán)肽，諸如環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(Cilengitide，MerckKGaA)；.抗VEGF受體抗體，諸如DC-101，或VEGF拮抗劑；.COX-II抑制劑；.細(xì)胞因子，諸如TNF-α，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-2；.I型蛋白激酶A(PKAI)抑制劑，諸如混合的主鏈反義寡核苷酸，如HYB 165(參見，例如，Tortora等，1999，Clin.Cancer Res.，875-881)；.抗激素劑，諸如性瑞林，boserelin，亮丙瑞林，他莫昔芬。
術(shù)語“癌”和“腫瘤”是指或描述的是典型特征為無調(diào)控細(xì)胞生長的哺乳動物生理疾病。通過施用本發(fā)明的藥物組合物可以治療腫瘤，諸如乳腺，心臟，肺，小腸，結(jié)腸，脾，腎，膀胱，頭頸，卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪丸，子宮頸和肝的腫瘤。更具體地，腫瘤選自腺瘤，血管肉瘤，星形細(xì)胞瘤，上皮癌，生殖細(xì)胞瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，錯構(gòu)瘤，血管內(nèi)皮瘤，血管肉瘤，血腫，肝胚細(xì)胞瘤，白血病，淋巴瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，黑素瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，骨肉瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤，肉瘤和畸胎瘤。具體而言，腫瘤選自肢端色斑樣黑素瘤，光化性角化病，腺癌，囊腺癌，腺瘤，腺肉瘤，腺鱗癌，星形細(xì)胞瘤，前庭大腺癌，基底細(xì)胞癌，支氣管腺癌，毛細(xì)血管瘤、癌、癌肉瘤，海綿狀膽管癌，軟骨肉瘤，脈絡(luò)絲乳頭狀瘤/癌，透明細(xì)胞癌，囊腺瘤，內(nèi)胚竇瘤，子宮內(nèi)膜增生，子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤，子宮內(nèi)膜腺癌，室管膜肉瘤，上皮樣肉瘤，尤因肉瘤，纖維板層樣癌，局灶性結(jié)節(jié)性增生，胃泌素瘤，生殖細(xì)胞瘤，成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，胰升糖素瘤，成血管細(xì)胞瘤，血管內(nèi)皮瘤，血管瘤，肝腺瘤，肝腺瘤病，肝細(xì)胞癌，胰島素瘤，上皮內(nèi)瘤形成，上皮間鱗狀細(xì)胞癌，侵襲性鱗狀細(xì)胞癌，大細(xì)胞癌，平滑肌肉瘤，惡性著色斑型黑素瘤，惡性黑素瘤，惡性間皮瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，髓上皮瘤，黑素瘤，腦膜腫瘤，間皮腫瘤，轉(zhuǎn)移性腫瘤，粘液上皮癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，神經(jīng)上皮腺癌，結(jié)節(jié)性黑色素瘤，燕麥細(xì)胞癌，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，骨肉瘤，胰腺多肽，乳頭狀漿液性腺癌，松果體細(xì)胞瘤，垂體瘤，漿細(xì)胞瘤，假肉瘤，肺母細(xì)胞瘤，腎細(xì)胞瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞癌，橫紋肌肉瘤，肉瘤，漿液性癌，小細(xì)胞癌，軟組織癌，抑生長素分泌細(xì)胞腫瘤，鱗癌，鱗狀細(xì)胞癌，間皮下、表淺蔓延型黑素瘤，未分化的癌，眼色素層黑色素瘤，疣狀癌，血管活性腸多肽瘤，充分分化的癌，和腎母細(xì)胞瘤。
優(yōu)選可用根據(jù)本發(fā)明的抗體分子治療的腫瘤是大量表達(dá)ErbB受體，尤其是ErbB1受體的實體腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移，諸如乳癌，前列腺癌，頭頸癌，SCLC，胰腺癌。
術(shù)語“生物學(xué)上/功能上有效的”或“治療上有效的(量)”是指這樣的藥物/分子，其能導(dǎo)致體內(nèi)或體外的生物學(xué)功能或生物學(xué)功能的改變，以及在哺乳動物，優(yōu)選在人類中能以特定量有效治療疾病或病癥。對癌癥而言，藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞的數(shù)量；降低腫瘤的大??；抑制(即，一定程度地減緩并優(yōu)選終止)癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中；抑制(即，一定程度地減緩并優(yōu)選終止)腫瘤的轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤的生長；和/或一定程度地減輕癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀。如果藥物可以阻止已存在癌細(xì)胞的生長且/或殺死已存在的癌細(xì)胞，則該藥物可能具有細(xì)胞抑制性和/或細(xì)胞毒性。對于癌癥的治療，療效可以例如通過估計疾病進(jìn)展時間(TTP)和/或測定反應(yīng)率(RR)來確定。
術(shù)語“免疫治療上有效的”是指引起哺乳動物免疫反應(yīng)的生物分子。更具體地，此術(shù)語是指可以識別和結(jié)合抗原的分子。典型地，抗體、含有其抗原結(jié)合位點(互補決定區(qū)，CDR)的抗體片斷和抗體融合蛋白是免疫治療上有效的。
“放射性療法”根據(jù)本發(fā)明，腫瘤還可以利用放射線或放射藥物進(jìn)行治療。放射源既可以位于要治療的患者體外也可以位于體內(nèi)。如果放射源位于患者體外，該治療方法稱作體外照射放療(EBRT)。如果放射源位于患者體內(nèi)，此治療稱為近距放射療法(BT)。已經(jīng)使用的一些典型的放射性原子包括鐳，銫-137，和銥-192，镅-241和金-198，鈷-57；銅-67；锝-99；碘-123；碘-131；以及銦-111。也可以用放射性同位素標(biāo)記本發(fā)明藥劑。當(dāng)前放射性療法是控制不能切除的或不宜手術(shù)的腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合放射性療法和化療可提高療效。放射性療法依據(jù)的原理是投射到靶區(qū)的高劑量輻射將導(dǎo)致腫瘤和正常組織中的增殖細(xì)胞的死亡。輻射劑量方案一般根據(jù)輻射吸收劑量(rad)，時間和分段進(jìn)行確定，并且必須由腫瘤專家進(jìn)行仔細(xì)確定?；颊呓邮艿妮椛淞繉⑷Q于各種因素，但兩個最重要的因素是腫瘤相對身體其它重要結(jié)構(gòu)或器官的位置，以及腫瘤擴(kuò)散的程度。對患者實施放射性療法的一個優(yōu)選療程是治療期持續(xù)5-6個星期，將50-60Gy總劑量按照每星期5天每天1次1.8-2.0Gy的劑量給患者分段施用。Gy是戈瑞的縮寫，是指100rad劑量。如果用本發(fā)明所述的抗ErbB抗體在放射方案背景下治療腫瘤，通?？捎^察到積極的甚至是協(xié)同的作用。換句話說，所述化合物如果與放射和/或化療劑組合，則對腫瘤生長的抑制作用將增強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明可任選地使用放射治療。其在不能對患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥劑的情況下是推薦和優(yōu)選的。
“藥物治療”就步驟而言，本發(fā)明的方法包括多種實施形式。例如，本發(fā)明的藥劑可以同時地、相繼地或獨立地使用。另外，藥劑可分開施用，兩次施用之間為約3周的時間間隔，即第二種藥劑在第一種活性劑施用后基本上立即開始施用到第一種藥劑施用后不超過約3周的時間開始施用。本方法可在手術(shù)之后進(jìn)行?；蛘?，手術(shù)可在施用第一種活性藥劑和第二種活性藥劑之間的間隔期內(nèi)進(jìn)行。此方法的實例是將本發(fā)明方法和外科腫瘤摘除手術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明方法的治療典型地包括以一個或多個施用周期施用本治療組合物。例如，當(dāng)進(jìn)行同時施用的時候，含有2種藥劑的治療組合物在單個周期內(nèi)施用大約2天到約3周。此后，治療周期可根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)生的判斷按需要進(jìn)行重復(fù)。類似地，如果進(jìn)行相繼施用，則每種治療劑施用的時間可調(diào)整到典型地覆蓋同樣的時間。兩周期之間的間隔可從約0到2個月不等。
本發(fā)明的藥劑可通過注射或隨時間逐漸輸注經(jīng)腸胃外施用。體內(nèi)待治療的組織用全身施用的方法一般就可進(jìn)行治療，因此最經(jīng)常使用的方法是靜脈內(nèi)給予治療組合物，但是當(dāng)目標(biāo)組織可能含有靶分子的時候，其他組織和施用方法也是可考慮的。因此，本發(fā)明的藥劑可經(jīng)眼內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，腔內(nèi)，經(jīng)皮，通過常位注射和輸注施用，而且還可以通過蠕動泵方式施用。例如，包括例如整聯(lián)蛋白拮抗劑的本發(fā)明治療組合物通常通過靜脈方式，例如以單位劑量注射施用。
本發(fā)明的治療組合物包含生理學(xué)可耐受的載體和溶解或分散于其中的作為活性成分的此處描述的相關(guān)藥劑。
如此處所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指代表如下物質(zhì)的組合物、載體、稀釋劑和試劑，所述物質(zhì)能施用于哺乳動物上而不會產(chǎn)生不期望的生理效應(yīng)如惡心，眩暈，反胃等。其中溶解或分散了活性成分的藥物組合物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，故無須在制劑的基礎(chǔ)上進(jìn)行限定。典型地，這種組合物可制成注射劑如液體溶液或懸液，但是，也可制成適于在使用前在液體中形成溶液或混懸液的固體形式。制劑也可進(jìn)行乳化?？蓪⒒钚猿煞趾推淞窟m用于此處描述的治療方法的藥學(xué)上可接受的并與活性成分兼容的賦形劑混合。
適當(dāng)?shù)馁x形劑是，例如，水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等以及這些的組合。另外，如果需要的話，組合物還可以包括小量的可增加活性成分效用的輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑，pH緩沖劑等。本發(fā)明治療組合物可包括其中的成分的藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(和多肽的游離氨基基團(tuán)成鹽)，所述酸是無機(jī)酸，例如，鹽酸或磷酸，或如乙酸，酒石酸，苦杏仁酸等有機(jī)酸。也可從無機(jī)堿，例如，鈉，鉀，銨，鈣或鐵的氫氧化物，以及有機(jī)堿如異丙胺，三甲基胺，2-乙氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因等，得到與游離羧基基團(tuán)形成的鹽。在環(huán)肽αv拮抗劑制劑中特別優(yōu)選使用HCl鹽。生理學(xué)上可耐受的載體是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。液相載體的例子為無菌水性溶液，其可以僅含有活性組分和水或可以還含有緩沖劑例如在生理pH值的磷酸鈉、生理鹽水或兩者，如磷酸緩沖鹽水。
此外，含水載體可以含有一種以上的緩沖鹽以及諸如氯化鈉和氯化鉀等鹽，葡萄糖，聚乙二醇和其他溶質(zhì)。液體組合物也可含有有水或無水的液相。這類其他液相的例子有甘油，植物油如棉籽油和水油乳液。
典型地，例如，對于形式為ErbB(ErbB1)受體阻斷抗體、整聯(lián)蛋白受體阻斷抗體或抗體片段或抗體綴合物或抗VEGF受體阻斷抗體、片斷或綴合物的免疫治療劑，治療有效量是在生理可耐受的組合物中施用時，足以使血漿濃度達(dá)到約0.01微克(μg)每毫升(ml)至約100μg/ml，優(yōu)選約1μg/ml至約5μg/ml，通常約5μg/ml的量。換言之，在一日或多日的每日一次或多次的施用中，劑量可在約0.1mg/kg至約300mg/kg，優(yōu)選約0.2mg/kg至約200mg/kg，最優(yōu)選約0.5mg/kg至約20mg/kg之間變化。當(dāng)免疫治療劑是單克隆抗體的片段或綴合物形式時，其用量可很容易地根據(jù)片段/綴合物的質(zhì)量相對于整個抗體的質(zhì)量的比例進(jìn)行調(diào)整。優(yōu)選的血漿摩爾濃度為約2微摩爾(μM)至約5毫摩爾(mM)，優(yōu)選約100μM至1mM抗體拮抗劑。
對于屬于非免疫治療性肽或蛋白質(zhì)多肽或其他類似大小的生物分子的本發(fā)明藥劑，其治療有效的量典型地為這樣的多肽量，即在生理可耐受的組合物中施用時足以使血漿濃度達(dá)到約0.1微克(μg)每毫升(ml)至約200μg/ml，優(yōu)選約1μg/ml至約150μg/ml的量。根據(jù)每摩爾有約500克質(zhì)量的多肽來計算，優(yōu)選的血漿摩爾濃度為約2微摩爾(μM)到約5毫摩爾(mM)，優(yōu)選約100μM至1mM多肽拮抗劑。
對于優(yōu)選為本發(fā)明的化學(xué)細(xì)胞毒性劑或化療劑(既不是免疫治療劑，也不是非免疫治療性肽/蛋白)的活性劑，其典型劑量為每公斤體重每天10mg至1000mg，優(yōu)選約20至200mg，更優(yōu)選的是50至100mg。
本發(fā)明的“藥物組合物”可包含能降低或避免伴隨本發(fā)明聯(lián)合療法出現(xiàn)的副反應(yīng)的藥劑(“輔助療法”)，其包括但不限于，如降低抗癌藥物毒性作用的藥劑，例如骨重吸收抑制劑，心臟保護(hù)藥物。所述的輔助藥劑可以防止或降低化療，放射治療或手術(shù)帶來的惡心和嘔吐的發(fā)生率，或降低施用骨髓抑制性抗癌藥物帶來的感染機(jī)率。輔助藥劑是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知的。此外，本發(fā)明的免疫治療劑還可以和佐劑如BCG和免疫系統(tǒng)刺激劑一起使用。而且，組合物可包括含有具有細(xì)胞毒性作用的放射性標(biāo)記同位素或其他細(xì)胞毒性劑如細(xì)胞毒性肽(例如細(xì)胞因子)或細(xì)胞毒性藥物等的免疫治療劑或化療劑。
術(shù)語用于治療腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移的“藥物試劑盒”，是指一種包裝以及通常地，藥劑在腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移治療方法中的使用說明書。本發(fā)明試劑盒中的藥劑一般被配制成本處所描述的治療組合物，因此可以采用任何適于試劑盒內(nèi)放置的形式。這些形式可以包括液體，粉末，片劑，混懸液等，以便提供本發(fā)明的藥物分子，優(yōu)選抗ErbB1抗體。這些藥劑可以在適合于根據(jù)本發(fā)明方法單獨施用的各單獨容器中提供，或可以在此包裝中的單一容器內(nèi)結(jié)合在組合物中提供。包裝中可含有足以按照此處描述的治療方法施用一次或多次的藥劑量。本發(fā)明試劑盒還包括包裝中所含材料的“使用說明”。
附圖簡述

圖1顯示利用流式細(xì)胞儀檢測到的MAb 425(EMD 72000)和c225(Cetuximab)單獨和聯(lián)合時與不同癌細(xì)胞(A431，SK-OV3，HCT 116，MiaPaca-2，KYSE-30，KYSE-70)的結(jié)合。
圖2顯示依賴于抗體(MAb 425、MAb 225，或二者的混合物)濃度的效應(yīng)子-靶細(xì)胞聚集。
圖3顯示MAb 425、MAb 225，或二者的混合物對EGF與A431腫瘤細(xì)胞結(jié)合的抑制。
圖4顯示MAb 425、MAb 225，或二者的混合物對A431癌細(xì)胞上結(jié)合的EGF的置換。
圖5顯示人源化MAb 425(EMD 72000)和嵌合MAb 225的混合物對A431細(xì)胞上EGF受體的下調(diào)。
實施例實施例1通過聯(lián)合兩種具有不同表位特異性的EGFR阻斷性抗體(Cetuximab，EMD 72 000)增加了結(jié)合在每細(xì)胞上的抗體。
將源自陰門表皮樣癌(A431)，卵巢腺癌(SK-OV-3)，結(jié)腸癌(HCT116)，胰腺癌(MiaPaca-2)和食管癌(KYSE-30，KYSE-70)的、表達(dá)不同EGFR水平的六種EGFR陽性人類腫瘤細(xì)胞系在冰上分別與10μg/mlCetuximab或EMD 72 000，或與最終含有2.5μg/ml Cetuximab和2.5μg/mlEMD 72 000(總Mab濃度5μg/ml)的混合物孵育15分鐘。然后洗滌細(xì)胞，將其在冰上與作為第二步驟試劑的20μg/ml FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG+IgM(H+L)-F(ab′)2再孵育15分鐘。洗滌后，用流式細(xì)胞儀(FACScan，Becton Dickinson)分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，該強(qiáng)度大致相當(dāng)于每一細(xì)胞所結(jié)合的抗體的量。
如顯示出的，與用于抗體混合物的減少的染色濃度無關(guān)，用該混合物染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在所有情況下均高于僅用較高濃度的兩種抗體之一染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(圖1)。
實施例2效應(yīng)子-靶細(xì)胞聚集是抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)的先決條件以及通過聯(lián)合具有針對人EGFR的不同表位的特異性的兩種抗體(Cetuximab和EMD 72 000)對其進(jìn)行改進(jìn)。
在該模型試驗中，將EGFR陽性A431細(xì)胞用作靶細(xì)胞。將EGFR陰性的，F(xiàn)c-γ受體(CD64(FcγRI)和CD32(FcγRII))陽性的U937組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞用于模擬效應(yīng)細(xì)胞。用綠色PKH2對A431細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，用紅色PKH26對U937細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后按照效應(yīng)子-靶細(xì)胞比率3∶1將兩種細(xì)胞系混合，將其在冰上分別與Cetuximab和EMD72 000的系列稀釋液(終濃度4.74-0.0015μg/ml＝3.16×10-8-1×10-11M，對全部抗體均以MW為150kDa計)，或與具有半數(shù)總免疫球蛋白濃度(2.37-0.00075μg/ml＝1.58×10-8-5×10-12M；該混合物中的各Mabs的濃度為該濃度的1/2)的兩種抗體的混合物的系列稀釋液孵育15分鐘。在50×g，4℃離心5分鐘后，在不破壞沉淀物的情況下，將細(xì)胞在冰上再孵育60分鐘。最后將沉淀物小心地再懸浮，采用FACScan儀器，通過流式細(xì)胞計測定聚集物的比例。
如圖2所示，與僅與一種單一抗體進(jìn)行孵育的細(xì)胞的所得結(jié)果相比，在與較低總蛋白質(zhì)濃度的二種Mabs的混合物孵育的樣品中聚集物的最大百分比增加。盡管與僅和一種Mabs孵育的樣品相比，這些樣品中的蛋白質(zhì)濃度降低，但抗體混合物的滴定曲線的增加部分并未出現(xiàn)顯著的移位。
實施例3針對EGFR配體-結(jié)合域的不同表位的兩種抗體的混合物增強(qiáng)了對EGF與A431腫瘤細(xì)胞的結(jié)合的抑制。
將A431細(xì)胞與0.5μg/ml EMD72 000、Cetuximab或相同濃度的二種抗體的混合物在冰上預(yù)孵育15分鐘。洗掉未結(jié)合的抗體后，將細(xì)胞與0.01、0.1、1或10μg/ml FITC標(biāo)記的來自小鼠頜下腺的EGF(Molecular ProbesEurope，Leiden，The NetHERlands)在冰上再孵育15分鐘，洗滌，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
兩種抗體均強(qiáng)烈地抑制EGF-FITC在所有濃度下的結(jié)合。但在所有情況下，二種抗體的混合物比單獨任一種抗體均更為有效(圖3)。
實施例4結(jié)合的EGF從A431細(xì)胞的EGFR上的置換。
將A431細(xì)胞與10μg/ml FITC標(biāo)記的來自小鼠頜下腺的EGF(Molecular Probes Europe，Leiden，The NetHERlands)在冰上預(yù)孵育15分鐘。
然后洗滌細(xì)胞，分別與10、1或0.1μg/ml EMD 72 000或Cetuximab或與二種抗體的2.5、0.25或0.025μg/ml混合物(總免疫球蛋白濃度5、0.5或0.05μg/ml)孵育15分鐘。然后洗滌細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析結(jié)合的EGF-FITC。
作為單一藥劑時兩種抗體以濃度依賴性的方式從A431細(xì)胞的EGFR上置換EGF。兩種抗體的混合物，其僅包含四分之一抗體濃度(總免疫球蛋白的1/2)的各Mab，在有效置換FITC標(biāo)記的配體方面與較高濃度的每種抗體相似。
實施例5A431細(xì)胞與Mabs孵育24小時后，具有至少兩種針對不同受體表位的抗體的混合物導(dǎo)致EGFR下調(diào)，但一種單一抗體不能或僅少量地降低細(xì)胞表面EGFR水平。
將包含10％FCS(胎牛血清)的2.5ml培養(yǎng)基中的2×106A431細(xì)胞接種在6-孔微量培養(yǎng)板的孔中。在培養(yǎng)物中加入終濃度為10μg/ml的抗體(Cetuximab，EMD 72 000)。使用兩種抗體的混合物，每種抗體的終濃度為10μg/ml(混合物1)或5μg/ml(混合物2)，分別導(dǎo)致總抗體濃度為20和10μg/ml。然后在存在抗體的情況下，于37℃和10％CO2孵育細(xì)胞24小時。
然后通過胰蛋白酶/EDTA(0.05/0.02％)處理收集細(xì)胞，洗滌，與20μg/ml FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG+IgM(H+L)-F(ab′)2(作為用于檢測表面結(jié)合的抗EGFR抗體的第二步驟試劑)，或者與用于檢測游離、未占據(jù)的EMD 72 000結(jié)合位點的10μg/ml FTTC標(biāo)記的MAb425(EMD72 000的鼠前期物質(zhì))在冰上孵育15分鐘。最后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。圖5顯示了EMD 72 000和其鼠前期物質(zhì)MAb425競爭與其在EGFR上的表位結(jié)合，而預(yù)結(jié)合的EMD 72 000幾乎完全抑制了MAb425-FITC的結(jié)合。與之相反，與未處理的對照細(xì)胞相比，預(yù)結(jié)合的Cetuximab僅最小程度地抑制MAb425-FITC的結(jié)合。這清楚地顯示了兩種抗體與EGFR的不同表位結(jié)合。此外，該圖顯示出在細(xì)胞孵育24小時后，在抗體混合物的兩種濃度下，用于檢測表面結(jié)合的抗體的FITC標(biāo)記的第二步驟試劑的熒光強(qiáng)度明顯降低。
這表明，與僅用抗體之一進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞相比，用抗體混合物處理的細(xì)胞的表面EGFR水平明顯降低。
因此，由MAb的混合物形成的較大受體-抗體復(fù)合物似乎與僅由借助一個抗體分子交聯(lián)后的兩個受體組成的小受體-抗體復(fù)合物采用不同的機(jī)制被內(nèi)在化和/或加工。
權(quán)利要求
1.藥物組合物，其包含能夠與位于相同或不同ErbB受體分子類型上的不同表位結(jié)合的第一和第二抗體分子或其部分，其中所述第一抗體分子或其部分包含與ErbB1受體分子類型上的第一特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點，而所述第二抗體分子包含與相同ErbB1受體分子類型上的第二特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中至少ErbB1受體分子類型上的所述第一或所述第二表位位于ErbB1受體結(jié)合域內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中ErbB1受體分子類型上的所述第一和所述第二表位位于ErbB1受體結(jié)合域內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的藥物組合物，其中所述受體結(jié)合域是所述ErbB1受體分子類型的天然配體的結(jié)合域。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3的藥物組合物，其中第一和第二抗體，或其片段，與所述ErbB1受體分子類型的天然配體的結(jié)合域內(nèi)的不同表位結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其中與包含僅和所述ErbB1受體分子類型上所述第一或所述第二表位結(jié)合的單一抗體分子的組合物相比，所述藥物組合物增強(qiáng)對ErbB受體的阻斷和/或抑制以及對ErbB受體-特異性信號通路下調(diào)的誘導(dǎo)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的藥物組合物，其中與包含僅和所述ErbB1受體分子類型上所述第一或所述第二表位結(jié)合的單一抗體分子的組合物相比，所述藥物組合物增強(qiáng)了對具有相同或不同特異性的ErbB受體分子的交聯(lián)和/或二聚化的誘導(dǎo)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述ErbB受體分子參與交聯(lián)和/或二聚化，且選自ErbB1和ErbB2(Her-2)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的藥物組合物，其中所述第一和/或所述第二抗體是單特異性抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項的藥物組合物，其中第一抗體是鼠的、嵌合的或人源化的MAb 425。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項的藥物組合物，其中第二抗體是鼠的、嵌合的或人源化的MAb 225。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的藥物組合物，其中所述第一抗體是人源化MAb 425(h425)而所述第二抗體是嵌合MAb 225(c225)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項的藥物組合物，其還包含細(xì)胞毒性劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是化療劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述化療劑選自順鉑、阿霉素、吉西他濱、多西他賽、紫杉醇、博來霉素。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述細(xì)胞毒性劑是ErbB受體抑制劑、VEGF受體抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、蛋白激酶A抑制劑、抗血管生成劑，或細(xì)胞因子。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項的藥物組合物，其中所述第一和/或所述第二抗體分子是免疫綴合物，其中抗體部分經(jīng)其C末端，任選地借助接頭肽與生物學(xué)上有效的肽、多肽或蛋白質(zhì)融合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中蛋白質(zhì)是細(xì)胞因子。
19.一種藥物試劑盒，其包含(i)第一包裝，其包含含有與ErbB1受體分子上存在的第一特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點的第一抗體分子或其部分，和(ii)第二包裝，其包含含有與相同ErbB1受體分子類型上的第二不同特異性表位結(jié)合的結(jié)合位點的第二抗體分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物試劑盒，其中至少ErbB1受體上的所述第一或所述第二表位位于ErbB1受體結(jié)合域內(nèi)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物試劑盒，其中ErbB1受體上的所述第一和所述第二表位位于ErbB1受體結(jié)合域內(nèi)。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21任一項的藥物試劑盒，其中至少一種所述分子與ErbB1受體的天然配體所結(jié)合的受體結(jié)合域內(nèi)的表位相結(jié)合。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22任一項的藥物試劑盒，其中所述第一抗體分子是鼠的、嵌合的或人源化的單克隆抗體425，而所述第二分子是鼠的、嵌合的或人源化的單克隆抗體225。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的藥物試劑盒，其包含第一包裝和第二包裝，第一包裝包含人源化MAb 425(h425)，第二包裝包含嵌合MAb 225(c225)。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24任一項的藥物試劑盒，其還包含第三包裝，該包裝包含細(xì)胞毒性劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的藥物試劑盒，其中所述細(xì)胞毒性劑是化療劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的藥物試劑盒，其中所述化療劑選自順鉑、阿霉素、吉西他濱、多西他賽、紫杉醇、博來霉素。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的藥物試劑盒，其中所述細(xì)胞毒性劑是ErbB受體抑制劑、VEGF受體抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、蛋白激酶A抑制劑、抗血管生成劑，或細(xì)胞因子。
29.如權(quán)利要求1-28任一項所述的藥物組合物或藥物試劑盒在制備用于治療腫瘤或腫瘤相關(guān)疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含不同的分子，優(yōu)選單克隆抗體，其中各分子分別包含可以與相同ErbB1受體結(jié)構(gòu)域中不同位點同時結(jié)合的表位。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的抗體是各自為鼠、嵌合或人源化形式的MAb 425和MAb 225。本發(fā)明涉及所述組合物在改善治療，優(yōu)選腫瘤治療中的用途和方法。
文檔編號A61K39/395GK1703243SQ200380101087
公開日2005年11月30日 申請日期2003年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月10日
發(fā)明者H-G·克賴施, J·施密特 申請人:默克專利有限公司