一種人腺病毒檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種人腺病毒（HAdV）檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mM/L，氯化鉀20～300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反應(yīng)液中包含用于HAdV檢測(cè)的引物和探針序列如下，HAdV上游引物：AGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTC，HAdV下游引物：AAGAAGGAGTACATGCGRTCCTT，HAdV探針：ACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTA。本發(fā)明試劑盒檢測(cè)人腺病毒的靈敏度可達(dá)400copies/ml，定量線(xiàn)性范圍為400～4.00E+09copies/ml；應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)痰液和咽拭子等未知樣本中的HAdV-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為人腺病毒感染的早期診斷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種人腺病毒檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種人腺病毒檢測(cè)試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的腺病毒檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】 [0002]人腺病毒((Human adenoviruses,HAdV)屬于腺病毒科,是一群分布廣泛的DNA病毒，可分為A~F六個(gè)亞種，共51個(gè)血清型。腺病毒是無(wú)包膜病毒，在低pH值環(huán)境下可穩(wěn)定存在，有很強(qiáng)的耐物理和化學(xué)試劑的作用的能力，腺病毒可對(duì)胃腸分泌物和膽汁產(chǎn)生耐受，因此腺病毒可在胃腸內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生很高的病毒載量。腺病毒常在咽、結(jié)膜、腸道及淋巴組織內(nèi)繁殖，并導(dǎo)致各種各樣的臨床癥狀，比如呼吸系統(tǒng)的感染、結(jié)膜炎、胃腸炎、肝炎、出血性膀胱炎、神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂等。不同的腺病毒亞種會(huì)引起不同的疾病，如人腺病毒C亞種主要引起小兒科的上呼吸道感染，人腺病毒B亞種常在成年人中引起流行，人腺病毒B和E亞種是軍營(yíng)人員感染的主要病因，人腺病毒F亞種會(huì)引起感染性腹瀉。腺病毒在有免疫力的宿主體內(nèi)感染是溫和的，而且具有自限性。腺病毒可通過(guò)人、水、媒介物和器械傳播，室溫條件下，腺病毒在污物中存在周期可延長(zhǎng)至3周。腺病毒在兒童和軍營(yíng)人員中更易發(fā)生感染和大規(guī)模流行，大多數(shù)嬰幼兒在出生后的5年內(nèi)至少感染過(guò)I種腺病毒株。在過(guò)去的幾年中，腺病毒作為主要的病原體在免疫功能低下宿主如艾滋病人、免疫遺傳缺陷的患者、骨髓接受者、固體器官和造血干細(xì)胞移植者中常引起高發(fā)病率和死亡率；兒科經(jīng)受同種型干細(xì)胞移植的病人，其感染腺病毒后死亡率可高達(dá)60%。一些致命的感染常由腺病毒血清型1、
2、3引起，在這些病人體內(nèi)常會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌、真菌等微生物共感染的情況。艾滋病人感染腺病毒會(huì)產(chǎn)生肺炎、肝炎、腦膜軟化、腎炎、胃腸炎等并發(fā)癥。因此能夠及時(shí)確診何種病因致病，做到早發(fā)現(xiàn)早治療，減少病情惡化，故早期診斷極為重要。
[0003]對(duì)腺病毒的檢測(cè)依賴(lài)于疾病的類(lèi)型和所獲取的標(biāo)本，確診腺病毒的存在可采用病毒的細(xì)胞培養(yǎng)、抗原測(cè)定和基因組檢測(cè)等技術(shù)。盡管細(xì)胞培養(yǎng)仍然是HAdV的金標(biāo)準(zhǔn)，但其對(duì)臨床標(biāo)本不敏感，且比較慢，易受細(xì)菌和真菌的污染。抗原檢測(cè)常用來(lái)直接檢測(cè)腺病毒在呼吸道和胃腸道的感染，較快速且靈敏度較高。免疫熒光(尤其對(duì)呼吸道標(biāo)本、咽拭子和活組織標(biāo)本)和酶免疫分析(尤其對(duì)于糞便標(biāo)本)是常用的方法，與細(xì)胞培養(yǎng)相比，免疫熒光檢測(cè)腺病毒的靈敏性能提高40~60%。其它直接測(cè)定抗原的方法包括免疫層析法和乳膠凝集法。研究證實(shí)，與細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)方法相比，使用免疫層析試劑盒所測(cè)定的靈敏度可達(dá)90%。
[0004]近年來(lái)，聚核酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法漸漸顯現(xiàn)了其在檢測(cè)上的優(yōu)勢(shì)，熒光PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)患者治療前、后病原體動(dòng)態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過(guò)程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問(wèn)題，減少了污染。
[0005]PCR技術(shù)為人腺病毒的檢測(cè)提供了又一新的途徑。定量PCR的出現(xiàn)，打破PCR只能定性的局面，其中熒光定量PCR以其高靈敏度、高特異性、低污染率、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，可為臨床提供更加準(zhǔn)確、客觀(guān)的檢測(cè)結(jié)果，并及時(shí)地了解病情及預(yù)后。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有熒光PCR診斷試劑盒在臨床HAdV感染診斷中使用，因此設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)高靈敏度、高特異性的HAdV核酸熒光PCR診斷試劑盒具有非常重大的意義。
[0006]運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)主要涉及到兩個(gè)方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。
[0007]目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用直接煮沸法對(duì)痰液、咽拭子等樣本中的HAdV核酸進(jìn)行提取，具體是向經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣本中加入某種核酸裂解液，直接煮沸，高速離心，上清即為模板；該方法核酸提取過(guò)程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)經(jīng)過(guò)煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對(duì)高濃度的樣本裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污染。
[0008]HAdV-DNA的檢測(cè)方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線(xiàn)，根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)與熒光閾值線(xiàn)的交點(diǎn)(即Ct值)以及擴(kuò)增曲線(xiàn)的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值(即定量檢測(cè))。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離 ，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線(xiàn)性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0009]目前國(guó)外已有基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HAdV-DNA的科研試劑盒，但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸，且其檢測(cè)靈敏度不高，約在500~lOOOcopies/ml左右；另外，這些試劑盒大多缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類(lèi)產(chǎn)品更加滿(mǎn)足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供一種核酸釋放劑在人腺病毒檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01~0.5mM/L,氯化鉀20~300mM/L,十二烷基橫酸鈉0.01~2%和乙醇
0.05 ~1%。
[0011]在本發(fā)明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領(lǐng)域常用的，例如為無(wú)菌水或TE緩沖液。本發(fā)明首次披露在腺病毒檢測(cè)中使用含強(qiáng)蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡(jiǎn)化了該核酸檢測(cè)的步驟，而且檢測(cè)靈敏度有了很大的提高。
[0012]本發(fā)明提供一種人腺病毒HAdV檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于HAdV檢測(cè)的引物和探針序列如下，
[0013]HAdV 上游引物:AGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTC，
[0014]HAdV 下游引物:AAGAAGGAGTACATGCGRTCCTT，
[0015]HAdV 探針:ACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTA。
[0016]使用本發(fā)明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提?。槐景l(fā)明試劑盒檢測(cè)腺病毒的靈敏度可達(dá)400copies/ml，定量線(xiàn)性范圍為400~4.00E+09copies/ml。另外，本發(fā)明的試劑盒因采用用于檢測(cè)靶多核苷酸的上述引物和探針序列，具有很好的特異性。
[0017]本發(fā)明中，優(yōu)選所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，且所述PCR反應(yīng)液中還包含用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物和探針序列，
[0018]內(nèi)標(biāo):CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCA CGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG ；
[0019]內(nèi)標(biāo)上游引物:CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG,
[0020]內(nèi)標(biāo)下游引物:CTGATGACATAATTGAGATTGCACC，
[0021]內(nèi)標(biāo)探針:TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA。
[0022]本發(fā)明中所述內(nèi)標(biāo)為插入pUC18T載體的一段長(zhǎng)為100堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，它作為PCR擴(kuò)增體系中的陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照，預(yù)防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質(zhì)導(dǎo)致的假陰性。
[0023]優(yōu)選本發(fā)明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產(chǎn)物，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用，從而防止樣本檢測(cè)假陽(yáng)性。
[0024]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、酶混合液、人腺病毒定量參考品、人腺病毒陽(yáng)性對(duì)照、人腺病毒陰性對(duì)照和人腺病毒濃縮液。
[0025]本發(fā)明還提供一種人腺病毒HAdV檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于HAdV檢測(cè)的引物和探針序列如下，
[0026]HAdV 上游引物:AGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTC，
[0027]HAdV 下游引物:AAGAAGGAGTACATGCGRTCCTT，
[0028]HAdV 探針:ACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTA。
[0029]本發(fā)明提供的人腺病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)痰液、咽拭子等未知樣本中的HAdV-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為診斷腺病毒感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)范圍內(nèi)，可很容易進(jìn)行的改變或變化都涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書(shū)的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
[0031]另外，如未做特殊交待，則本發(fā)明中的百分含量指質(zhì)量百分含量。[0032]實(shí)施例1
[0033]本實(shí)施例提供一種具體的腺病毒檢測(cè)試劑盒，它包括如下組分:
[0034]①核酸釋放劑:包含莎梵婦(surfactin) 0.lmmol/L,氯化鉀100mmol/L,十二烷基磺酸鈉(SDS) 0.1%，0.1%的乙醇和溶劑TE緩沖液。
[0035]②內(nèi)標(biāo)(陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照):為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為100堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，濃度為2.00E+04copies/ml, 100堿基對(duì)的序列為:5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。
[0036]③PCR反應(yīng)液:包括10XPCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上、下游引物均為0.3 μ mol/L，用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針為0.3 μ mol/L，用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物均為0.3 μ mol/L，用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針為0.1 μ mol/L。其中，所述10XPCR反應(yīng)緩沖液為包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP和dTTP ;所述用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針是源于腺病毒核酸的保守區(qū)域的引物和探針，其堿基序列分別為:
[0037]HAdV 上游引物:5’ -AGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTC-3’ ；
[0038]HAdV 下游引物:5，-AAGAAGGAGTACATGCGRTCCTT-3，；
[0039]HAdV 探針:5，-ACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTA-3，；
[0040]所述的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物探針序列分別為:
[0041]內(nèi)標(biāo)上游引物:5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’ ；
[0042]內(nèi)標(biāo)下游引物:5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’ ；
[0043]內(nèi)標(biāo)探針:5’ -TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA - 3 ’。
[0044]④酶混合液:包含5U/ μ1的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和IU/ μ l的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。
[0045]⑤人腺病毒定量參考品:來(lái)源于使用人腺病毒企業(yè)定量線(xiàn)性參考品LI~L5定值后的HAdV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒，該腺病毒定量參考品包括A、B、C、D四個(gè)濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為 4.00E+07copies/ml (Α)、4.00E+06copies/ml (Β)、4.00E+05copies/ml (C)、4.00E+04copies/ml (D)0
[0046]⑥人腺病毒陽(yáng)性對(duì)照:為臨床醫(yī)院收集的已滅活的HAdV強(qiáng)陽(yáng)性咽拭子樣本，經(jīng)濃縮離心后，加入滅菌生理鹽水溶解沉淀，并經(jīng)合格的人腺病毒試劑盒檢測(cè)并定值后，用滅菌生理鹽水稀釋至濃度為4.00E+05copies/ml。
[0047]⑦人腺病毒陰性對(duì)照:臨床醫(yī)院收集的已滅活的HAdV陰性咽拭子樣本，用滅菌生理鹽水稀釋100倍后，經(jīng)合格的HAdV試劑盒檢測(cè)為陰性。
[0048]⑧人腺病毒濃縮液:聚乙二醇6000 (PEG-6000) 10~100mmol/L (質(zhì)量/體積)，氯化鈉50~500mmol/L (質(zhì)量/體積)。
[0049]實(shí)施例2
[0050]本實(shí)施例提供上述實(shí)施例1所述試劑盒用于檢測(cè)痰液、咽拭子等未知樣本中HAdV-DNA的操作步驟:[0051]一、試劑準(zhǔn)備
[0052]根據(jù)待測(cè)樣本、腺病毒陰性對(duì)照、腺病毒陽(yáng)性對(duì)照以及腺病毒定量參考品A~D的數(shù)量，按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液(38 μ I/人份)、酶混合液(2 μ I/人份)及內(nèi)標(biāo)0.5 μ I/人份，充分混勻成PCR-mix ;瞬時(shí)離心后備用。
[0053]二、核酸提取
[0054]1.痰液樣本:痰液樣本中加入2~3倍體積的生理鹽水，充分震蕩混勻后靜置一個(gè)小時(shí)使痰液液化，取液化后的樣本1000 μ I于1.5ml離心管中(避免吸出明顯的固體雜質(zhì))，離心管中加入人腺病毒濃縮液100 μ 1，振蕩混勻后12，OOOrpm離心5min，棄上清，沉淀中加入50μ I核酸釋放劑，震蕩或移液槍吸打混勻，作為待測(cè)樣本備用。
[0055]2.咽拭子樣本:往已收集咽拭子的樣本收集管中加入Iml無(wú)菌生理鹽水，充分振蕩混勻，然后把全部液體倒入1.5ml滅菌離心管中(棉拭子靠離心管壁擠干后丟棄)，離心管中加入人腺病毒濃縮液100 μ 1，振蕩混勻后12，OOOrpm離心5min，棄上清，沉淀中加入50μ I核酸釋放劑，震蕩或移液槍吸打混勻，作為待測(cè)樣本備用。[0056]3.腺病毒陰性對(duì)照、腺病毒陽(yáng)性對(duì)照、腺病毒定量參考品:腺病毒陰性對(duì)照、腺病毒陽(yáng)性對(duì)照、腺病毒定量參考品A~D分別取10μ I與10μ I核酸釋放劑混勻待用。
[0057]三、向PCR反應(yīng)管中加樣
[0058]每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入上述第二步驟中處理后的待測(cè)樣本、腺病毒陰性對(duì)照、腺病毒陽(yáng)性對(duì)照以及腺病毒定量參考品A~D各10 μ I ;靜置10分鐘后，每管加入步驟一中的PCR-mix40 μ 1，吸打混勻2_3次，去除氣泡后蓋上管蓋，2000rpm離心30秒。
[0059]四、熒光PCR反應(yīng)與結(jié)果分析(在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行)
[0060]I)將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱(chēng)及定量參考品濃度。
[0061]2)突光檢測(cè)通道選擇:選擇FAM通道(Reporter:FAM, Quencher:None)檢測(cè)腺病毒；選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比突光(PassiveReference)設(shè)置為 none。
[0062]3)熒光定量PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1:
[0063]表1
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種核酸釋放劑在人腺病毒檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.01~0.5mM/L,氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05 ~1%。
2.一種人腺病毒HAdV檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L,氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于HAdV檢測(cè)的引物和探針序列如下， HAdV 上游引物:AGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTC， HAdV 下游引物:AAGAAGGAGTACATGCGRTCCTT，
HAdV 探針:ACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，且所述PCR反應(yīng)液中還包含用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物和探針序列，
內(nèi)標(biāo):CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCA CGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG ； 內(nèi)標(biāo)上游引物:CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG， 內(nèi)標(biāo)下游引物:CTGATGACATAATTGAGATTGCACC， 內(nèi)標(biāo)探針:TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA。`
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。
5.根據(jù)權(quán)利要求2~4中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、酶混合液、人腺病毒定量參考品、人腺病毒陽(yáng)性對(duì)照、人腺病毒陰性對(duì)照和人腺病毒濃縮液。
6.一種人腺病毒HAdV檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于HAdV檢測(cè)的引物和探針序列如下， HAdV 上游引物:AGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTC， HAdV 下游引物:AAGAAGGAGTACATGCGRTCCTT，
HAdV 探針:ACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103725800SQ201410017219
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】戴立忠, 艾穎娟, 鄧中平 申請(qǐng)人:湖南圣維爾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司