專利名稱：：用于去污過程驗(yàn)證的共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶的制作方法用于去污過程驗(yàn)證的共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶本發(fā)明涉及生物指示物領(lǐng)域，特別是涉及用于驗(yàn)證設(shè)計(jì)用來降低樣品中污染物的量或活性的處理過程的生物指示物。本發(fā)明還涉及制備這些指示物的方法以及其用途。已知各種各樣的生物指示物用于驗(yàn)證凈化和去污過程。這些指示物范圍從相對基礎(chǔ)的指示物——例如，使用簡單的“視覺評分”以評定過程是否是有效的那些——到依靠熱穩(wěn)定激酶作為報(bào)道酶(W02005/093085)的更高級的指示物。這些激酶基指示物是生物指示物領(lǐng)域中重要的發(fā)展，這提供了快速和靈敏的過程驗(yàn)證的工具。W02005/093085詳細(xì)描述以上提到的激酶基指示物的生產(chǎn)和應(yīng)用。概括地說，一般的指示物通過吸附熱穩(wěn)定激酶于固體載體如指示條或浸漬片之上進(jìn)行制備。指示物然后與待處理的樣品(包含污染物)一起被包括，而加上樣品的指示物經(jīng)歷處理過程。通過處理的指示物激酶的活性的降低然后與污染物的量或活性的減少相關(guān)聯(lián)。當(dāng)確定已知與污染物中的可接受減少相關(guān)聯(lián)的活性水平時(shí)，處理然后被認(rèn)為有效的?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些激酶基指示物的性能通過共價(jià)交聯(lián)熱穩(wěn)定激酶到生物成分可以被顯著地改善，其中生物成分是污染物的模擬/替代。這使得指示物更準(zhǔn)確地反映污染物對于處理過程的反應(yīng)，其又導(dǎo)致改善的指示物準(zhǔn)確性/靈敏性，和因此更少的“假”過程驗(yàn)證。有利地，生物成分可以是生物基質(zhì)或者混合物的一部分，例如，商業(yè)可獲得的測試污染物(Browne污染物、Edinburgh污染物等)、血液、神經(jīng)組織、食品、去雜的動物材料、血清、卵、粘液、或者配制以滿足使用者特定要求的測試污染物。這樣，激酶的量/活性的降低是基質(zhì)的不同性能的函數(shù)，其進(jìn)一步提高指示物的準(zhǔn)確性/靈敏性。這種類型的指示物也能夠監(jiān)測基質(zhì)或者混合物的特定成分的去除/失活。有利地，指示物可以被設(shè)計(jì)，使得熱穩(wěn)定激酶與基質(zhì)的最“困難”的成分連接以去除/失活(例如，在血液基質(zhì)中，血纖蛋白比血紅蛋白要難以去除得多)。這提供了處理過程的非常嚴(yán)格地驗(yàn)證。以上描述的指示物也具有提供快速、一步過程驗(yàn)證的優(yōu)點(diǎn)。這是與某些已知的驗(yàn)證指示物相比而言的，已知的驗(yàn)證指示物需要多個(gè)步驟用于驗(yàn)證并因此需要投入更長的時(shí)間和更大的努力。作為實(shí)例，WOOO/65344描述了使用酵母朊病毒作為朊病毒去污過程的生物指示物。在該過程的結(jié)束，操作員必須在進(jìn)一步的步驟中，測定酵母朊病毒的破壞以便驗(yàn)證該過程。相比之下，以上描述的指示物被設(shè)計(jì)為具有與模擬相關(guān)污染物(例如，朊病毒)的生物成分直接連接的指示物激酶，使得該成分的破壞與激酶活性的喪失是緊密聯(lián)系的。這樣，這些指示物能夠提供快速、一步的過程功效的指示。因此，本發(fā)明解決了提供可選的/改進(jìn)的激酶基生物指示物的問題。生物過程指示物在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供用于驗(yàn)證處理過程的生物過程指示物，在該處理過程中樣品中的污染物的量或者活性被降低，其中該指示物包括與生物成分共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶，條件是生物成分不是抗體。5在一個(gè)實(shí)施方式中，生物成分是污染物的模擬物或替代，因此對于處理過程以與污染物基本相同方式進(jìn)行反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對于在該說明書中公開的每種污染物和生物成分，生物成分可以與待進(jìn)行處理過程的樣品中的污染物相同、但是物理上與待進(jìn)行處理過程的樣品中的污染物不同，例如，如果污染物是蛋白質(zhì)，那么生物成分也可以是蛋白質(zhì)；如果污染物是血液蛋白質(zhì)，那么生物成分也是血液蛋白質(zhì)；如果污染物是DNA分子，那么生物成分也是DNA分子；如果污染物是RNA分子，那么污染物也是RNA，等等。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，生物成分可以不同于污染物。可以在本發(fā)明的指示物中使用的的生物成分的實(shí)例包括蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂類。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物成分包括選自血液蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)、病毒蛋白質(zhì)、真菌蛋白質(zhì)、和自聚集或淀粉狀形成蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，血液蛋白質(zhì)選自凝血蛋白(例如，凝血因子I、血纖蛋白肽、血纖蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物、凝血酶)、血清蛋白(例如，清蛋白和球蛋白)、血小板蛋白、血細(xì)胞糖蛋白和血紅蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)菌蛋白選自細(xì)菌菌毛蛋白(fimbrialprotein)(例如，來自大腸桿菌的CgsA和來自沙門氏菌的AgfA)、細(xì)菌毒素蛋白(toxinprotein)(例如，來自炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、肉毒桿菌(Clostridiumbotulium)的毒素)、細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白(例如，肽聚糖、脂蛋白)和細(xì)菌芽孢蛋白(例如，來自革蘭氏陽性細(xì)菌并具有與Clostridumtaeniosporam中的形成帶狀附器(ribbonappendage)的蛋白質(zhì)、chaplin蛋白、rodlin蛋白類似的序列或者總體結(jié)構(gòu))。在還另一個(gè)實(shí)施方式中，病毒蛋白選自病毒包膜蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒核心蛋白。合適地，病毒蛋白來自噬菌體病毒(例如，MS2和PP7蛋白)、諾瓦克病毒(例如，衣殼蛋白)、輪狀病毒(例如，VP2、VP6和VP7蛋白)、冠狀病毒(例如，SARSS、E和M蛋白)、藍(lán)舌病毒(例如，VP2蛋白)、人乳頭狀瘤病毒(例如，病毒主結(jié)構(gòu)蛋白，Li)、乙型肝炎病毒(例如，小的包膜蛋白HBsAg)、丙型肝炎病毒(例如，核心蛋白、El和E2蛋白)、流感病毒(例如，神經(jīng)氨酸酶和血細(xì)胞凝集素以及基質(zhì)蛋白)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如，衣殼VPO、1和3蛋白)、HIV(例如，Pr55gag、包膜蛋白)和登革熱B病毒(例如，包膜和預(yù)膜(premembnme)/膜(prM/M)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，真菌蛋白選自疏水蛋白(例如，來自裂褶菌的SC3、來自煙曲霉(Aspergillusfomigate)的RodA/B和來自酵母的等效蛋白質(zhì))、真菌芽孢蛋白、菌絲蛋白、真菌毒素和真菌朊病毒(例如，Sup35、HetS>URE2,Rnql,Newl)。在還另一個(gè)實(shí)施方式中，自聚集蛋白選自朊病毒(例如，PrPSe*PrPe、Sup35、HetS>Ure2,Rnql、New1)、朊病毒模擬蛋白、淀粉樣原纖維、來自活性淤泥中的絮凝物形成和絲狀細(xì)菌的細(xì)胞表面黏附素、β淀粉樣蛋白、Tau蛋白、多腺茄堿結(jié)合蛋白、單純皰疹病毒糖蛋白B、肺表面活性蛋白C、來自大腸桿菌的CsgA蛋白、來自沙門氏菌屬某種的AgfA蛋白、細(xì)菌菌毛蛋白、脫脂載脂蛋白(例如，脫脂載脂蛋白Al)、來自真菌屬某種的疏水蛋白(例如，來自裂褶菌的SC3、來自煙曲霉(Aspergillusfumigates)的RodA/B)、chaplins(例如，來自鏈霉菌屬某些種的ChpsA-H)、rodlins(例如，來自鏈霉菌屬某些種的RdlA和RdlB)、革蘭氏陽性芽孢外殼蛋白(例如，P29a、P29b、GP85和SpoVM類似物)和藤壺膠樣蛋白(例如，來自白脊藤壺(Balanusalbicostatus)的19kDa蛋白質(zhì)，和來自紅巨藤壺(megabalanusrosa)的20kDa蛋白質(zhì)和來自白脊藤壺的新方解石依賴膠樣蛋白質(zhì))。在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸選自DNA分子和RNA分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，核酸選自單鏈DNA(ssDNA)、單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈DNA(dsDNA)或雙鏈RNA(dsRNA)。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸源自神經(jīng)組織。在另一個(gè)實(shí)施方式中，糖類選自外泌多糖、脂多糖(EPS/LPS，有時(shí)稱為內(nèi)毒素)(例如，來自軍團(tuán)桿菌屬某種(Legionellaspecies)、大腸桿菌、葡萄球菌屬某禾中(Staphylococcusspecies)、鏈球菌屬某禾中(Streptococcusspecies)、單胞菌屬某種(Pseudomonasspecies)、不云力桿菌屬某種(Acinetobactorspecies)、彎曲桿菌屬某種(Campylobactorspecies)和芽孢桿菌屬某種(Bacillusspecies))、肽聚糖、植物、真菌和酵母的細(xì)胞壁成分(例如，殼多糖、木質(zhì)素、葡聚糖)、黏蛋白制備物、糖脂(特別是腦源糖脂)、糖蛋白(例如，細(xì)胞表面糖蛋白，Eaplp)、芽孢提取物(例如，來自芽孢桿菌屬某些種、梭菌屬某些種(Clostridalspp)和其它芽孢前體)、來自酵母被膜的多糖和無脊椎動物分泌物(例如，來自軟體動物凝膠(molluscangels))。在另一個(gè)實(shí)施方式中，脂類選自糖脂(例如，腦源糖脂)、神經(jīng)節(jié)苷脂(例如，神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂如GTlb、GTla和更普遍的細(xì)胞源的神經(jīng)節(jié)苷脂如GM1)和植物油和脂。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，生物組分是生物基質(zhì)的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，指示物與生物基質(zhì)共價(jià)連接。生物基質(zhì)可以是待被處理樣品的模擬物。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物基質(zhì)包括選自蛋白質(zhì)、脂類、核酸和糖類的一種或多種成分、或者其片段或衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，生物基質(zhì)可以包括蛋白質(zhì)的混合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，生物基質(zhì)可以包括選自血液、血清、清蛋白、粘液、卵、神經(jīng)組織、食物、去雜的動物材料和商業(yè)可獲得的測試污染物的一種或多種成分。在本發(fā)明的還另一個(gè)實(shí)施方式中，生物基質(zhì)包括選自凝血因子I、凝血酶、因子VIII、CaCl2和任選地清蛋白和/或血紅蛋白的一種或多種成分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，熱穩(wěn)定激酶與生物成分共價(jià)連接。在另一個(gè)實(shí)施方式中，熱穩(wěn)定激酶被基因或化學(xué)交聯(lián)到生物成分。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，生物成分以融合蛋白形式與熱穩(wěn)定激酶連接。本發(fā)明的指示物可以用于驗(yàn)證設(shè)計(jì)去除/失活污染物的處理過程，所述污染物選自蛋白質(zhì)、脂類、糖類和核酸。本發(fā)明的生物過程指示物還可以包括穩(wěn)定激酶的劑，例如金屬離子、糖、糖醇或者凝膠形成劑。本發(fā)明的指示物(包括任何生物基質(zhì))也可以通過用70%乙醇或異丙醇處理進(jìn)行“固定”。為了實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，指示物/基質(zhì)在70%異丙醇中室溫溫育30分鐘。這模擬了可以增加外科手術(shù)器械上的污染材料耐性的一種最常遇到的過程，并且因此提供監(jiān)測這些材料去除的有效方式的指示物。本發(fā)明的生物過程指示物可以被固定在固體載體中或者固定在固體載體上。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物過程指示物通過化學(xué)交聯(lián)或吸附固定在固體載體中，或者固定在7固體載體上。指示物可以通過熱穩(wěn)定激酶或者通過生物成分與固體載體連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，固體載體是指示條、浸漬片、或者珠子，并且任選地，進(jìn)一步包括連接固體載體到表面的工具(例如，用于利用螺絲釘、螺母和螺栓、或者夾子連接固體載體到表面的突出物、凹口或孔)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，固體載體是基質(zhì)并且指示物分散在基質(zhì)內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用于形成生物過程指示物的酶不是地衣酶、木聚糖酶、木糖苷酶、轉(zhuǎn)甲酰酶(formiltransferase)、Taq聚合酶、α-淀粉酶或β-葡糖苷酶。在本發(fā)明的還另一個(gè)實(shí)施方式中，提供包括以上描述的指示物的試驗(yàn)污染物。生物指示物的制備本發(fā)明的生物指示物可以通過共價(jià)連接熱穩(wěn)定酶到合適的生物成分進(jìn)行制備。可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的共價(jià)連接的任何合適的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，熱穩(wěn)定激酶被基因或化學(xué)交聯(lián)到生物成分，和在一個(gè)實(shí)施方式中，指示物作為融合蛋白制備。使用通常用于交聯(lián)蛋白質(zhì)生成酶交聯(lián)物或其它相關(guān)目的的一系列同雙功能試劑和異雙功能試劑可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)交聯(lián)。例如，在包括血纖蛋白作為生物成分的指示物中，血纖蛋白和熱穩(wěn)定激酶可以加入SPDP(Perbio)到伯胺基進(jìn)行衍生化。熱穩(wěn)定激酶然后可以被還原以生成活性巰基，并且然后其與血纖蛋白混合以產(chǎn)生共價(jià)的血纖蛋白-熱穩(wěn)定激酶鍵。在用偏高碘酸鹽處理目標(biāo)糖后，使用異雙功能試劑也可以將激酶化學(xué)交聯(lián)到糖類、脂類或其它復(fù)合糖。交聯(lián)可以使用如在實(shí)施例23中略述的多種化學(xué)實(shí)現(xiàn)。可選地，指示物可以作為融合蛋白制備。這通過將編碼合適的熱穩(wěn)定激酶的合成基因(例如，編碼來自嗜酸熱硫化葉菌或新阿波羅棲熱袍菌(Thermatoganeopolitana)的AK的基因)與編碼合適的生物成分的基因融合來實(shí)現(xiàn)。制備融合蛋白指示物的詳細(xì)方案在實(shí)施例中給出(參見例如，實(shí)施例10和13)。在生物指示物中使用的激酶在本發(fā)明的指示物中使用的激酶能夠生成在非常寬范圍內(nèi)可檢測的信號。一般而言，使用包括轉(zhuǎn)化為ATP的ADP的底物檢測激酶，ATP自身用于產(chǎn)生光，例如，使用螢光素/螢光素酶，使用發(fā)光計(jì)進(jìn)行檢測。當(dāng)激酶保持可檢測時(shí)——甚至在量/活性降低多個(gè)對數(shù)級后，寬范圍使得指示物特別適合于驗(yàn)證。對于無菌性，多數(shù)國家研究所認(rèn)為在無菌性可以被驗(yàn)證(確認(rèn))之前，根據(jù)需要，污染物的量或者活性降低6個(gè)對數(shù)級(61ogreduction)。本發(fā)明的指示物中使用的激酶提供了驗(yàn)證污染物的量或活性降低遠(yuǎn)超過6個(gè)對數(shù)級到8個(gè)對數(shù)級和更高的潛能。任何合適的激酶都可以被用作為本發(fā)明中的報(bào)道激酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，報(bào)道激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶、或它們的組合。在本發(fā)明中使用的報(bào)道激酶可以具有多種識別的三級結(jié)構(gòu)，例如，激酶可以是三聚體或單體激酶。這些三級結(jié)構(gòu)可能與激酶針對條件的提高的穩(wěn)定性相關(guān)，所述條件例如，諸如，溫度、pH、化學(xué)變性劑或者蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，報(bào)道激酶是源于選自以下生物的微生物激酶激烈熱球菌(Pyrococcusfuriousus)>P.abyssi、掘越氏熱球菌(Rhorikoshii)、沃氏熱球菌(Rwoesii)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、嗜酸熱硫化葉菌(S.acidocaldarius)、芝田硫化葉菌(S.shibatae)、海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermusmarinus)、極端嗜熱細(xì)菌(Thermococcuslitoralis)、海棲熱袍菌(Thermatogamaritima)、新阿波羅棲熱袍菌(Thermatoganeapolitana)禾口甲燒球菌屬某些種(Methanococcusspp.)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，激酶是硫化葉菌屬某種激酶或熱袍菌屬(Thermotoga)某種激酶。在還另一個(gè)實(shí)施方式中，激酶是酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.acidocaldarius)激酶、閃爍古生球菌(A.fulgidus)激酶、嗜熱泉生古細(xì)菌(敏捷氣熱菌，A.pemix)激酶、嗜火產(chǎn)液菌(A.pyrophilus)激酶、熱堅(jiān)芽孢桿菌(B.Caldotenax)BTl激酶、芽孢桿菌屬某種PS3激酶、嗜熱脂肪桿菌芽孢(B.stearothermophilus)11057激酶、嗜熱脂肪桿菌芽孢12001激酶、熱鏈形芽孢桿菌(B.thermocatenulatus)激酶、糞堆梭菌(C.stercocorarium)激酶、甲烷球菌某屬些種激酶、紅色曲霉(M.raber)激酶、Rabyssi激酶、激烈熱球菌(Rfuriosus)激酶、掘越氏熱球菌(Rhorikoshii)激酶、沃氏熱球菌激酶、海洋紅嗜熱鹽菌(R.marinus)激酶、嗜酸熱硫化葉菌激酶、芝田硫化葉菌激酶、硫磺礦硫化葉菌(S.solfataricus)激酶、產(chǎn)乙醇熱厭氧桿菌(T.ethanolicus)激酶、T.thermosulfurogenes激酶、速生棲熱分枝菌(T.celere)激酶、極端嗜熱細(xì)菌(T.litoralis)激酶、水生棲熱菌(T.aquaticus)YTl激酶、熱堅(jiān)棲熱菌(T.caldophilus)GK24激酶、嗜熱棲熱菌(T.thermophilus)HB8激酶、海棲熱袍菌(T.maritima)激酶或新阿波羅棲熱袍菌CTneapolitana)激酶。在又另一個(gè)實(shí)施方式中，激酶是極端嗜熱細(xì)菌激酶、海棲熱袍菌激酶、或新阿波羅棲熱袍菌激酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，報(bào)道激酶是熱穩(wěn)定的。也對高溫具有耐性，也發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定激酶對通常損傷或破壞蛋白質(zhì)或使它們失活的其它生物化學(xué)和物理過程也具有耐性，例如暴露于某些化學(xué)品例如離液劑、自由基損傷、去污劑、極端的pH、暴露于蛋白酶、蛋白交聯(lián)、非滲透性或者半滲透性膜或聚合物內(nèi)的包囊作用、或者不可逆固定于表面之上。(參見例如DanielRM,CowanDA,MorganHW,CurranMP,"Acorrelationbetweenproteinthermostabilityandresistancetoproteolysis"，BiochemJ.1982207641-4；ReesDC，RobertsonAD,“Somethermodynamicimplicationsforthethermostabilityofproteins"，ProteinSci.2001101187-94；BurdetteDS，TchernajenckoVV，ZeikusJG.”EffectofthermalandchemicaldenaturantsonThermoanaerobacterethanolicussecondary-alcoholdehydrogenasestabilityandactivity”,EnzymeMicrobTechnol.200027:11-18;ScandurraR，ConsalviV，ChiaraluceR,PolitiL，EngelPC.,"Proteinthermostabilityinextremophiles",Biochimie.l998Nov；80(11)933—41;禾口LiaoHH.,“ThermostablemutantsofkanamycinnucleotidyltransferasearealsomorestabletoproteinaseK,urea,detergents,andwater-miscibleorganicsolvents"，EnzymeMicrobTechnol.l993Apr；15(4)286-92，所有這些通過引用以整體并入本文)。適合于在本發(fā)明中使用的激酶的實(shí)例在以下的SEQIDNO.1-32中展示。在一個(gè)實(shí)施方式中，在本發(fā)明中使用的激酶與SEQIDNO.1-32具有至少70%、80%,85%,90%,95%,99%或100%的同一性。合適的報(bào)道激酶的其它實(shí)例可以在WOOO/46357和W02005/093085中發(fā)現(xiàn)，它們通過引用以整體并入本文。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，激酶活性使用ATP生物發(fā)光檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。9標(biāo)準(zhǔn)的螢光素_螢光素酶檢測方法可以檢測少至10_15摩爾的ATP。通過將酶擴(kuò)增與生物發(fā)光檢測方法相結(jié)合，檢測少至10_2°摩爾的激酶是可能的。生物指示物的穩(wěn)定對于增加酶例如激酶對熱失活的穩(wěn)定性的制劑的許多添加劑和改變，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。添加穩(wěn)定劑——如高達(dá)4M濃度的山梨醇，或高達(dá)2M濃度的其它多元醇如乙二醇、甘油或甘露醇——可以改進(jìn)酶的熱穩(wěn)定性。其它添加劑如木聚糖、海藻糖、明膠也可以單獨(dú)或組合地提供附加的穩(wěn)定效應(yīng)。添加一定范圍的二價(jià)金屬離子——最顯著地是Ca2+、Mg2+或Mn2+——也可以改進(jìn)酶的穩(wěn)定性。也可以用對酶的化學(xué)修飾來改進(jìn)它們的熱穩(wěn)定性。用乙醛酸對表面暴露的氨基的還原性烷基化(例如，Melik-Nubarov(1987)BiotechIetts9725-730)、向蛋白質(zhì)表面加入糖類(例如，Klibanov(1979)Anal.Biochem.931-25)和酰胺化(例如，Klibanov(1983)Adv.Appl.Microbiol.291-28)均可以增加酶的穩(wěn)定性。用于酶固定的其它方法-包括應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)劑和應(yīng)用多種聚合物載體(support)-也是增加酶的熱穩(wěn)定性的相關(guān)方法(在Gupta(1991)Biotech.Appl.Biochem.l41-11中綜述)。相似的修飾也與指示物對其它滅菌方法如過氧化氫或臭氧的穩(wěn)定相關(guān)。特別地，其中氣相殺菌劑向酶接近受到例如具有添加劑的合適聚合物或制劑中的包封的限制以降低氣體滲透的方法，將在需要時(shí)為增加酶的穩(wěn)定性提供有用方法。有效增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性的許多處理也與對抗蛋白酶處理的穩(wěn)定相關(guān)，例如，用于開發(fā)通過蛋白酶處理有效失活TSE因子的指示物。一般而言，表現(xiàn)出高水平熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)也可能對降解過程如變性或蛋白酶處理表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(參見，例如，DanielRM,CowanDA,MorganHW,CurranMP,"Acorrelationbetweenproteinthermostabilityandresistancetoproteolysis“，BiochemJ.1982207641-4；ReesDC,RobertsonAD,"Somethermodynamicimplicationsforthethermostabilityofproteins“，ProteinSci.2001101187-94；BurdetteDS,TchernajenckoVV,ZeikusJG.'EffectofthermalandchemicaldenaturantsonThermoanaerobacterethanolicussecondary-alcoholdehydrogenasestabilityandactivity",EnzymeMicrobTechnol.20002711-18;ScandurraR,ConsalviV，ChiaraluceR,PolitiL,EngelPC,"Proteinthermostabilityinextremophiles"，Biochimie.1998Nov;80(11)933-41;和LiaoHH.，“ThermostablemutantsofkanamycinnucleotidyltransferasearealsomorestabletoproteinaseK,urea,detergents,andwater-miscibleorganicsolvents“，EnzymeMicrobTechnol.1993Apr；15(4)286-92)。因此，與可能等效的嗜溫性激酶相比，熱穩(wěn)定激酶通常表現(xiàn)出對設(shè)計(jì)用來失活TSE因子的蛋白酶處理作用的更高程度的穩(wěn)定性。根據(jù)應(yīng)用的方法的類型，也可以選擇激酶，以便支持方法的其它特性。因此，對于堿性pH下的蛋白酶處理，方案趨向于應(yīng)用來自中度嗜堿生物如激烈熱球菌的熱穩(wěn)定激酶，而在酸性pH下的蛋白酶處理可應(yīng)用來自嗜酸性生物如嗜酸熱硫化葉菌或硫磺礦硫化葉菌的激酶。如果需要改進(jìn)激酶指示物對蛋白酶處理的穩(wěn)定性，存在許多其它選擇。這些選擇中的許多與上述針對熱處理穩(wěn)定酶的那些相同。例如，包含山梨醇、甘露醇或其它復(fù)合聚合物的制劑降低指示物表面上酶的失活水平。此外，特異降低蛋白酶底物降解速率的處理與此應(yīng)用特別相關(guān)。例如，在包含作為可選的蛋白酶底物起作用的、高達(dá)約lOmg/ml(比優(yōu)選的指示物濃度過量10倍)的合適的載體蛋白如酪蛋白或清蛋白的溶液中的激酶制劑，將特異地降低激酶指示物的消化速率。類似地，向制劑中加入游離氨基酸如甘氨酸、酪氨酸、色氨酸或二肽將提供底物水平的酶抑制方法并降低激酶指示物的局部失活。通過在細(xì)菌中重組表達(dá)產(chǎn)生的熱穩(wěn)定激酶也可以在本發(fā)明中使用。已經(jīng)顯示，酶的遺傳修飾提供熱穩(wěn)定性的顯著增加，通過類比，這樣的突變也可能顯著增強(qiáng)指示物酶在其它過程，如蛋白酶處理或氣相“滅菌”中的穩(wěn)定性。采用三聚體(古細(xì)菌)AKs的已經(jīng)確定的3-D結(jié)構(gòu)(Vonrheinetal(1998)J.MoI.Biol.282167-179和Criswelletal(2003)J.MoI.Biol.3301087-1099)，激酶熱穩(wěn)定性的比較已經(jīng)鑒定出影響酶穩(wěn)定性的氨基酸。示出改進(jìn)熱穩(wěn)定性的激酶的基因工程變體也在本發(fā)明中被使用，并且可以通過許多方式產(chǎn)生。必要地，這些涉及認(rèn)為形成三聚體分子的中央核心堆積區(qū)(centralcorepackingregion)的氨基酸的特異性位點(diǎn)定向誘變和隨機(jī)“定向進(jìn)化”方法，其中整個(gè)分子經(jīng)歷隨后的數(shù)輪誘變和對具有改進(jìn)性質(zhì)分子的選擇/篩選。特異性修飾的酶在SEQIDNO17-19(幾種變體被每一參考符號所包含)中提出。這些列出的修飾基于雜交方法，其中根據(jù)結(jié)構(gòu)相關(guān)分子之間觀察到的差異，應(yīng)用基于共有序列的方法，確定出可能影響酶的熱穩(wěn)定性的區(qū)域。隨后是確定將與最佳熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸引入的變化，或者確定在確定為熱穩(wěn)定性所必須的位置處引入每一可能氨基酸的隨機(jī)置換。通過增加基質(zhì)中的生物成分的濃度、或通過增加交聯(lián)的程度，可以改進(jìn)與作為基質(zhì)一部分的生物成分結(jié)合的指示物的穩(wěn)定性/耐性。作為實(shí)例，本發(fā)明的指示物之一應(yīng)用血纖蛋白-活性肽-激酶指示物以實(shí)現(xiàn)交聯(lián)入包含血纖蛋白例如血纖蛋白膜的生物基質(zhì)。通過改變血纖蛋白膜，例如，增加血纖蛋白的濃度，或者通過增加其交聯(lián)程度，有可能顯著增加指示物對特定過程的耐性。包含生物成分如Sup35的指示物的耐性可以通過促進(jìn)指示物的纖維化作用(fibrilisation)進(jìn)行增加。這提供具有更大物理穩(wěn)定性的分子，并且可以與監(jiān)測因子如朊病毒蛋白的滅活相關(guān)，其被認(rèn)為本質(zhì)上是多聚體的。在一個(gè)實(shí)施方式中，指示物被配制在選自蔗糖(例如，在多至下)、黏蛋白(例如，在多至0.5%w/v下)和清蛋白(例如，在多至lmg/ml下)的載體中。固體載體本發(fā)明的生物指示物可以連接到多種固體載體。載體可以具有或不具有化學(xué)修飾，并且可以包括多種制劑中的一種或多種指示物，這取決于，例如，待驗(yàn)證過程的需要。在一種形式中，載體是塑料、木材、陶瓷、玻璃、紡織品、鋼或其它金屬或聚合物表面，作為固定的手段，指示物在其上被干燥/交聯(lián)。載體可以是聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯條或浸漬片，任選地具有平坦表面，指示物被施加在該表面上。帶有用于連接指示物的多孔表面的其它類型的載體作為氣相過程的指示物也是特別有用的。塑料、木材、金屬或陶瓷珠子也可以為固體載體提供有價(jià)值的形式，這也與監(jiān)測氣相過程特定相關(guān)。對于某些應(yīng)用，這類載體具有優(yōu)勢，因?yàn)樗鼈優(yōu)檫B接指示物提供了明顯增加的表面積。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，固體載體是基質(zhì)并且指示物分散在基質(zhì)內(nèi)。在還另一個(gè)實(shí)施方式中，基質(zhì)是復(fù)合生物基質(zhì)。11將生物指示物固定在固體載體上使用現(xiàn)有技術(shù)已知的各種各樣的方法可以將本發(fā)明的指示物結(jié)合于固體載體上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，指示物通過如下概述的標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸附方法結(jié)合于固體載體上。在固體載體上結(jié)合指示物可以通過將蛋白質(zhì)連接到表面應(yīng)用的常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)，例如，將蛋白質(zhì)在約pH9.6的0.1M碳酸氫鈉緩沖液中，室溫下溫育約1小時(shí)?？蛇x地，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的寬范圍的偶聯(lián)化學(xué)制品的任意方法，將蛋白質(zhì)與表面共價(jià)連接。例如，用SPDP(Piercechemicals;采用制造商的說明書)衍生化、用DTT還原以提供用于交聯(lián)的游離巰基的腺苷酸激酶融合蛋白(例如，到Sup35)，被共價(jià)連接到帶有馬來酰亞胺表面的聚苯乙烯載體。帶有這樣的巰基結(jié)合表面的塑料表面在文獻(xiàn)中充分描述。這種連接方法的增加的益處是，如果需要，可以將酶從載體切割出來，例如，通過用DTT或MESNA還原，以使得對任何指示物載體單獨(dú)進(jìn)行分析。本申請中描述的指示物具有如下性質(zhì)它們在衍生并與這類載體交聯(lián)后保持活性?？蛇x地，應(yīng)用聚苯乙烯或聚碳酸酯載體上的胺活性表面，利用雙功能交聯(lián)劑如單體戊二醛，通過蛋白質(zhì)上的游離胺基提供激酶指示物的直接的不可切割交聯(lián)。也可以應(yīng)用紫外線(UV)處理直接將指示物連接到合適的載體?？梢杂门c塑料表面相似的方式處理鋼表面，以介導(dǎo)指示物的共價(jià)連接。寬范圍的蛋白交聯(lián)劑可以從公司如Piercechemicalcompany(Perbio)獲得。對巰基、氨基、羥基和羧基有活性的試劑被設(shè)計(jì)，用于偶聯(lián)蛋白質(zhì)，但是它們可以被平等地用于將蛋白質(zhì)交聯(lián)到天然反應(yīng)性的或包被的固體載體如塑料、其它聚合物、玻璃和金屬。也可以利用將酶與糖交聯(lián)的活性化學(xué)制品。例如，可以用試劑ΒΜΡΗ((Ν-[β_馬來酰亞胺基丙酸]酰胼·TFA)、KMUH((N-[k_馬來酰亞胺基十一酸]酰胼)和MPBH(4-(4-N-馬來酰亞胺基苯基)丁酸鹽酸酰胼)(4-(4-N-Maleimidophenyl)butyricacidhydrazidehydrochloride)將包含半胱氨酸殘基形式的游離巰基或還原產(chǎn)生巰基活性基團(tuán)的化學(xué)衍生蛋白質(zhì)的指示物與糖交聯(lián)。這對于固體載體特別重要，所述載體是復(fù)合糖(例如紙、纖維素基的膜、凝膠或樹脂)或者可用糖溶液包被或處理，以產(chǎn)生適當(dāng)?shù)幕钚员砻妗τ诿糠N類型的載體，指示物可以在增強(qiáng)結(jié)合和/或穩(wěn)定結(jié)合蛋白質(zhì)的溶液中配制。這樣的制劑包括包含多至10%(w/v)蔗糖、山梨醇、甘露糖、纖維素或聚乙二醇(PEG)的溶液。此外，指示物可以被配制為施加在合適載體的表面或腔內(nèi)的凝膠的一部分。實(shí)例包括藻酸鹽、瓊脂或聚丙烯酰胺基質(zhì)。指示物也可以包括穩(wěn)定指示物的劑，并且合適的穩(wěn)定劑選擇金屬離子、糖、糖醇和凝膠形成劑。為了便于指示物的應(yīng)用，指示物還可以包括將固體載體連接到表面的工具，例如，通過螺絲釘、螺母和螺栓、或者夾子連接載體到表面的突出物、凹口或孔。包含生物指示物的試劑盒在本發(fā)明的第二方面，提供了試劑盒，用于驗(yàn)證其中樣品中的污染物的量或活性被降低的處理過程，所述試劑盒包含12⑴根據(jù)本發(fā)明第一方面的生物過程指示物，和()熱穩(wěn)定激酶的底物。為了對激酶量/活性進(jìn)行測定，試劑盒可以包括檢測ATP的工具，例如螢光素/螢光素酶和任選的發(fā)光計(jì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，熱穩(wěn)定激酶的底物是ADP。從前面的對已知污染物的試驗(yàn)中，可以得出將污染物的量或活性的降低程度與激酶活性相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)，試劑盒從而也可以包括將激酶活性與一系列指定的污染物的量或活性的降低程度相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)查詢表(look-uptables)。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒用于檢測TSE失活。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，試劑盒用于監(jiān)測諾羅病毒(noroviras)失活。生物指示物的用途在第三方面，本發(fā)明提供使用與生物成分共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶作為生物過程指示物，用于驗(yàn)證降低樣品中的污染物的量或活性的處理過程。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物過程指示物根據(jù)本發(fā)明的第一方面進(jìn)行配制。在本發(fā)明的具體用途中，根據(jù)本發(fā)明第一方面的指示物是指示在清洗或失活步驟后污染物(例如感染因子)可能存在的方法中的報(bào)道分子。首先，包含指示物的樣品被暴露于清洗/滅活步驟(例如，選定的溫度、pH或蛋白酶濃度的一種或多種)。接著的步驟是通過熱處理去除任何污染酶活性，例如在60°C至80°C下至少10分鐘(即，在不顯著影響熱穩(wěn)定激酶的條件下)。指示物然后在30°C至70°C之間的溫度下與底物(例如，ADP)反應(yīng)，以使生成ATP。ATP的形成可以通過使用螢光素/螢光素酶和合適發(fā)光計(jì)的生物發(fā)光檢測，在20°C-30°C下測量10分鐘至1小時(shí)。從發(fā)光計(jì)讀出的光輸出給出殘留激酶活性的讀數(shù)，即，在暴露于清洗/滅活處理后的激酶活性?；谙惹霸从趩为?dú)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，通過將殘留激酶活性與處理樣品內(nèi)的污染物的可能存在相關(guān)聯(lián)，完成該方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品中的污染酶活性或ATP可以通過開始的處理步驟去除(例如，選定的溫度、pH或蛋白酶濃度)，然后加入指示物?，F(xiàn)在描述應(yīng)用本發(fā)明指示物監(jiān)測/驗(yàn)證多種過程。在一個(gè)實(shí)施方式中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證生物洗滌制備物在洗滌循環(huán)中的性能。雖然洗滌循環(huán)的驗(yàn)證將潛在地在家庭環(huán)境下應(yīng)用，但其最有優(yōu)勢的用途將是在衛(wèi)生保健、藥物或食品制備環(huán)境中，例如，用于驗(yàn)證與遭受或暴露于感染因子(例如，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)或諾瓦克病毒/諾沃克類病毒發(fā)作)的患者相關(guān)的床上用品、外衣或其它物品的去污。在本文中，本發(fā)明的指示物的優(yōu)勢是，它與生物材料如血液或其它體液相關(guān)。為了驗(yàn)證洗滌循環(huán)，指示物可被交聯(lián)在柔性棒(flexiblewand)、布條(stripofcloth)或適于包含在循環(huán)中的其它材料上。將指示物放入具有加載物的剩余物的洗滌器中。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以將指示物固定在洗滌器內(nèi)部上合適的儲存器中，以便于其回收。隨后進(jìn)行洗滌循環(huán)，并且在對加載物進(jìn)行任意的進(jìn)一步操作或處理之前，去除指示物并評價(jià)指示物，其中應(yīng)用已被校準(zhǔn)“讀數(shù)器(reader)”，以表示指示物中可接受水平的殘余激酶活性——可接受水平來自對過程中的合適洗滌性能的在前校準(zhǔn)和評定。這種評定可能包括污染物的總水平和微生物的可生存數(shù)，如應(yīng)用暴露于技術(shù)人員已知的合適的模型生物所評定的。根據(jù)校準(zhǔn)的讀數(shù)，加載物被進(jìn)行進(jìn)一步處理，或重復(fù)洗滌循環(huán)。在第二種實(shí)施方式中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證失活病毒的過程。環(huán)境中活病毒分離物的檢測是成問題的，特別是在與對速度和精確性要求嚴(yán)格的緊急情況相關(guān)時(shí)。本發(fā)明提供了開發(fā)使能夠基本上實(shí)時(shí)監(jiān)測去污步驟的指示系統(tǒng)的可能性。這對于在病毒因子爆發(fā)(例如，諾沃克類病毒)或蓄意釋放(如天花)后，衛(wèi)生保健和相關(guān)設(shè)備的表面去污是特別有價(jià)值的。驗(yàn)證病毒失活過程的指示物可以采取多種不同形式，例如，用于監(jiān)測噴灑或浸漬有殺病毒劑的區(qū)域的棒或浸漬片，或者用于監(jiān)測氣相去污過程的懸浮指示物。可選地，指示物可以在去污之前被噴灑在表面上，隨后通過擦拭該表面評定殘余激酶活性水平。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證細(xì)菌蛋白毒素、植物毒素如蓖麻毒蛋白和其它毒性蛋白質(zhì)、肽或肽類似物的蛋白酶降解。蛋白酶表現(xiàn)出降解寬范圍蛋白毒素的潛能，所述蛋白毒素是潛在的生物戰(zhàn)/生物恐怖襲擊制劑，包括肉毒桿菌毒素、炭疽毒素和蓖麻毒蛋白。它們也具有失活寬范圍的其它潛在毒性或有害蛋白或肽制劑的潛能，使得能夠?qū)Ρ砻?設(shè)備去污或?qū)ξ镔|(zhì)進(jìn)行安全處理。在本文中，本發(fā)明的指示物與待去污的表面/物質(zhì)一起接受蛋白酶去污過程。在該過程的最后，根據(jù)本發(fā)明方法評定指示物的殘余激酶活性。隨后將殘余激酶活性水平與特定蛋白毒素或毒素組的失活指數(shù)相關(guān)聯(lián)。假定活性水平等于或低于限定的指數(shù)值，則物質(zhì)可以被安全地處理或者表面/設(shè)備被返回使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，將合適的安全極限設(shè)置在失活指數(shù)的校準(zhǔn)中，以允許過程性能的任何變化。本發(fā)明中應(yīng)用的酶的附加穩(wěn)定性使其比寬范圍的其它酶指示物更確定地和更大動態(tài)范圍地進(jìn)行，所述其它酶指示物包括來自“熱穩(wěn)定”生物如嗜熱脂肪桿菌芽孢的指示物，如顯示來自嗜熱性生物的AKs的相對熱穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)所示(圖1，實(shí)施例2)。也可以用指示物驗(yàn)證洗凈藥物生產(chǎn)設(shè)備的蛋白酶去污過程。各種各樣的藥物產(chǎn)品應(yīng)用來自人或動物的材料，所述材料可能受到各種各樣因子的污染，包括脘病毒(TSE)因子和病毒(例如，西尼羅病毒、肝炎病毒、HIV)。當(dāng)材料來源是動物源(例如胎牛血清、馬免疫球蛋白)和中間處理階段可帶有增加特定樣品中未鑒定病原體濃度的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)可被加重。在制造批次之間應(yīng)用蛋白酶洗凈制造設(shè)備和裝置(例如，色譜柱、容器、管)的可能性有降低或消除這種風(fēng)險(xiǎn)的潛能，這甚至在污染物沒有被正式鑒定時(shí)。這對脘病毒因子是特別可靠的，例如，具有將感染因子積累和攜帶進(jìn)最終產(chǎn)物的顯著風(fēng)險(xiǎn)的血液分餾設(shè)備中的脘病毒因子。為了驗(yàn)證這種類型的過程，本發(fā)明的指示物理想地被配制為待浸入蛋白酶處理液的浸漬片，或者與待清潔設(shè)備排列連接的藥筒(cartridge)。通過在處理后評定指示物器件中殘余激酶活性水平，并將其與可接受的清潔水平相關(guān)聯(lián)，可以開發(fā)快速和性能可靠的監(jiān)測器。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證污染物如TSE的氣相失活。臭氧或其它氣相殺菌劑失活這種污染物的潛能被大量的出版物和文章所建議，14但是，沒有方法明確表現(xiàn)出是有效的。為了支持此氣相技術(shù)的開發(fā)和引入衛(wèi)生保健中，將需要驗(yàn)證該技術(shù)的性能的方法。由于因子如TSE已經(jīng)表現(xiàn)出遠(yuǎn)比傳統(tǒng)的病毒或細(xì)菌因子對這種形式的失活更具耐性，目前可利用的驗(yàn)證氣相失活的方法未必合適。本發(fā)明解決此問題。對于這種類型的驗(yàn)證，通過任何適當(dāng)方法將指示物連接在固體載體上，例如，普通吸附和通過酰胺、肽、羰基或半胱氨酸鍵的化學(xué)交聯(lián)。例如，對于臭氧滅菌，可以應(yīng)用剛性的聚氯乙烯(PVC)、玻璃、鋼、聚酰胺或聚丙烯載體，指示物通過以前描述的任一化學(xué)方法偶聯(lián)于載體。隨后將指示物包含在待滅菌的一批材料/器械中，暴露于臭氧，并針對設(shè)計(jì)用來評價(jià)懷疑因子相應(yīng)失活的適當(dāng)校準(zhǔn)的失活指數(shù)進(jìn)行評定。成功的失活使得能夠繼續(xù)加工或使用該材料/器械。指示物可以可選地被連接于管的內(nèi)表面或相當(dāng)?shù)膬?nèi)部空間，以便氣體滲透受到限制。這提供了監(jiān)測器，其適于評定氣體滲透入帶有腔的器械的相當(dāng)空間、或滲透通過填塞的材料裝載物?？蛇x地，可以將指示物連接于多孔材料如聚苯乙烯珠子，或者可以將其固定在凝膠或樹脂中。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，應(yīng)用指示物驗(yàn)證液體化學(xué)滅菌系統(tǒng)(例如，Endoclens)，如用于內(nèi)窺鏡和相關(guān)器械的處理。寬范圍的內(nèi)窺鏡常規(guī)用于醫(yī)療中，是醫(yī)學(xué)診斷和治療的重要部分。這些器械極度敏感并且對于常規(guī)清潔和消毒具有非常顯著的問題。傳統(tǒng)地，和在目前的實(shí)踐中仍然存在的，在用低溫方法去污之前手工清潔內(nèi)窺鏡。已經(jīng)開發(fā)出一些化學(xué)消毒劑和自動再處理裝置以解決對器械如內(nèi)窺鏡的敏感部件去污的具體問題，在這里傳統(tǒng)的高壓滅菌是不可能的。這些方法有助于降低難于清潔器械上的污染水平，該污染水平與寬范圍的病毒和細(xì)菌病原體的醫(yī)源性傳播相關(guān)。目前驗(yàn)證這種過程的方法是，監(jiān)測洗滌溶液的流速和溫度。本發(fā)明的指示物提供了驗(yàn)證的進(jìn)一步方法，所述方法提供了內(nèi)窺鏡腔內(nèi)實(shí)際清潔效率的讀數(shù)。對于這種類型的驗(yàn)證，指示物被連接于管的內(nèi)表面，該管被設(shè)計(jì)為具有和內(nèi)窺鏡管相似的總內(nèi)徑。此指示裝置被串聯(lián)連接于自動再處理裝置上的內(nèi)窺鏡。隨后用通常的方式處理內(nèi)窺鏡。在處理最后，優(yōu)選地在將內(nèi)窺鏡從裝置中移去之前，分離指示物并評定殘余的激酶活性水平。可以將活性水平與先前限定的該過程的可接受性能的閾值相關(guān)聯(lián)，并根據(jù)該評定結(jié)果，可以將內(nèi)窺鏡轉(zhuǎn)移用于額外的清潔或去污，或準(zhǔn)備應(yīng)用。如果性能水平不足，則可以用如前述連接的新的指示物再次處理該器械(用相同和更嚴(yán)格的條件)。指示裝置也適于驗(yàn)證內(nèi)窺鏡和/或任何其它帶有腔的器械的手工清潔。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，使用指示物監(jiān)測洗滌器-消毒器中的常規(guī)清潔性能，如在醫(yī)院中應(yīng)用的那些洗滌器-消毒器。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，應(yīng)用指示物監(jiān)測戊二醛或鄰苯二醛(ortho-phthaldehyde)(OPA)處理。多年來，戊二醛和甲醛已經(jīng)被廣泛用作殺菌劑?；瘜W(xué)消毒劑通過以非特異性方式多重交聯(lián)蛋白質(zhì)，以破壞其功能而起作用。近來，鄰苯二醛(OPA)作為此家族的新的消毒劑出現(xiàn)，并且由于它避免了與戊二醛相關(guān)的一些毒性問題而被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明的指示物適于監(jiān)測所有這種類型的化學(xué)消毒劑，原因是激酶對這種類型的非特異性交聯(lián)敏感。指示物可被共價(jià)連接于合適的表面并與待滅菌的其它物品一起暴露于化學(xué)殺菌劑。該過程的效率通過測定指示物的殘余酶活性來評定。將此活性與表明該過程正確性能的限定閾值相比較。不同類型激酶的應(yīng)用可以為該過程提供附加的靈敏度或敏感性，如不同應(yīng)用中可能所需要的。本說明書中描述的熱穩(wěn)定腺苷酸激酶可以根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)被廣義地歸為兩類。因此，來自硫化葉菌屬某種的酶是具有含中心疏水核心的三聚結(jié)構(gòu)的酶的例子，所述中心疏水核心是維持其在高溫下活性的主要決定因素。第二類酶是單體酶，由來自熱袍菌屬(Thermotoga)某種的腺苷酸激酶示例，但是其具有略長的多肽鏈，所述多肽鏈帶有影響活性部位的附加的“蓋(lid)”結(jié)構(gòu)域。這些不同類型的熱穩(wěn)定酶將對這類化學(xué)殺菌劑表現(xiàn)出不同的敏感性，這是由于在酶作用期間它們的肽鏈的可變?nèi)嵝?。對于任何特定的殺菌劑?或濃度，經(jīng)驗(yàn)篩選將鑒定出具有適當(dāng)敏感性的酶，用于監(jiān)測和驗(yàn)證這些類型的化學(xué)制品。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，應(yīng)用指示物作為環(huán)氧乙烷、過氧化氫或其它氣相過程的超高速讀出監(jiān)測器(ultra-rapidread-outmonitor)。目前，寬范圍的氣相殺菌劑被許多制造商用于細(xì)菌和病毒因子的常規(guī)消毒。目前方法利用氣體的氧化性質(zhì)破壞肽鍵。因此，本發(fā)明的激酶，由于它們的堅(jiān)韌的理化性質(zhì)，對提供非?？焖俚氖Щ钭x出是理想的。本實(shí)例中的指示物與先前描述的那些指示物相似，例如，與因子如TSE的臭氧失活相關(guān)的指示物。殺菌和除污染過程的特別有挑戰(zhàn)性的問題是驗(yàn)證大量液體無菌的能力，如在制造多種藥品或其它藥物產(chǎn)品中可能是必需的。雖然目前的方法監(jiān)測特定過程的溫度、時(shí)間、和/或壓力參數(shù)(根據(jù)其精確性質(zhì))，但驗(yàn)證大量液體中的實(shí)際殺菌情況的可利用方法極少——如果存在這類方法的話。這在甚至約1升體積內(nèi)是困難的，而在更大體積下幾乎是不可能的。本發(fā)明提供了許多解決此問題的可能方案。在其最簡單的形式中，可以將指示物加入待滅菌的液體中，指示物的濃度適于在過程最后測定激酶失活的限定水平和使該水平等同于滅菌水平。雖然這在某些類型的過程中可能不是所希望的，但激酶的惰性性質(zhì)和等效酶活性在所有生物中的普遍存在，使其可以接受?？山邮苄钥梢酝ㄟ^下列事實(shí)得到改進(jìn)許多熱穩(wěn)定酶是高度凝聚的，因此在接種到動物中之后具有非常低的免疫原性。當(dāng)這種直接添加不可接受時(shí)，可以將指示物加入到透析袋中大量液體、多孔容器中、或固定在合適的載體上，使得沒有指示物部分被釋放到大量液體中，但是滅菌條件以對全部樣品相同的方式在指示物上起作用。包含或固定蛋白質(zhì)、以允許液體樣品全面擴(kuò)散但是限制指示物樣品移動的寬范圍的可能方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？赡艿膶?shí)例包括但不限于透析膜、Visking管(Viskingtubing)、多孔膜、蛋白結(jié)合樹脂、剛性凝膠或固體載體，如對所論述的其它指示物所描述的?？梢杂们笆鋈我环椒?，將指示物連接于表面，或僅包封在合適的膜中而不連接，使得可以在過程完成時(shí)將指示物簡單地從大量液體中移出。驗(yàn)證處理過程的方法在第四方面，本發(fā)明提供驗(yàn)證用于降低樣品中污染物的量或活性的處理過程的方法，包括以下步驟16(a)獲得包含或者懷疑包含污染物的樣品；(b)在限定量的與生物成分共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶存在的情況下，進(jìn)行樣品處理過程；(c)測定殘余的激酶活性和任選地計(jì)算激酶活性的降低程度；和(d)將所述殘余激酶活性與預(yù)先確定的激酶活性相比較，或者將激酶活性的降低程度與預(yù)先確定的激酶活性降低程度相比較，其中所述預(yù)先確定的激酶活性或預(yù)先確定的激酶活性降低程度相應(yīng)于在相同處理?xiàng)l件下所述污染物量或活性的確認(rèn)的降低程度。有可能在步驟(a)中的樣品可以根本不包含任何污染物。在進(jìn)行處理后，驗(yàn)證的點(diǎn)是，確認(rèn)可能存在的任何因子已經(jīng)被去除/失活至可接受的程度。然而，一般而言，已知樣品包含或者懷疑包含污染物。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法的步驟(b)中使用的熱穩(wěn)定激酶被配制為根據(jù)本發(fā)明第一方面的指示物。在另一實(shí)施方式中，步驟(C)中的殘余激酶活性通過加入包含ADP的底物到殘余激酶并測量ATP形成進(jìn)行測量。ATP形成可以通過使用螢光素/螢光素酶和合適發(fā)光計(jì)的生物發(fā)光檢測進(jìn)行測量。典型地，操作者在處理樣品之前和處理樣品之后測定激酶活性。污染的激酶，通常是嗜溫性激酶，可以在激酶活性分析之前進(jìn)入樣品也是可能的。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，分析包括失活嗜溫性激酶的步驟，如在測定殘余激酶活性之前，在70°C處理樣品至少30分鐘、或在80°C至少10分鐘。在一個(gè)實(shí)施方式中，在螢光素/螢光素酶存在的情況下用發(fā)光計(jì)檢測時(shí)，激酶在處理之前的活性是每毫克激酶至少10,000,000相對光單位(RLU)，或者每毫克激酶至少8,000,0(K)RLU，或者每毫克激酶至少5,000,0(K)RLU，或者每毫克激酶至少3,000,000RLU,或者每毫克激酶至少1,000,000RLU，或者每毫克激酶至少500,000RLU。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)先確定的激酶活性小于每毫克激酶10,000RLU,或者小于每毫克激酶1000RLU，或者小于每毫克激酶500RLU，或者小于每毫克激酶250RLU，或者小于每毫克激酶100RLU，或者小于每毫克激酶10RLU，或者小于每毫克激酶1RLU，或者是每毫克激酶0RLU。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，預(yù)先確定的激酶活性降低程度等于或大于激酶活性1個(gè)對數(shù)級的降低(llogreduction)，或者2個(gè)對數(shù)級的降低，或者3個(gè)對數(shù)級的級降低，或者4個(gè)對數(shù)級的降低，或者5個(gè)對數(shù)級的降低，或者6個(gè)對數(shù)級的降低，或者7個(gè)對數(shù)級的降低，或者8個(gè)對數(shù)級的降低，或者9個(gè)對數(shù)級的降低。在另一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)先確定的激酶活性降低程度相應(yīng)于激酶的量或濃度3個(gè)對數(shù)級的降低，或者6個(gè)對數(shù)級的降低，或者7個(gè)對數(shù)級的降低，或者8個(gè)對數(shù)級的降低，或者9個(gè)對數(shù)級的降低。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，預(yù)先確定的激酶活性降低程度相應(yīng)于RLU降低至少800,000，或至少900,000，或至少950,000，或至少990,000，或至少999,000，或至少999,900，或至少999,990，或至少999,999RLU。在本發(fā)明的還另一個(gè)實(shí)施方式中，樣品中污染物量或活性的確認(rèn)降低程度是至少3個(gè)對數(shù)級(log)、6個(gè)對數(shù)級、優(yōu)選地至少7個(gè)對數(shù)級、更優(yōu)選地至少8個(gè)對數(shù)級、最優(yōu)選地至少9個(gè)對數(shù)級。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，持續(xù)處理直至殘余的激酶活性或激酶活性降低程度相應(yīng)于至少3個(gè)對數(shù)級、至少6個(gè)對數(shù)級、或至少7個(gè)對數(shù)級、或至少8個(gè)對數(shù)級、或至少9個(gè)對數(shù)級的污染物量或活性的確認(rèn)降低程度。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，方法還包括在合適的數(shù)據(jù)載體上記錄在步驟(C)中獲得的數(shù)據(jù)的步驟。相關(guān)聯(lián)的方法在第五方面，本發(fā)明提供將樣品中污染物的量或活性的降低程度與根據(jù)本發(fā)明第一方面描述的生物過程指示物的激酶活性相關(guān)聯(lián)的方法。該方法包括⑴制備包含限定量的污染物的樣品和包含限定量的根據(jù)本發(fā)明的第一方面的指示物的樣品，或者制備包含限定量的污染物和限定量的根據(jù)本發(fā)明的第一方面的指示物的單一樣品；()進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)樣品的處理；(iii)測定殘余的指示物激酶活性，和任選地計(jì)算激酶活性的降低程度；(iv)測定污染物的殘余量或殘余活性，和任選地計(jì)算污染物的量或活性的降低程度；(ν)重復(fù)步驟⑴至(v)，其中改變至少一個(gè)處理參數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，處理參數(shù)包括時(shí)間、溫度、pH、壓力、蛋白酶濃度、和殺菌劑或去污劑濃度中的一種或多種。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，處理包括在50-140°C、或80-100°C、或134-138°C下加熱樣品(一種或多種)；處理參數(shù)是時(shí)間；和使樣品(一種或多種)經(jīng)歷所述處理1、5、10、20、40和60分鐘時(shí)段，重復(fù)步驟(i)至(iv)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，處理包括將樣品(一種或多種)暴露于pH9_14或pH12或更高、或約pH12;處理參數(shù)是時(shí)間；和使樣品(一種或多種)經(jīng)歷所述處理1、5、10、20、40和60分鐘時(shí)段，重復(fù)步驟(i)至(iv)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，處理包括將樣品(一種或多種)暴露于濃度為0.5-2mg/ml、或約lmg/ml、或約2mg/ml的蛋白酶；處理參數(shù)是時(shí)間；和使樣品(一種或多種)經(jīng)歷所述處理1、5、10、20、40和60分鐘時(shí)段，重復(fù)步驟(i)至(W)。上述方法使得能夠制備校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，以用于對包含或懷疑包含污染物的樣品的處理進(jìn)行驗(yàn)證的指示物的將來應(yīng)用。許多處理過程的校準(zhǔn)在W02005/093085中描述。定義部分術(shù)語“污染物”包括源于生物源的感染因子和非感染因子。污染物的實(shí)例包含細(xì)菌、病毒、真菌、脘病毒、毒素、變應(yīng)原、芽孢、以上列出作為生物成分的任一的因子(劑)、和任一前述的片段和衍生物。在本發(fā)明的情況中，污染物也可以稱為污染生物因子(劑)。術(shù)語“交聯(lián)”指通過一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵連接兩個(gè)實(shí)體。交聯(lián)可以是化學(xué)的或者基因的?；蚪宦?lián)包括制備為融合蛋白的指示物。術(shù)語“樣品”包括任何物品、器械、表面、流體或材料。實(shí)例包括但不限于臨床樣品(例如全血，血清，口腔樣品如唾液，膿，陰道樣品，大便樣品，嘔吐物)、環(huán)境樣品(如水、土壤、空氣樣品)、外科器械和醫(yī)療器械、微孔板、浸漬片、側(cè)流式設(shè)備、醫(yī)院衣物、大量液體、去雜的動物材料、藥品、工作臺、墻壁和地板、生物基質(zhì)(biologicalmatrices)。術(shù)語“處理(treatment)”或“處理過程(treatmentprocess)”包括設(shè)計(jì)用來降低樣品中污染物的量或活性的任何過程。合適的處理包括下列中的一種或多種選擇的pH(例如，低于pHl、2、3、4、5、6或7，或高于pH7、8、9、10或11，或約pH12)、溫度(例如，至少40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C>110°C、120°C>130°C>140°C>I5OO或160°C，或在5O-I2OO之間)或壓力(例如，至少50kPa、70kPa、lOOkPa、150kPa>200kPa或250kPa)，將樣品暴露于蛋白酶或其它水解酶，將樣品暴露于去污劑、化學(xué)殺菌劑、輻射、自由基或氣相殺菌劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，將處理設(shè)計(jì)為降低感染性生物污染物如TSE的感染活性(也稱為感染性(傳染性))。術(shù)語“處理”或“處理過程”也包括清潔和失活過程，如利用濕或干蒸氣的高溫高壓滅菌、臭氧滅菌、H2O2滅菌、精煉(rendering)或設(shè)計(jì)用于消除或失活污染物的其它方法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，指示物和污染物都直接暴露于處理過程，即，在指示物/污染物和處理過程之間沒有密封或屏障。指示物和污染物因此都與處理過程直接接觸，和經(jīng)受相同的處理?xiàng)l件。術(shù)語“生物成分”包括可以與激酶共價(jià)連接的任何生物分子。生物成分可以選自蛋白質(zhì)、核酸、脂類或糖類。生物成分合適地是待處理的樣品中的污染物的模擬或替代，并且因此以與污染物基本相同的方式對處理過程反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，對于在本說明書中公開的每一種污染物和生物成分，生物成分可以與經(jīng)受處理過程的樣品中的污染物相同，但是與其物理上不同，例如，如果污染物是蛋白質(zhì)，那么生物成分也是蛋白質(zhì)；如果污染物是血液蛋白質(zhì)，那么生物成分也是血液蛋白質(zhì)；如果污染物是DNA分子，那么生物成分也是DNA分子；如果污染物是RNA分子，那么生物成分也是RNA分子，等等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，生物成分不同于污染物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，生物成分不是肽、蛋白質(zhì)、或多肽。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，生物成分不是寡核苷酸(對HPV16特異的寡核苷酸探針)。在本發(fā)明的還另一個(gè)實(shí)施方式中，生物成分不是凝集素、生長因子、DNA/RNA適配體、噬菌體或者對分析物特異性的結(jié)合因子。術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括任何含有蛋白質(zhì)或肽的分子。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”在本說明書中可以互換使用。術(shù)語“血液蛋白”包括在血液中存在的任何蛋白質(zhì)。特定的實(shí)例包括凝血蛋白(例如，凝血因子I、血纖蛋白肽、血纖蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物、凝血酶)、血清蛋白(例如，清蛋白和球蛋白)、血小板、血細(xì)胞糖蛋白和血紅蛋白。術(shù)語“細(xì)菌蛋白”包括源于細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)。具體實(shí)例包括細(xì)菌菌毛蛋白(例如，來自大腸桿菌的CgsA和來自沙門氏菌的AgfA)、細(xì)菌毒素蛋白(例如，來自炭疽桿菌、白喉棒狀桿菌、肉毒桿菌的毒素)、細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白(例如，來自活性淤泥中的絮凝物形成和絲狀細(xì)菌的細(xì)胞表面黏附素、肽聚糖、脂蛋白)和細(xì)菌芽孢蛋白(例如，來自革蘭氏陽性細(xì)菌并具有與Clostridumtaeniosporum中的形成帶狀附器的蛋白質(zhì)、來自鏈霉菌屬某些種的chaplin蛋白A-H以及rodlin蛋白RdlA和RdlB類似的序列或者總體結(jié)構(gòu))。19術(shù)語“病毒蛋白”包括源于病毒的任何蛋白質(zhì)。具體實(shí)例包括病毒外殼蛋白、病毒包膜蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒核心蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，病毒蛋白來自于噬菌體病毒(例如，MS2和PP7外殼蛋白)、諾瓦克病毒(例如，衣殼蛋白)、輪狀病毒(例如，VP2、VP6和VP7蛋白)、冠狀病毒(例如，SARSS、E和M蛋白)、藍(lán)舌病毒(例如，VP2蛋白)、人乳頭狀瘤病毒(例如，病毒主結(jié)構(gòu)蛋白，Li)、乙型肝炎病毒(例如，小包膜蛋白HBsAg)、丙型肝炎病毒(例如，核心蛋白，El和E2蛋白)、流感病毒(例如，神經(jīng)氨酸酶和血細(xì)胞凝集素以及基質(zhì)蛋白)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(例如，衣殼VPO、1和3蛋白)、HIV(例如，Pr55gag，包膜蛋白)和登革熱B(例如，包膜和預(yù)膜/膜(prM/M)。術(shù)語“真菌蛋白”包括源于真菌的任何蛋白質(zhì)。具體實(shí)例包括疏水蛋白(例如，來自裂褶菌的SC3、來自煙曲霉的RodA/B和來自酵母的等效蛋白質(zhì))、真菌芽孢蛋白、菌絲蛋白、真菌毒素和真菌朊病毒(例如，Sup35、HetS>Ure2、RnqUNewl)。術(shù)語“自-聚集蛋白質(zhì)”包括能夠自聚集或自組裝成淀粉樣原纖維或表面活性生物膜的任何蛋白質(zhì)。具體實(shí)例包括朊病毒(例如，PrP和PrP\HetS、Ure2、RnqUNew1),阮病毒模擬蛋白、淀粉樣原纖維、來自活性淤泥中的絮凝物形成和絲狀細(xì)菌的細(xì)胞表面黏附素、β淀粉樣蛋白、Tau蛋白、多腺茄堿結(jié)合蛋白、肺表面活性蛋白C、來自大腸桿菌的CsgA蛋白、來自沙門氏菌屬某種的AgfA蛋白、細(xì)菌菌毛蛋白、脫脂載脂蛋白(例如，脫脂載脂蛋白Al)、來自真菌屬某種的疏水蛋白(例如，來自裂褶菌的SC3、來自煙曲霉的RodA/B)、chaplins(例如，來自鏈霉菌屬某些種的ChpsA_H)、r0dlinS(例如，來自鏈霉菌屬某些種的RdlA和RdlB)、革蘭氏陽性芽孢外殼蛋白(例如，P29a、P29b、GP85和SpoVM類似物)和藤壺膠樣蛋白(例如，來自白脊藤壺的19kDa蛋白、和來自紅巨藤壺的20kDa蛋白以及來自白脊藤壺的新方解石依賴的膠樣蛋白質(zhì))。術(shù)語“核酸”包括任意長度或組成的核苷酸聚合物。具體實(shí)例包括DNA分子和RNA分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸選自單鏈DNA(ssDNA)、單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈DNA(dsDNA)或雙鏈RNA(dsRNA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述分子源自神經(jīng)組織。術(shù)語“糖類(糖)”包括任何包含糖的分子。具體實(shí)例包括外泌多糖、脂多糖(EPS/LPS,有時(shí)稱為內(nèi)毒素)(例如，來自軍團(tuán)桿菌屬、大腸桿菌、葡萄球菌屬某種、鏈球菌屬某種、假單胞菌屬某種、不動桿菌屬某種、彎曲桿菌屬某種和芽孢桿菌屬某種)、肽聚糖、植物、真菌和酵母的細(xì)胞壁成分(例如，殼多糖、木質(zhì)素、葡聚糖)、黏蛋白制備物、糖脂(特別是腦源性糖脂)、糖蛋白(例如，細(xì)胞表面糖蛋白，Eaplp)、芽孢提取物(例如，來自芽孢桿菌屬某些種、梭菌屬某些種和其它芽孢前體)、來自酵母被膜的多糖和無脊椎動物分泌物(例如，來自軟體動物凝膠)。術(shù)語“脂類”包括任何包含脂的分子。具體實(shí)例包括糖脂(例如，腦源糖脂)、神經(jīng)節(jié)苷脂(例如，GTlb、GTla和GM1)和植物油和脂?！稗D(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物”是為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物的任何分子。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是催化在游離胺基(例如，結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的賴氨酸)和結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的谷氨酰胺的Y-酰胺基(carboxamidgroup)之間形成共價(jià)鍵的酶家族(EC2.3.2.13)。這類酶的實(shí)例包括因子VIII、角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。血纖蛋白是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物的一個(gè)實(shí)例，其通過因子VIII作用?！吧锘|(zhì)或混合物”可以包括選自蛋白質(zhì)、脂類、核酸和糖類的一種或多種成分。在一個(gè)實(shí)施方式中，它可以是蛋白質(zhì)的混合物，或可以包括血液、血清、粘液、卵、神經(jīng)組織、食品或者去雜的動物材料中的一種或多種。生物基質(zhì)或混合物也可以是商業(yè)可得的測試污染物，如Browne污染物或者Edinburgh污染物。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物基質(zhì)/混合物具有與其中污染物存在的基質(zhì)/混合物類似的組成。在本發(fā)明的情況中，生物基質(zhì)也可以稱為測試污染物。作為污染物的“模擬(模擬物)”或“替代(替代物)”的生物成分是以與污染物非常類似(或者基本相同)方式對處理過程進(jìn)行反應(yīng)的成分。類似地，作為樣品的“模擬”或“替代”的生物基質(zhì)是具有與樣品類似組成的基質(zhì)，并且其以基本相同方式對處理過程進(jìn)行反應(yīng)。術(shù)語“抗體”包括全長免疫球蛋白和其所有的片段及衍生物，例如免疫球蛋白的重鏈、輕鏈、恒定區(qū)、可變區(qū)、Fab區(qū)、Fc區(qū)等。術(shù)語“血纖蛋白”包括所有的血纖蛋白-衍生的肽。這包括全長血纖蛋白肽和其所有的片段及衍生物。它包括所有具有血纖蛋白活性的肽，例如，通過因子VIII作用以形成凝塊的肽。術(shù)語血纖蛋白或血纖蛋白肽在整個(gè)本說明書中與術(shù)語“轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物”可以互換使用。術(shù)語“光輸出”指通過ATP與生物發(fā)光試劑反應(yīng)發(fā)出的光。該光輸出可以使用完全常規(guī)技術(shù)進(jìn)行檢測，例如標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)光計(jì)(例如，BertholdOrion96-孔微孔板發(fā)光計(jì)，或手持發(fā)光計(jì))。術(shù)語“報(bào)道激酶”指在被測試樣品中不固有存在的激酶，即，激酶對于樣品是外源的。報(bào)道激酶作為單獨(dú)的試劑加入樣品，例如，作為分離的激酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，報(bào)道激酶是熱穩(wěn)定的。術(shù)語“熱穩(wěn)定激酶”指在暴露于熱之后仍保留活性的激酶，即，其相對不受高溫影響。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在暴露于50-120°C之間的溫度后，熱穩(wěn)定激酶保留至少70%活性(或80%活性、90%活性、95%活性、或100%活性)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在暴露于40°C30分鐘后、或暴露于50°C30分鐘后、或暴露于60°C30分鐘后、或暴露于70°C30分鐘后、或暴露于80°C20分鐘后、或暴露于90°C10分鐘后、或暴露于120°C3分鐘后，熱穩(wěn)定激酶保留至少70%活性(或80%活性、90%活性、95%活性、或100%活性)。熱穩(wěn)定激酶對于一系列常規(guī)損傷或破壞蛋白質(zhì)或使它們失活的其它生化和物理過程也可以比非熱穩(wěn)定激酶更有耐性，例如，暴露于某些化學(xué)制品，如離液劑、自由基損傷、去污劑、極端pH、暴露于蛋白酶、蛋白交聯(lián)、非滲透性或者半滲透性膜或聚合物內(nèi)的包囊作用、或者不可逆固定于表面之上。在特定的實(shí)施方式中，在暴露于以上描述的生化和物理過程中的一種或多種之后，熱穩(wěn)定激酶保留至少70%活性(或80%活性、90%活性、95%活性、或100%活性)。在所有的情況中，該“保留活性”可以使用常規(guī)檢測容易地確認(rèn)。簡單地說，激酶在給定處理?xiàng)l件下與ADP—起溫育給定量的時(shí)間，然后通過使用螢光素/螢光素酶和發(fā)光計(jì)檢測ATP生成來分析殘留的活性。根據(jù)這個(gè)，處理后保留的激酶活性％可以被測定。術(shù)語“激酶”和“激酶活性”在該整個(gè)說明書中可互換使用。術(shù)語“生物發(fā)光試劑”指能夠與ATP反應(yīng)產(chǎn)生光的任何物質(zhì)或者物質(zhì)的混合物，例如，螢光素和螢光素酶的混合物。術(shù)語“RLU”意味著相對光單位(RelativeLightUnit)。相對光單位是相對的，不是絕對的測定值。說明書中給出的圖涉及用帶有進(jìn)樣系統(tǒng)的BertholdOrion96孔微孔板發(fā)光計(jì)，用“閃光型(flash)”光測定法取得的測定值，該測定值在加入螢光素/螢光素酶試劑后2秒鐘立刻測得(光電倍增管的技術(shù)規(guī)范測定在波長300-650nm發(fā)射的光)。為了解決此問題，制造商生成了用于RLU“因數(shù)”的數(shù)據(jù)，這使得能夠針對校準(zhǔn)過的標(biāo)準(zhǔn)品對給定發(fā)光計(jì)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。因此，可以在不同器械間進(jìn)行比較。BertholdOrion96孔微孔板發(fā)光計(jì)的RLU因數(shù)是1。因此，本說明書給出的RLU值可以被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)化的/歸一化的RLU值。關(guān)于絕對值，RLU值可以與使用方法中描述的試劑給出所述值所需的ATP濃度相關(guān)。作為近似的轉(zhuǎn)化，和給出RLU值和ATP濃度之間的線性關(guān)系，可以應(yīng)用下列值權(quán)利要求1.驗(yàn)證處理過程的生物過程指示物，在所述處理過程中樣品中的污染物的量或者活性降低，其中所述指示物包括與生物成分共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶，條件是所述生物成分不是抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物過程指示物，其中所述生物成分選自蛋白質(zhì)、核酸、脂和糖。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物過程指示物，其中所述蛋白質(zhì)選自血液蛋白質(zhì)、細(xì)菌蛋白質(zhì)、病毒蛋白質(zhì)、真菌蛋白質(zhì)、和自聚集蛋白質(zhì)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物過程指示物，其中所述血液蛋白質(zhì)選自凝血蛋白、血清蛋白、血小板蛋白、血細(xì)胞糖蛋白和血紅蛋白。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物過程指示物，其中所述凝血蛋白選自血纖蛋白、凝血因子I和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物過程指示物，其中所述細(xì)菌蛋白選自細(xì)菌菌毛蛋白、細(xì)菌毒素蛋白、細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白和細(xì)菌芽孢蛋白。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物過程指示物，其中所述病毒蛋白選自病毒衣殼蛋白、病毒包膜蛋白和病毒核心蛋白。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物過程指示物，其中所述病毒蛋白來自噬菌體病毒、諾瓦克病毒、輪狀病毒、冠狀病毒、藍(lán)舌病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎或丙型肝炎病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、HIV病毒和登革熱B病毒。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物過程指示物，其中所述真菌蛋白選自疏水蛋白、真菌芽孢蛋白、菌絲蛋白、真菌毒素和真菌朊病毒。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物過程指示物，所述自聚集蛋白選自朊病毒、朊病毒模擬蛋白、淀粉樣原纖維、來自活性淤泥中的絮凝物形成和絲狀細(xì)菌的細(xì)胞表面黏附素、β淀粉樣蛋白、Tau蛋白、多腺茄堿結(jié)合蛋白、單純皰疹病毒糖蛋白B、肺表面活性蛋白C、細(xì)菌菌毛蛋白、脫脂載脂蛋白、疏水蛋白、chaplins、rodlins、革蘭氏陽性芽孢外殼蛋白和藤壺膠樣蛋白。11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物過程指示物，其中所述核酸選自DNA分子或RNA分子。12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物過程指示物，其中所述糖選自外泌多糖、脂多糖、肽聚糖、殼多糖、葡聚糖、木質(zhì)素、黏蛋白、糖脂、糖蛋白、芽孢提取物、來自酵母被膜的多糖和無脊椎動物分泌物。13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物過程指示物，其中所述脂選自糖脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。14.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的生物過程指示物，其中所述指示物是生物基質(zhì)的部分。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物過程指示物，其中所述生物基質(zhì)是所述樣品的模擬。16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的生物過程指示物，其中所述生物基質(zhì)包括選自血液、血清、清蛋白、粘液、卵、神經(jīng)組織、食物、去雜的動物材料和商業(yè)可得的測試污染物的一種或多種成分。17.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的生物過程指示物，其中所述污染物選自蛋白質(zhì)、核酸、脂和糖。18.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的生物過程指示物，其中所述熱穩(wěn)定激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶。19.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的生物過程指示物，其中所述指示物還包括穩(wěn)定所述激酶的劑。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的生物過程指示物，其中所述穩(wěn)定劑選自金屬離子、糖、糖醇或者凝膠形成劑。21.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的生物過程指示物，其中所述生物成分和所述激酶以融合蛋白的形式連接在一起。22.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的生物過程指示物，其中所述生物過程指示物被固定在固體載體中或固體載體上。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的生物過程指示物，其中所述生物過程指示物通過化學(xué)交聯(lián)或吸附固定在所述固體載體中或所述固體載體上。24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的生物過程指示物，其中所述固體載體是指示物條、浸漬片或珠子。25.用于驗(yàn)證其中樣品中的污染物的量或者活性降低的處理過程的試劑盒，包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的生物過程指示物，和(b)用于熱穩(wěn)定激酶的底物。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中用于所述熱穩(wěn)定激酶的所述底物是ADP。27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的試劑盒，還包括螢光素/螢光素酶。28.根據(jù)權(quán)利要求25-27任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包括將所述指示物的激酶活性與所述污染物的量或活性相關(guān)聯(lián)的查詢表。29.與生物成分共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶作為生物過程指示物的用途，其驗(yàn)證降低樣品中的污染物的量或活性的處理過程。30.根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的生物指示物的用途，用于驗(yàn)證降低樣品中的污染物的量或活性的處理過程。31.驗(yàn)證降低樣品中的污染物的量或活性的處理過程的方法，其包括下列步驟a)獲得包含或懷疑包含污染物的樣品；b)在限定量的包含與生物成分共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶的生物過程指示物存在的情況下，對所述樣品進(jìn)行處理過程；c)測定殘余的激酶活性和任選地計(jì)算激酶活性的降低程度；和d)將所述殘余激酶活性與預(yù)先確定的激酶活性比較，或者將所述激酶活性的降低程度與預(yù)先確定的激酶活性降低程度比較，其中所述預(yù)先確定的激酶活性或所述預(yù)先確定的激酶活性的降低程度相應(yīng)于在相同處理?xiàng)l件下所述污染物的量或活性的確認(rèn)的降低程度。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中步驟(b)中的所述生物過程指示物是根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的生物過程指示物。33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述預(yù)先確定的激酶活性降低程度是至少3個(gè)對數(shù)級降低、或至少6個(gè)對數(shù)級降低、或至少7個(gè)對數(shù)級降低、或至少8個(gè)對數(shù)級降低。34.根據(jù)權(quán)利要求31-33任一項(xiàng)所述的方法，其中所述污染物的量或活性的所述確認(rèn)的降低程度是至少3個(gè)對數(shù)級降低、或至少6個(gè)對數(shù)級降低、或至少7個(gè)對數(shù)級降低、或至少8個(gè)對數(shù)級降低。35.根據(jù)權(quán)利要求31-34任一項(xiàng)所述的方法，包括在處理所述樣品之前和處理所述樣品之后測量激酶活性。36.根據(jù)權(quán)利要求31-35任一項(xiàng)所述的方法，包括在測量所述激酶的殘余活性之前，在80°C下處理所述樣品至少10分鐘。37.根據(jù)權(quán)利要求31-36任一項(xiàng)所述的方法，其中測量所述激酶的殘余活性包括加入包含ADP的底物到所述殘余激酶并測量ATP的形成。38.根據(jù)權(quán)利要求31-37任一項(xiàng)所述的方法，包括繼續(xù)所述處理直至所述殘余激酶活性或所述激酶活性降低程度相應(yīng)于至少3個(gè)對數(shù)級、或至少6個(gè)對數(shù)級、或至少7個(gè)對數(shù)級、或至少8個(gè)對數(shù)級的所述污染物的量或活性的確認(rèn)的降低程度。39.根據(jù)權(quán)利要求31-38任一項(xiàng)所述的方法，還包括在合適的數(shù)據(jù)載體上記錄步驟(C)中獲得的數(shù)據(jù)的步驟。全文摘要提供用于驗(yàn)證處理過程的生物過程指示物，在該處理過程中樣品中的污染物的量或者活性降低。指示物包括與生物成分共價(jià)連接的熱穩(wěn)定激酶，條件是生物成分不是抗體。也提供制備指示物的方法和使用指示物的方法。文檔編號G01N33/58GK102016065SQ200980113883公開日2011年4月13日申請日期2009年2月18日優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日發(fā)明者J·M·薩頓,J·R·赫斯普,M·溫古爾斯申請人:健康保護(hù)機(jī)構(gòu)