一種鵝鴨源性羽絨成份的定量檢測(cè)方法、定量檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種鵝鴨源性羽絨成份的定量檢測(cè) 方法、定量檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 從古至今，羽絨作為一種天然保暖紡織填充材料，一直深受世人喜愛(ài)。中國(guó)是世 界上最大的羽絨制品生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，出口數(shù)量占據(jù)了國(guó)際市場(chǎng)70%以上的份額，在國(guó)際 羽絨市場(chǎng)上占有舉足輕重的位置。在羽絨羽毛產(chǎn)業(yè)中，除極小部分作為服飾或工藝品的裝 飾羽毛外，很大部分是作為紡織填充材料的鵝絨和鴨絨。鵝絨與鴨絨相比，鵝絨的絨朵大， 中空度高，蓬松度好，回彈性?xún)?yōu)，保暖性強(qiáng)。一般鵝絨在各項(xiàng)指標(biāo)上都優(yōu)于鴨絨，因而在市 場(chǎng)上鵝絨的價(jià)格比鴨絨更高。有些不法羽絨商販就企圖以鴨絨冒充鵝絨，以獲取巨大的經(jīng) 濟(jì)利益。因此世界各國(guó)的羽絨毛標(biāo)準(zhǔn)都對(duì)鵝絨中的鴨絨含量作了最高限定，一般不得超過(guò) 10%~15%。我國(guó)有部分企業(yè)曾因出口羽絨制品的鵝絨含量不達(dá)標(biāo)而被退運(yùn)索賠，也有企 業(yè)因此破產(chǎn)倒閉。
[0003] 鵝鴨絨均屬水禽羽絨，其化學(xué)成分均為角質(zhì)化的蛋白質(zhì)，外形結(jié)構(gòu)又大體相近。目 前國(guó)內(nèi)外普遍采用顯微鏡法，通過(guò)觀察羽絨羽毛的微觀結(jié)構(gòu)對(duì)鵝絨、鴨絨加以區(qū)分。此方法 是基于鵝鴨絨羽枝上的結(jié)節(jié)間距不同而進(jìn)行區(qū)分，但當(dāng)絨朵生長(zhǎng)不完全時(shí)，鵝鴨絨兩者之 間就不存在這種形態(tài)上的差別。圖1為放大投影儀下典型的鴨毛絨、鵝毛絨的顯微狀態(tài)（放 大80倍）。圖2為放大投影儀下無(wú)法區(qū)分毛絨的顯微狀態(tài)（放大80倍）。顯微鏡檢測(cè)勞 動(dòng)強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，且依賴(lài)檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)，具有不可避免的主觀性，而且不適宜大批量 樣本的分析，因此建立準(zhǔn)確客觀地鑒別鵝絨和鴨絨的新方法，對(duì)于維護(hù)公平貿(mào)易和保護(hù)我 國(guó)羽絨企業(yè)對(duì)外貿(mào)易的順利開(kāi)展有著重要的意義。
[0004] 對(duì)于天然動(dòng)物纖維而言，DNA檢測(cè)方法不依賴(lài)于纖維固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其他理化 性質(zhì)，而是依據(jù)物種自身的特異性核苷酸序列開(kāi)展檢測(cè)，因而不受檢測(cè)人員的主觀判斷及 經(jīng)驗(yàn)影響，結(jié)果更為準(zhǔn)確和可靠。隨著生物技術(shù)和生命科學(xué)的飛速發(fā)展，DNA檢測(cè)技術(shù)已經(jīng) 在食品檢測(cè)、醫(yī)療診斷、司法鑒定及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。近年，有很多學(xué)者 開(kāi)展了基于DNA技術(shù)的纖維物種鑒別研究，對(duì)紡織品質(zhì)量檢測(cè)現(xiàn)代化技術(shù)的發(fā)展具有重要 的推動(dòng)作用。
[0005] 家鵝分中國(guó)鵝和歐洲鵝兩個(gè)系統(tǒng)，歐洲鵝起源灰雁（Anser anser)，中國(guó)鵝是由鴻 雁（Anser cygnoides)馴養(yǎng)而成。家鴨則主要是由綠頭鴨（Anas platyrhynchos)和斑嘴 鴨（Anas poecilorhyncha)培育形成的。因此設(shè)計(jì)能橫跨兩個(gè)物種并相互區(qū)別的高效特異 性引物對(duì)和探針是本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鵝鴨源性羽絨成分的定量檢測(cè)方法，以解決現(xiàn)有的 鵝鴨源性羽絨成分不能進(jìn)行批量樣本的檢測(cè)分析且費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問(wèn)題；本發(fā)明的第二個(gè)目的 是提供一種鵝鴨源性羽絨成分的定量檢測(cè)試劑盒，以使鵝鴨源性羽絨成分的檢測(cè)快速、準(zhǔn) 確；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種鵝鴨源性羽絨成分的定量檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 作為本發(fā)明的第一個(gè)方面，一種鵝鴨源性羽絨成分的定量檢測(cè)方法，該方法包括 以下步驟：
[0009] 步驟一：以待測(cè)樣品的DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0010] 步驟二：檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)；
[0011] 步驟三：計(jì)算待測(cè)樣品中鵝源性羽絨成分和鴨源性羽絨成分的含量；
[0012] 其中，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增鵝源性羽絨成分特異性引物對(duì)和鵝源 性羽絨成分特異性探針，以及擴(kuò)增鴨源性羽絨成分特異性引物對(duì)和鴨源性羽絨成分特異性 探針。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，所述擴(kuò)增鵝源性羽絨成分特異性引物對(duì)的序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示；所述鵝源性羽絨成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示；所述擴(kuò) 增鴨源性羽絨成分特異性引物對(duì)的序列如SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示；所述鴨源性 羽絨成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID N0 :6所示。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，步驟一的PCR擴(kuò)增的條件如下：
[0015] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25yl，包括2X實(shí)時(shí)熒光PCR試劑12. 5yl，引物各 0? 4 y M，探針 0? 2 y M，DNA 模板 5 y 1;
[0016] 進(jìn)行PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C變性10min ;進(jìn)入循環(huán)，95°C變性15s，60°C退火和延伸 lmin，共40個(gè)循環(huán)。
[0017] 作為本發(fā)明的第二個(gè)方面，一種鵝鴨源性羽絨成分的定量檢測(cè)試劑盒，所述定量 檢測(cè)試劑盒包括：
[0018] (a)擴(kuò)增鵝源性羽絨成分特異性引物對(duì)，所述擴(kuò)增鵝源性羽絨成分特異性引物對(duì) 的序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示；
[0019] (b)鵝源性羽絨成分特異性探針，所述鵝源性羽絨成分特異性探針的核苷酸序列 如 SEQ ID N0 :3 所示；
[0020] (c)擴(kuò)增鴨源性羽絨成分特異性引物對(duì)，所述擴(kuò)增鴨源性羽絨成分特異性引物對(duì) 的序列如SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示；
[0021] (d)鴨源性羽絨成分特異性探針，所述鴨源性羽絨成分特異性探針的核苷酸序列 如 SEQ ID N0 :6 所示。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒還包括：
[0023] (a)鵝源性標(biāo)準(zhǔn)參照物；
[0024] (b)鴨源性標(biāo)準(zhǔn)參照物。
[0025] 作為本發(fā)明的第三個(gè)方面，一種鵝鴨源性羽絨成分的定量檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所 述定量檢測(cè)試劑盒用于定量檢測(cè)鵝源性羽絨成分和鴨源性羽絨成分。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是：
[0027] 1、可快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)鵝鴨混合絨中的鵝絨和鴨絨含量；
[0028] 2、靈敏度高，熒光定量PCR只需微量的DNA模板；
[0029] 3、針對(duì)鵝源性羽絨成分和鴨源性羽絨成分的特異性引物對(duì)和探針特異性好，準(zhǔn)確 性高，誤差小于±5%。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為放大投影儀下典型的鴨絨（左）和鵝絨（右）的顯微狀態(tài)（放大80倍）。
[0031] 圖2為放大投影儀下無(wú)法區(qū)分毛絨的顯微狀態(tài)（放大80倍）。
[0032] 圖3為鵝源性成分的引物探針的特異性檢測(cè)結(jié)果。
[0033] 圖4為鴨源性成分的引物探針的特異性檢測(cè)結(jié)果。
[0034] 圖5為鵝源性成分和鴨源性成分檢測(cè)體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中，紅色線(xiàn)代表 鵝源性成分檢測(cè)體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，黑色線(xiàn)代表鴨源性成分檢測(cè)體系的靈敏度檢測(cè)結(jié) 果，從右往左各點(diǎn)分別代表鵝絨DNA和鴨絨DNA1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍梯度 稀釋。
[0035] 圖6為鵝鴨絨定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中，從右往左各點(diǎn)分別代表鵝絨含量為90%， 80%，70%，60%，50%，40%，30%，20% 的鵝鴨混合絨 DNA。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常 規(guī)條件，如《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件或廠商提供的條件進(jìn)行。
[0037]實(shí)施例1、引物對(duì)和探針的設(shè)計(jì)
[0038] 根據(jù)NCBI中已發(fā)表的鴻雁和灰雁、綠頭鴨和斑嘴鴨的線(xiàn)粒體基因組序列（登錄 號(hào)：KP238480. 1，NC_011196. 1，EU009397. 1，NC_022418. 1)，兼顧鴻雁和灰雁兩者線(xiàn)粒體基 因的相同部分，與綠頭鴨和斑嘴鴨的相應(yīng)區(qū)域序列進(jìn)行比較，選取合適的序列進(jìn)行引物探 針設(shè)計(jì)。
[0039] 針對(duì)鵝源性成分的目的片段長(zhǎng)度為84bp。熒光定量引物對(duì)和探針的序列如下：
[0040] AnserF5 :5'-ACCCATTTTAATGAATGCTCACAG-3'（SEQ ID N0 :1)
[0041] AnserR5 :5'-AATCCGTCTGATACGAACTGCA-3'（SEQ ID NO :2)
[0042] AnserP5 :FAM-ATGCTCCAACAACAACT-MGB(SEQ ID NO :3)
[0043] 針對(duì)鴨源性成分的目的片段長(zhǎng)度為108bp。熒光定量引物對(duì)和探針的序列如下：
[0044] duckB-1 :5' -AATGCATAACATGACCTAAATTTATTAGAGA-3'（SEQ ID N0 :4)
[0045] duckB-2 :5'-GCTGGTTAATTGGGTAATGTTTGTT-3'（SEQ ID NO :5)
[0046] duckB-P：FAM-ACTAAAGACGATCCAAAC-MGB(SEQ ID NO：6)
[0047] 其中，F(xiàn)AM表示熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB表示淬滅基團(tuán)。本發(fā)明采用熒光探針?lè)?，其檢測(cè) 原理是利用熒光標(biāo)記特異性探針來(lái)識(shí)別模板。與現(xiàn)有技術(shù)中SYBR染料法相比，本發(fā)明熒光 標(biāo)記特異性探針的特異性更強(qiáng)。
[0048] 實(shí)施例2、羽絨DNA的抽提
[0049] 純白鵝絨和純白鴨絨均購(gòu)自上海民強(qiáng)羽絨廠，且經(jīng)顯微鏡檢測(cè)