一種白血病融合基因熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種白血病融合基因熒光PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含白血病融合基因BCR/ABL的引物和探針序列如下，BCR/ABL上游引物：CGAGTAACATGTCCAGGGACTGGCTG，BCR/ABL下游引物：GGAAAGGAG?TCTACATGCGTTCCTT，BCR/ABL探針：CCGACAACAAAGGCTACCAGTGCGCTTCTA。優(yōu)選所述試劑盒中還包含另兩種PCR反應(yīng)液，所述另兩種PCR反應(yīng)液中的一種包含白血病融合基因TEL/AML1的引物探針序列和另一種包含白血病融合基因AML1/ETO的引物探針序列。應(yīng)用本發(fā)明提供的操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)效果好的試劑盒，可以對(duì)患者骨髓組織中的BCR/ABL、TEL/AML1、AML1/ETO這三種融合基因的陰陽(yáng)性進(jìn)行分別的定性檢測(cè)，從而為白血病的臨床診斷和后續(xù)用藥提供幫助。
【專利說(shuō)明】—種白血病融合基因熒光PCR檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種白血病融合基因熒光PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]白血病(leukemia)是起源于造血系統(tǒng)的一類全身性惡性腫瘤，具有高度的異質(zhì)性，但其共同的特點(diǎn)為骨髓中產(chǎn)生和積聚大量幼稚或異常的血細(xì)胞。與相對(duì)應(yīng)的正常血細(xì)胞比較，這些異常的細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特性，往往表現(xiàn)為增殖能力增高、分化障礙或凋亡減少，并且還可以表達(dá)一些細(xì)胞表面分子或分泌一些可溶性介質(zhì)從而發(fā)揮其惡性特征。隨著這些異常細(xì)胞的增多，可以引起骨髓正常造血功能和宿主免疫功能的抑制或衰竭，并且可以進(jìn)入血液循環(huán)和侵犯其他任何組織和器官，最終導(dǎo)致貧血、感染、出血和器官浸潤(rùn)引起的各種臨床癥狀和體征。臨床出現(xiàn)不同程度的貧血、出血、發(fā)熱及肝脾、淋巴結(jié)腫大，可危及生命。 [0003]白血病融合基因(fusion gene)，是白血病的分子生物學(xué)特異性標(biāo)志。近年來(lái)，由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)白血病細(xì)胞分子遺傳學(xué)改變的了解也不斷深入。迄今報(bào)道白血病涉及至少數(shù)十種融合基因.已經(jīng)認(rèn)識(shí)到大部分的白血病中存在著染色體結(jié)構(gòu)畸變，包括缺失、重復(fù)、倒位、易位等，導(dǎo)致原癌基因及抑癌基因結(jié)構(gòu)變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白。有些基因是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)基因發(fā)生變異，直接影響了下游信號(hào)傳遞途徑，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、凋亡障礙，分化障礙等，產(chǎn)生白血病表型。
[0004]融合基因檢測(cè)對(duì)白血病的診斷有著極其重要的意義。通過(guò)臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)單純細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型，檢測(cè)者的主觀成分較大，相互間的符合率及正確率有一定限制。隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展及對(duì)白血病發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，認(rèn)識(shí)到白血病發(fā)病過(guò)程中的基因和表型變化對(duì)各類白血病的診斷與治療具有重要意義，因此提出了白血病MICM分型。近兩年白血病分子特征的研究取得了明顯進(jìn)展，尤其是對(duì)染色體易位形成融合基因，有一些已作為診斷不同類型白血病的分子生物學(xué)特異性標(biāo)志和確定診斷的唯一依據(jù)。白血病融合基因可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)加以檢出，有助于評(píng)價(jià)白血病的急性程度、克隆特性及分型，使白血病的診斷分型更加科學(xué)化和規(guī)范化。2007年衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目目錄》，其中有要求利用RT-PCR或real-time PCR技術(shù)的白血病融合基因檢查，主要涉及6種融合基因的檢查，包括BCR / ABL,PML / RARa ,AMLl / MPSI / EVl1、DEK / CAN、AMLl / MTG8、E2A / PBX1。RT-PCR可比傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)方法及臨床癥狀出現(xiàn)早5~8個(gè)月，可檢出I X IO6個(gè)有核細(xì)胞中的一個(gè)白血病細(xì)胞，在白血病的早期診斷方面有著其它方法無(wú)可比擬的特異性和敏感性。
[0005]融合基因撿測(cè)對(duì)白血病治療和預(yù)后判斷也有著很重要的作用。細(xì)胞遺傳學(xué)分型與疾病的預(yù)后關(guān)系密切，對(duì)于指導(dǎo)臨床個(gè)性化治療方案的選擇和判斷預(yù)后具有十分重要的意義。急性白血病有PML / RARa ,CBFB / MYHlI,AMLl / ETO融合基因預(yù)后較好，化療完全，緩解率高，可長(zhǎng)期緩解或治愈，不主張?jiān)缙谧鲈煅杉?xì)胞移植；而對(duì)于有MLL異常(融合基因中含MLL基因)，或含AML (急性髓細(xì)胞白血病)中的MYC / IgH融合基因，或含ALL (急性淋巴細(xì)胞白血病)中的BCR / ABL融合基因，則病人對(duì)化療反應(yīng)差，復(fù)發(fā)率高，建議其有條件則積極行造血干細(xì)胞移植。有了融合基因的檢測(cè)，初治時(shí)可指導(dǎo)科學(xué)合理地選擇長(zhǎng)期治療方案，避免不必要的治療不足或過(guò)度治療。
[0006]融合基因檢測(cè)常用的方法主要包括白血病細(xì)胞染色體核型分析、染色體熒光原位雜交(Fluorescent In Situ Hybridazation, FISH)技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction, PCR)。
[0007]染色體G顯帶核型分析技術(shù)的陽(yáng)性率主要依賴于待檢白血病細(xì)胞的增生率，常常受到檢測(cè)技術(shù)條件和人為操作因素的影響，每份檢測(cè)標(biāo)本需要至少分析10~30個(gè)分裂中期細(xì)胞，而且由于樣本中的細(xì)胞也并非都是均一的腫瘤細(xì)胞，因此當(dāng)細(xì)胞量過(guò)少時(shí)則不能進(jìn)行核型分析，同時(shí)某些復(fù)雜性染色體易位的辨認(rèn)在技術(shù)上存在一定的困難。但核型分析技術(shù)在檢測(cè)缺失和數(shù)目畸變等染色體異常方面具有優(yōu)勢(shì)，是檢測(cè)ALL患者染色體異常必不可少的手段。
[0008]染色體熒光原位雜交是20世紀(jì)80年代末期在原有放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。用熒光標(biāo)記的已知單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行雜交，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸，以確定與探針互補(bǔ)的核酸序列在染色體上的位置和分布。熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)。用生物素或地高辛標(biāo)記的DNA探針可對(duì)間期或分裂早中期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，不僅能對(duì)分裂中期的染色體進(jìn)行檢測(cè)，而且也能敏感地測(cè)定分裂間期細(xì)胞的異常核型(包括染色體易位)并進(jìn)行定性、定量以及定位分析。但由于價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用受到一定限制。
[0009]PCR是檢測(cè)白血病相關(guān)融合基因較為有效且敏感的方法，除常規(guī)PCR方法外，巢氏 RT-PCR (nested reverse transcription PCR)、實(shí)時(shí)突光定量 PCR(real timequantitative PCR, RQ-PCR)已應(yīng)用于白血病相關(guān)融合基因的定性及定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real time quantitative PCR, RQ-PCR)不但能確定白血病細(xì)胞是否表達(dá)融合基因，而且在治療的不同階段，還能檢測(cè)出融合基因表達(dá)水平的變化，即MRD水平。目前該技術(shù)在科研和臨床上已得到了廣泛的應(yīng)用，也為白血病的分子生物學(xué)研究提供了新的手段，已有很多臨床和實(shí)驗(yàn)室研究人員應(yīng)用該技術(shù)在白血病融合基因檢測(cè)及其臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究報(bào)道。參閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，應(yīng)用RQ-PCR檢測(cè)白血病融合基因，其實(shí)都是檢測(cè)其RNA的表達(dá)，大多采用的是Taqman水解探針、雜交探針及DNA染料的結(jié)合的RQ-PCR技術(shù)，其中使用最多的為水解探針技術(shù)。各檢測(cè)技術(shù)雖然在原理上有差異，但其使用的儀器(實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀)和建立的檢測(cè)方法大同小異。
[0010]國(guó)內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)白血病融合基因的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，但受限于其引物探針序列，本領(lǐng)域還需開(kāi)發(fā)出一種檢測(cè)白血病融合基因特異性好且綜合性能優(yōu)良的PCR檢測(cè)試劑盒。另外，這些試劑盒還因沒(méi)有設(shè)置陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照(即內(nèi)標(biāo))，無(wú)法監(jiān)控假陰性；和一般沒(méi)有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明首先提供一種白血病融合基因熒光PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含白血病融合基因BCR/ABL的引物和探針序列如下，
[0012]BCR/ABL 上游引物:CGAGTAACATGTCCAGGGACTGGCTG，
[0013]BCR/ABL 下游引物:GGAAAGGAGTCTACATGCGTTCCTT，
[0014]BCR/ABL 探針:CCGACAACAAAGGCTACCAGTGCGCTTCTA。
[0015]優(yōu)選的，所述試劑盒中還含有檢測(cè)白血病融合基因的內(nèi)標(biāo)，且所述PCR反應(yīng)液中還包含內(nèi)標(biāo)的引物和探針序列如下，
[0016]內(nèi)標(biāo)序列:TAGGACTTAAATCCTAITGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTAGCTGACT CACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAGG,
[0017]內(nèi)標(biāo)上游引物:AATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCAT，
[0018]內(nèi)標(biāo)下游引物:TCCAGAAGGGTGGCTACGAA，
[0019]內(nèi)標(biāo)探針:CAGTTAGCTGACTCACG。
[0020]在本發(fā)明的一種【具體實(shí)施方式】中，所述PCR反應(yīng)液中還包含融合基因TEL / AMLl的引物探針序列和/或融合基因AMLl / ETO的引物探針序列，其序列如下，
[0021]TEL / AMLl 上游 引物:TGTGTAACATGTCCAAAGACTGGTTC，
[0022]TEL / AMLl 下游引物:AAGAGGAGGAGTACATGCAAGTCCTT，
[0023]TEL / AMLl 探針:ACTACTTCATTTTGGCTACCAGGGCTTCTA ；
[0024]AMLl / ETO 上游引物:GGTGTAGACATGATTAAAGACTGGAAC，
[0025]AMLl / ETO 下游引物:AAGAAGGGAGTACTTGCGCTCCTT，
[0026]AMLl / ETO 探針:ACTTCAACATTGGTTACCAGAACTTCTA。
[0027]在該具體的實(shí)施方案中，一種情況是所述PCR反應(yīng)液中包含BCR/ABL的引物探針序列和TEL / AMLl的引物探針序列，該試劑盒可檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有這兩種融合基因，當(dāng)待測(cè)樣本中不含這兩種融合基因時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，而當(dāng)待測(cè)樣本中含有這兩者中的任意一種或兩種時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。第二種情況是所述PCR反應(yīng)液中包含BCR/ABL的引物探針序列和AMLl / ETO的引物探針序列，同樣的，當(dāng)待測(cè)樣本中不含這兩種融合基因時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，而當(dāng)待測(cè)樣本中含有這兩者中的任意一種或兩種時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。而第三種情況是所述PCR反應(yīng)液中包含BCR/ABL的引物探針序列、TEL / AMLl的引物探針序列和AMLl / ETO的引物探針序列，相應(yīng)的，當(dāng)待測(cè)樣本中不含這三種融合基因時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，而當(dāng)待測(cè)樣本中含有這三者中的任意一種或多種時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
[0028]在本發(fā)明的另一種【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中還包含另一種PCR反應(yīng)液，所述另一種PCR反應(yīng)液中包含白血病融合基因TEL / AMLl的引物探針序列或融合基因AMLl / ETO的引物探針序列，其序列如上所示。容易理解的，使用本發(fā)明所述試劑盒，從待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果中可以清楚地得知待測(cè)樣本中是否含有這兩種融合基因中(BCR/ABL和TEL / AML1，或BCR/ABL和AMLl / ET0)的任意一種，也就是說(shuō)該試劑盒能分別判斷這兩種融合基因的陰性和陽(yáng)性。
[0029]在本發(fā)明的另一種【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中還包含另兩種PCR反應(yīng)液，所述另兩種PCR反應(yīng)液中的一種包含白血病融合基因TEL / AMLl的引物探針序列和另一種包含白血病融合基因AMLl / ETO的引物探針序列，其序列如上所示。容易理解的，該試劑盒能分別判斷這三種融合基因的陰性和陽(yáng)性。應(yīng)用本發(fā)明提供的操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)效果好的試劑盒，可以對(duì)患者骨髓組織中的BCR/ABL、TEL / AMLl、AMLl / ETO融合基因的RNA進(jìn)行定性檢測(cè)，從而為白血病的臨床診斷和后續(xù)用藥提供幫助。
[0030]在該【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選的，所述試劑盒中還包含內(nèi)標(biāo)，且試劑盒中的每一種PCR反應(yīng)液中均包含內(nèi)標(biāo)的引物和探針序列，內(nèi)標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)的引物探針序列如上所示。
[0031]在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中包括內(nèi)標(biāo)、I~3種PCR反應(yīng)液、酶混合液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0032]本發(fā)明中以下述實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不用來(lái)限制本發(fā)明。
[0033]實(shí)施例1
[0034]本實(shí)施例提供一種白血病融合基因BCR/ABL、TEL / AMLUAMLI / ETO的PCR檢測(cè)
試劑盒。
[0035]①內(nèi)標(biāo)(陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照):為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為100堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，濃度為1.00E+04copies/ml~5.00E+04copies/ml,作為PCR擴(kuò)增體系中的陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，預(yù)防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質(zhì)導(dǎo)致的假陰性；100堿基對(duì)的序列如下所示:5’ -TAGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTAGCTGAC TCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAGG-3，；[0036]②PCR反應(yīng)液:10 X PCR反應(yīng)緩沖液5 ill，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，
0.2iimol/L~0.4iimol/L的用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物，0.2iimol/L~0.4iimol/L的用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，0.2 u mol/L~0.4 y mol/L的用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物，0.liimol/L~0.2iimol/L的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針。所述10XPCR反應(yīng)緩沖液包括PH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2% (體積/體積)曲拉通溶液和10% (體積/體積)甲酰胺溶液；所述脫氧核糖核苷三磷酸為 dATP、dCTP、dUTP、dGTP 或 dTTP ;所述用于檢測(cè) BCR/ABL、TEL / AMLl、AMLl /ETO的引物和探針序列分別為:
[0037]BCR/ABL 上游引物:5，-CGAGTAACATGTCCAGGGACTGGCTG-3，；
[0038]BCR/ABL 下游引物:5，-GGAAAGGAGTCTACATGCGTTCCTT-3，；
[0039]BCR/ABL 探針:5，-CCGACAACAAAGGCTACCAGTGCGCTTCTA-3，。
[0040]TEL / AMLl 上游引物:5’ -TGTGTAACATGTCCAAAGACTGGTTC-3，；
[0041]TEL / AMLl 下游引物:5’ -AAGAGGAGGAGTACATGCAAGTCCTT-3’ ；
[0042]TEL / AMLl 探針:5’ -ACTACTTCATTTTGGCTACCAGGGCTTCTA-3’。
[0043]AMLl / ETO 上游引物:5’ -GGTGTAGACATGATTAAAGACTGGAAC-3’ ；
[0044]AMLl / ETO 下游引物:5’ -AAGAAGGGAGTACTTGCGCTCCTT-3’ ；
[0045]AMLl / ETO 探針:5，-ACTTCAACATTGGTTACCAGAACTTCTA-3，。
[0046]所述的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物探針序列分別為:
[0047]內(nèi)標(biāo)上游引物:5’-AATCCTAITGTTCCAGCTCTGTCAT-3’ ；
[0048]內(nèi)標(biāo)下游引物:5，-TCCAGAAGGGTGGCTACGAA-3’；
[0049]內(nèi)標(biāo)探針的序列為:5’-CAGTTAGCTGACTCACG - 3’ ；
[0050]③酶混合液:耐熱DNA聚合酶(Taq酶)IU/yl~5U/iU，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)0.5U/ ill~2U/ ;其中UNG酶具有降解含有dU的PCR產(chǎn)物的功能，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用；
[0051]④陽(yáng)性對(duì)照:為強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒，其濃度為1.00~5.00E+05copies/ml ；
[0052]⑤陰性對(duì)照:為滅菌生理鹽水；
[0053]實(shí)施例2
[0054]本實(shí)施例提供實(shí)施例1中的白血病融合基因BCR/ABL、TEL / AMLUAMLI / ETO檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)如患者骨髓組織等未知樣本的操作步驟。
[0055]一、試劑準(zhǔn)備:
[0056]根據(jù)待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的數(shù)量，按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液(38 iil/人份)、酶混合液(2 ii I/人份)及內(nèi)標(biāo)(0.5 u I/人份)，充分混勻成PCR-mix，瞬時(shí)
離心后備用。
[0057]二、樣本處理與加樣
[0058]I)在不同的5個(gè)PCR反應(yīng)管中加入同一待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各5 Ul ;
[0059]2)靜置10分鐘后,每管加入PCR_mix45 U I,吸打混勻2_3次,蓋上管蓋(去除氣泡后)，2000rpm離心30秒。
[0060]三、在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0061]I)將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱。
[0062]2)突光檢測(cè)通道選擇:選擇FAM通道(Reporter:FAM, Quencher:None)檢測(cè)融合基因；選擇HEX或VIC通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比突光(PassiveReference)設(shè)置為 none。
[0063]3 )熒光定量PCR反應(yīng)條件為:
[0064]表1
【權(quán)利要求】
1.一種白血病融合基因熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含白血病融合基因BCR/ABL的引物和探針序列如下， BCR/ABL 上游引物:CGAGTAACATGTCCAGGGACTGGCTG， BCR/ABL 下游引物:GGAAAGGAGTCTACATGCGTTCCTT，
BCR/ABL 探針:CCGACAACAAAGGCTACCAGTGCGCTTCTA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有檢測(cè)白血病融合基因的內(nèi)標(biāo)，且所述PCR反應(yīng)液中還包含內(nèi)標(biāo)的引物和探針序列如下， 內(nèi)標(biāo)序列:TAGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTAGCTGACT CACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAGG, 內(nèi)標(biāo)上游引物:AATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCAT， 內(nèi)標(biāo)下游引物:TCCAGAAGGGTGGCTACGAA， 內(nèi)標(biāo)探針:CAGTTAGCTGACTCACG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中還包含融合基因TEL / AMLl的引物探針序列和/或融合基因AMLl / ETO的引物探針序列，其序列如下， TEL / AMLl 上游引物:TGTGTAACATGTCCAAAGACTGGTTC， TEL / AMLl 下游引物:AAGAGGAGGAGTACATGCAAGTCCTT，
TEL / AMLl 探針:ACTACTTCATTTTGGCTACCAGGGCTTCTA ；
AMLl / ETO 上游引物:GGTGTAGACATGATTAAAGACTGGAAC， AMLl / ETO 下游引物:AAGAAGGGAGTACTTGCGCTCCTT，
AMLl / ETO 探針:ACTTCAACATTGGTTACCAGAACTTCTA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含另一種PCR反應(yīng)液，所述另一種PCR反應(yīng)液中包含白血病融合基因TEL / AMLl的引物探針序列或融合基因AMLl / ETO的引物探針序列，其序列如權(quán)利要求3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含另兩種PCR反應(yīng)液，所述另兩種PCR反應(yīng)液中的一種包含白血病融合基因TEL / AMLl的引物探針序列和另一種包含白血病融合基因AMLl / ETO的引物探針序列，其序列如權(quán)利要求3所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含內(nèi)標(biāo)，且試劑盒中的每一種PCR反應(yīng)液中均包含內(nèi)標(biāo)的引物和探針序列，且內(nèi)標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)的引物探針序列為權(quán)利要求2中所示的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任 意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括內(nèi)標(biāo)、I~3種PCR反應(yīng)液、酶混合液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103740835SQ201410017429
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】戴立忠, 肖飛, 熊曉燕 申請(qǐng)人:湖南圣維爾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司