專利名稱：用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病bcr/abl融合基因的電化學(xué)dna生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因的電化學(xué)DNA生物傳感 器
背景技術(shù)：
慢性粒細(xì)胞白血病，簡稱慢粒(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)，是伴有獲得 性染色體異常的多能干細(xì)胞水平的惡性病變而引起的一種細(xì)胞株病，其臨床特征為顯著的 粒細(xì)胞過度生成。慢性粒細(xì)胞白血病是嚴(yán)重危害中青年健康的惡性血液病之一，為白血病 中較常見的類型。由于白血病病人在得病初期并沒有出現(xiàn)明顯的癥狀，這給白血病的早期 診斷以及檢測帶來了一定程度的困難，而早期診斷水平將直接影響白血病患者的治療效果 及生存質(zhì)量，其重要意義不言而喻。目前CML的臨床診斷方法主要包括染色體分析、Southern-Blot、FISH、RT-PCR 技術(shù)等，這些方法都存在一定的局限性，如染色體分析費(fèi)時費(fèi)力，且靈敏度低；傳統(tǒng)的 Southern Blot檢測雖特異性強(qiáng)，但對低拷貝基因序列的檢測極不靈敏，不僅方法復(fù)雜，檢 測周期長，且價格昂貴兼有放射性污染，限制了臨床上的廣泛應(yīng)用；RT-PCR操作繁瑣、價格 昂貴。如特異性、敏感度不高、操作繁瑣、檢測費(fèi)用高等問題，限制了臨床中的應(yīng)用。因此， 開發(fā)研究一種簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)的CML基因診斷技術(shù)具有極其廣闊的應(yīng)用前景。電化學(xué)DNA生物傳感器是采用電化學(xué)換能器，用電化學(xué)手段選擇性檢測特定DNA 序列(基因)的生物傳感器。有關(guān)電化學(xué)DNA生物傳感器的綜述性文章已有較多報道，主 要針對電極(玻碳電極、金電極、碳糊電極等)表面ssDNA探針的固定化與高靈敏度的電化 學(xué)雜交指示劑(即標(biāo)識物)的篩選進(jìn)行研究。在適當(dāng)?shù)臏囟取H、離子強(qiáng)度下，電極表面的 DNA探針分子能與靶序列選擇性地雜交，形成雙鏈DNA(dsDNA)，從而導(dǎo)致電極表面結(jié)構(gòu)的 改變。這種雜交前后的結(jié)構(gòu)差異，可以通過具有電活性的雜交指示劑來識別，從而達(dá)到檢測 靶序列(或特定基因)的目的。DNA探針與互補(bǔ)鏈間的相互作用在很大程度上影響了電化學(xué)傳感器的性能，且用 以設(shè)計(jì)感器的ssDNA多數(shù)存在穩(wěn)定性差的問題。所以，研制高靈敏度和高特異性的DNA探 針，將其應(yīng)用于與互補(bǔ)序列間的雜交信息的檢測具有重要意義。現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明慢粒白血病Ph染色體為t (9 ；22)相互易位所致，其易位 產(chǎn)物BCR/ABL融合基因發(fā)生于95%以上的慢性粒細(xì)胞白血病中，是惡性克隆的標(biāo)志基因。下面所述為本發(fā)明人率先將設(shè)計(jì)的慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因探針(5’ 修飾氨基或巰基探針、5’修飾氨基或巰基發(fā)夾探針、5’修飾氨基或巰基鎖核酸探針、3’修 飾氨基或巰基的捕獲探針和5’修飾生物素的信號探針)，根據(jù)不同類型材料電極(金、玻 碳、碳糊電極等)，選擇不同組裝方式將核酸探針修飾到電極表面((表面含有羧基的電極 以EDC和NHS作為偶聯(lián)活化劑將氨基修飾探針到電極表面，金表面電極以金硫鍵將巰基修 飾探針固定到電極表面)，形成ssDNA探針修飾電極；再利用電化學(xué)雜交指示劑(姜黃素、蘆薈大黃素、丹參酮和吖啶酮衍生物)或電化學(xué)酶聯(lián)免疫方法，將DNA雜交前后信息變化轉(zhuǎn) 化為可測定的電化學(xué)響應(yīng)信號(電流、電壓或電導(dǎo)/電阻)變化，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)慢性粒細(xì) 胞白血病BCR/ABL融合基因片斷的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例所要解決的技術(shù)問題在于提供用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL 融合基因的電化學(xué)DNA傳感器，旨在解決現(xiàn)有檢測方法靈敏度低、檢測周期長、價格昂貴寸。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因的電 化學(xué)DNA傳感器，待檢測BCR/ABL融合基因，包括如下步驟(1)從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中查找BCR/ABL融合基因的融合位點(diǎn)，選擇位點(diǎn)前后的堿 基作為人工合成的探針使用，選出BCL-ABL基因中突變率最高的基因片段作為探針，經(jīng)過 同源比對，將對應(yīng)序列作為CML的特異性序列進(jìn)行合成(5’ -NH2 (或SH) AGA GTT CAAAAG CCCTTC-3，，發(fā)夾式 5' -NH2(或 SH)-(CH2)6-TTCCMC TCT CAA TGG CTG CCT CCCGTTGG-3'、 鎖核酸5，-NH2(或SH)、3，端巰基標(biāo)記的LNA捕獲探針5，-CLGG CCA GTA GCLATCT GAC TTTL G-TTT TTT TTT T-SH-3，;5，端生物素標(biāo)記的 LNA 信號探針 5，-Biotin-GC ALGA GLTT CLAAALAG CLCC TLTC ALG-3’(L為鎖核酸單體位置)，其中對LNA的設(shè)計(jì)，考慮到使用最少 的鎖核酸單體，但能較好地保持探針鏈的剛性并提高其特異性.(3)對于氨基或巰基修飾探針，利用化學(xué)鍵合法將探針固定到電極表面(表面含 有羧基的電極以EDC和NHS作為偶聯(lián)活化劑將氨基修飾探針到電極表面，金表面電極以金 硫鍵將巰基修飾探針固定到電極表面)，形成ssDNA修飾電極。再利用篩選和合成的電化 學(xué)雜交指示劑來識別雜交前后電化學(xué)信號的變化，選擇性地檢測靶序列即慢性粒細(xì)胞白血 病BCR/ABL融合基因片斷。當(dāng)互補(bǔ)序列DNA的濃度發(fā)生改變時，雜交信息轉(zhuǎn)化為可測定的 指示劑電化學(xué)響應(yīng)信號(電流、電壓或電導(dǎo)/電阻)變化。在一定范圍內(nèi)指示劑的響應(yīng)信 號與待測DNA片斷的濃度成線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基 因片斷的檢測。(4)對于利用酶聯(lián)免疫方法的修飾探針，采用化學(xué)鍵合法或自組裝膜法固定捕獲 探針，但對金材料電極表面未結(jié)合的位點(diǎn)通過封閉劑(巰基己醇，巰基乙酸，牛血清白蛋 白，酪蛋白等)進(jìn)行封閉；在特定的條件下，固定在電極表面的捕獲探針和5'端標(biāo)記有生 物素的信號探針雜交可以與目標(biāo)互補(bǔ)DNA進(jìn)行雜交；再將修飾有親和素的酶(辣根過氧化 物酶等)利用結(jié)合到5'端標(biāo)記有生物素的信號探針上去，利用酶的信號放大作用，通過檢 測酶催化底物(3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺等)雜交前后電信號的差異，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo) 慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因片斷的檢測與現(xiàn)有臨床慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因技術(shù)相比，該技術(shù)的檢測周期相 對較短、靈敏度高，為臨床上快速靈敏診斷提供可能。


圖1為本發(fā)明構(gòu)建了氨基或巰基修飾探針的用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL 融合基因的電化學(xué)DNA生物傳感器的機(jī)理圖
圖2為本發(fā)明構(gòu)建了酶聯(lián)免疫方法的用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基 因的電化學(xué)DNA生物傳感器的機(jī)理3為本發(fā)明的鎖核酸修飾的三明治型電化學(xué)DNA生物傳感器檢測BCR/ABL融合 基因的不同目標(biāo)序列檢測圖。圖4為本發(fā)明的鎖核酸修飾的三明治型電化學(xué)DNA生物傳感器檢測BCR/ABL融合 基因的電信號檢測圖。圖3中鎖核酸探針與完全互補(bǔ)、單堿基錯配或完全錯配DNA雜交后在三明治型電 化學(xué)DNA生物傳感器檢的電流-時間曲線圖完全互補(bǔ)DNA (a)，單堿塞錯配DNA (b)，完全錯 配DNA (c)，捕獲探針(d)，背景電流(e).圖4中㈧不同濃度的雜交鏈電化學(xué)信號比較；目標(biāo)DNA量從(a)到(h)分別為 IOnM, 5nM, InM, IOOpM, IOpM, IOOfM and IOfM0插入圖片為電流與目標(biāo)DNA濃度的對數(shù)坐標(biāo) 圖。(B)電流強(qiáng)度與目標(biāo)DNA濃度的線性關(guān)系圖(濃度范圍10 250fM)
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋 本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因的電化學(xué)DNA 傳感器，待檢測BCR/ABL融合基因，包括如下步驟(1)從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中查找BCR/ABL融合基因的融合位點(diǎn)，選擇位點(diǎn)前后的堿 基作為人工合成的探針使用，選出BCL-ABL基因中突變率最高的基因片段作為探針，經(jīng)過 同源比對，將對應(yīng)序列作為CML的特異性序列進(jìn)行合成(5’ -NH2 (或SH) AGA GTT CAAAAG CCCTTC-3，，發(fā)夾式 5' -NH2(或 SH)-(CH2)6-TTCCMC TCT CAA TGG CTG CCT CCCGTTGG-3'、 鎖核酸5，-NH2(或SH)、3，端巰基標(biāo)記的LNA捕獲探針5，-CLGG CCA GTA GCLATCT GAC TTTL G-TTT TTT TTT T-SH-3，;5，端生物素標(biāo)記的 LNA 信號探針 5，-Biotin-GC ALGA GLTT CLAA ALAG CLCC TLTC ALG-3，(L 為鎖核酸單體位置)。(2)對于氨基或巰基修飾探針(圖1 :2探針)，利用化學(xué)鍵合法將1 X 10-6mol/L探 針固定到電極表面(圖1 :1電極)(表面含有羧基的電極以5mmol/L EDC和8mmol/LNHS為 偶聯(lián)活化劑的20 μ 1緩沖液將氨基修飾探針到電極表面；金表面電極以金硫鍵將巰基修飾 探針固定到電極表面，對未結(jié)合的金位點(diǎn)通過IX 10_5mol/L巰基己醇，IX 10_5mol/L巰基乙 酸，0.5%牛血清白蛋白，0.5%酪蛋白等封閉劑進(jìn)行封閉，封閉后，需采用洗滌劑洗滌除去 非特異性吸附，如0. 2mol/L pH 7. 4PBS、0. 2% SDS等)，形成ssDNA修飾電極。再在合適的 條件(DNA雜交溶液酸度、雜交溫度、時間、離子強(qiáng)度)下，利用篩選和合成的電化學(xué)雜交指 示劑(圖1 :3電化學(xué)雜交指示劑)(姜黃素、蘆薈大黃素、丹參酮和吖啶酮衍生物)來識別 雜交(圖1 :4目標(biāo)DNA)前后電化學(xué)信號的變化，選擇性地檢測靶序列即慢性粒細(xì)胞白血病 BCR/ABL融合基因片斷。(3)對于利用酶聯(lián)免疫方法的巰基(-SH)鎖核酸修飾探針(圖2)為例，采用自 組裝膜法固定lX10_6mOl/L捕獲探針，根據(jù)帶巰基(-SH)的捕獲探針在金電極表面可以 形成自組裝單分子膜的特性來固定，對金電極表面未結(jié)合的位點(diǎn)通過封閉劑進(jìn)行封閉，如1 X 10_5mo 1 /L巰基己醇，1 X 10_5mo 1/L巰基乙酸，0.5%牛血清白蛋白，0.5%酪蛋白等。封閉 后，需采用洗滌劑洗滌除去非特異性吸附，如0. 2mol/L pH 7. 4PBS、0. 2% SDS等。(4)在相同條件下用紫外分光光度法分別繪制LNA-DNA的解鏈溫度曲線。在石 英比色皿中加入一定濃度的LNA探針，而后加入同濃度的互補(bǔ)序列，室溫雜交30min。以 0. 40C /min的升溫速率，從10°C升至110°C，每間隔1°C，于260nm處測得相應(yīng)溶液的吸光 度，并進(jìn)行空白校正，繪制吸光度-溫度曲線。選擇特定的溫度作為探針與互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交 的溫度；(5)在特定的溫度下，固定在電極表面的捕獲探針(lX10_6mol/L)和5'端標(biāo)記有 生物素的信號探針(lX10_6mol/L)雜交可以與目標(biāo)互補(bǔ)DNA實(shí)現(xiàn)共雜交，在電極表面形成 三明治結(jié)構(gòu)，此時三明治結(jié)構(gòu)中含有信號探針末端標(biāo)記的生物素；在酶加入前也需要對未 結(jié)合的位點(diǎn)通過封閉劑進(jìn)行封閉，如巰基己醇，巰基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等，另外再 采用洗滌劑洗滌除去非特異性吸附，如PBS、0. 2% SDS等。(6)由于辣根過氧化物酶(HRP)上修飾有親和素(avidin)，根據(jù)親和素與生物素 之間的親和作用，將酶(濃度稀釋1 1000)結(jié)合上去，酶作用后，需采用洗滌劑洗滌除去 非特異性吸附，如0. 5% Tween 20,0. 2mol/L pH 7. 4PBS、0. 2% SDS等。主要利用酶的信號 放大作用，在底物3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)中采用安培電流時間曲線法研究雜交 前后電信號的差異。本發(fā)明檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因的電化學(xué)DNA生物傳感器具有高 靈敏度，高特異性的特點(diǎn)，且相對其它的檢測方法成本低。本發(fā)明適應(yīng)于慢性粒細(xì)胞白血 病基因型與腫瘤相關(guān)性的研究，白血病發(fā)生和發(fā)展的檢測。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
利用電化學(xué)DNA生物傳感器檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因。
2.用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因的電化學(xué)DNA生物傳感器，包括不同 類型材料電極(金、玻碳、碳糊電極等)，不同類型核酸探針(5’修飾氨基或巰基探針、5’修 飾氨基或巰基發(fā)夾探針、5’修飾氨基或巰基鎖核酸探針、3’修飾氨基或巰基的捕獲探針和 5’修飾生物素的信號探針)，不同類型電化學(xué)雜交指示劑(姜黃素、蘆薈大黃素、丹參酮和 吖啶酮衍生物)和電化學(xué)酶聯(lián)免疫方法，進(jìn)行慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因測定。其 特征在于采用化學(xué)鍵合技術(shù)、分子雜交技術(shù)、鎖核酸探針技術(shù)、電化學(xué)酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié) 合制作電化學(xué)DNA生物傳感器，該傳感器包含與待測DNA互補(bǔ)的修飾核酸探針，通過與目標(biāo) 互補(bǔ)DNA進(jìn)行雜交，再利用電化學(xué)分析方法檢測電化學(xué)雜交指示劑電信號或酶催化底物產(chǎn) 生電信號，從而實(shí)現(xiàn)對慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因的測定。
3.如權(quán)利要求1和2所述用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因的電化學(xué) DNA生物傳感器，其特征在于所述的修飾探針序列為慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因 (5，-NH2 (或 SH) AGA GTT CAAAAG CCC TTC-3，，發(fā)夾式 5 ‘ -NH2 (或 SH) - (CH2) 6-TTCCAAC TCTCAA TGG CTG CCT CCC GTTGG-3 ‘、鎖核酸 5，-NH2 (或 SH)—AlGA GTT CAlA AAG CCClTTC-3'、3，端巰基標(biāo)記的LNA捕獲探針5，-ClGG CCA GTA GClA TCT GAC TTTl G-TTTTTT TTT T-SH-3，；5，端生物素標(biāo)記的 LNA 信號探針 5，-Biotin-GC AlGA GlTT ClAAAlAG ClCC TlTC AlG-3' (L為鎖核酸單體位置)。
4.權(quán)利要求1、2和3所述的化學(xué)鍵合法，分子雜交技術(shù)和電化學(xué)分析方法，依序包括 如下步驟利用化學(xué)鍵合法將探針固定到電極表面(表面含有羧基的電極以EDC和NHS作 為偶聯(lián)活化劑將氨基修飾探針到電極表面，金表面電極以金硫鍵將巰基修飾探針固定到電 極表面)，形成ssDNA修飾電極。再利用篩選和合成的電化學(xué)雜交指示劑來識別雜交前后電 化學(xué)信號的變化，選擇性地檢測靶序列即慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因片斷。當(dāng)互 補(bǔ)序列DNA的濃度發(fā)生改變時，雜交信息轉(zhuǎn)化為可測定的指示劑電化學(xué)響應(yīng)信號(電流、電 壓或電導(dǎo)/電阻)變化。在一定范圍內(nèi)指示劑的響應(yīng)信號與待測DNA片斷的濃度成線性關(guān) 系，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因片斷的檢測。
5.權(quán)利要求1、2和3所述的電化學(xué)酶聯(lián)免疫方法，依序包括如下步驟(1)采用化學(xué)鍵 合法或自組裝膜法固定捕獲探針，但對金材料電極表面未結(jié)合的位點(diǎn)通過封閉劑(巰基己 醇，巰基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等)進(jìn)行封閉；(2)在特定的條件下，固定在電極表面 的捕獲探針和5'端標(biāo)記有生物素的信號探針雜交可以與目標(biāo)互補(bǔ)DNA進(jìn)行雜交；(3)將修 飾有親和素的酶(辣根過氧化物酶等)利用結(jié)合到5'端標(biāo)記有生物素的信號探針上去，利 用酶的信號放大作用，通過檢測酶催化底物(3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺等)雜交前后電 信號的差異，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因片斷的檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測慢性粒細(xì)胞白血病BCR/ABL融合基因的電化學(xué)DNA生物傳感器，待檢測基為慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的BCR/ABL融合基因，包括如下步驟(1)根據(jù)所選擇的待檢測CML基因型別通用引物序列的融合位點(diǎn)，對CML的特異性序列進(jìn)行設(shè)計(jì)及合成；(2)采用化學(xué)鍵合技術(shù)、分子雜交技術(shù)、鎖核酸探針技術(shù)、電化學(xué)酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建電化學(xué)DNA生物傳感器用于檢測CML的BCR/ABL融合基因。該傳感器極大地增強(qiáng)了靈敏度和特異性，可實(shí)現(xiàn)對慢性粒細(xì)胞白血病的早期診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101928767SQ200910112090
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者劉愛林, 林新華, 王昆, 陳偉, 陳敬華 申請人:林新華;劉愛林;陳敬華;王昆;陳偉