利用gfp蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其將GFP蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏蝎@得轉(zhuǎn)基因植物，通過檢測轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉在紫外光的激發(fā)下是否呈現(xiàn)綠色熒光來檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化，從而篩選出轉(zhuǎn)化組織；本發(fā)明中將含有GFP蛋白的表達(dá)載體pB7WG2D通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，叢生芽誘導(dǎo)時期即可進(jìn)行GFP蛋白的檢測，確保了篩選出的叢生芽都是轉(zhuǎn)化組織，并且避免了篩選劑的使用，節(jié)省了非轉(zhuǎn)化組織的繼代培養(yǎng)工作，從而提高了基因的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
【專利說明】利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因植物的檢測通常采用PCR擴增、Southern雜交和ELISA等分子技術(shù)，這些檢測技術(shù)必須在獲得抗性植株后才能進(jìn)行，并不能在培育轉(zhuǎn)基因植株的過程中應(yīng)用；且需要提取植株的基因組DNA或蛋白，對DNA或蛋白的純度和濃度均高質(zhì)量的要求。因此，有必要給出一種在轉(zhuǎn)基因植株的培育過程進(jìn)行實時、簡便的檢測的方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其可在煙草轉(zhuǎn)基因植株的培育過程進(jìn)行實時、簡便的檢測。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0005]一種利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法，具體操作為:將GFP蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏蝎@得轉(zhuǎn)基因植物，通過檢測轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉在紫外光的激發(fā)下是否呈現(xiàn)綠色熒光來檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化，從而篩選出轉(zhuǎn)化組織；
[0006]GFP蛋白編碼基因的喊基序列如SEQ ID NO: I所不。
[0007]具體的操作為:
[0008]將表達(dá)載體pB7WG2D采用凍融法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌LBA4404中構(gòu)建得到重組菌LBA4404/pB7WG2D ;表達(dá)載體pB7WG2D中含有啟動子和連接在啟動子下游的GFP蛋白的編碼
基因;
[0009]將制備好的重組菌LBA4404/pB7WG2D的菌液進(jìn)行活化，用菌液以共培養(yǎng)方式浸染煙草葉盤，暗培后將葉盤移入至恢復(fù)培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)I周后移入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后熒光檢測篩選轉(zhuǎn)化的叢生芽，將其切下后移入伸長培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，采用熒光檢測繼代培養(yǎng)獲得的抗性苗，將發(fā)綠色熒光的再生苗移入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得組培植株，最后將組培植株經(jīng)過馴化后，移入營養(yǎng)土中栽培。
[0010]啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子和Ubiquitin啟動子。
[0011]將煙草種子用次氯酸鈉溶液消毒，用OD值在0.6~0.8之間的菌液以共培養(yǎng)方式浸染煙草葉盤5分鐘，暗培3天。
[0012]本發(fā)明中將含有GFP蛋白的表達(dá)載體pB7WG2D通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，叢生芽誘導(dǎo)時期即可進(jìn)行GFP蛋白的檢測，確保了篩選出的叢生芽都是轉(zhuǎn)化組織，并且避免了篩選劑的使用，節(jié)省了非轉(zhuǎn)化組織的繼代培養(yǎng)工作，從而提高了基因的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
[0013]另外，雖然該方法相對于分子檢測，操作簡便，快速高效，且利用手?jǐn)y式長波紫外燈檢測含有GFP的轉(zhuǎn)基因植物，可以進(jìn)行活體的實時檢測，但是這種檢測方法的還是存在一定的缺陷，亦即必須要有足夠的GFP轉(zhuǎn)錄，如果GFP轉(zhuǎn)錄不足的話，就會導(dǎo)致熒光現(xiàn)象不足而檢測不出來。因此，如何在GFP轉(zhuǎn)錄不足的情況下依然可以檢測到強熒光信號也是本發(fā)明的關(guān)鍵，本發(fā)明通過法國VILBER Fusion FX7成像系統(tǒng)對GFP綠色熒光蛋白進(jìn)行檢測，F(xiàn)usion FX7采用固定的H).95大光圈鏡頭，能夠保證透光率最大，即使再微弱的光也能夠被有效傳至CXD傳感器，另外，低于室溫67 V的4級Pelti er制冷CXD，使得成像過程中所產(chǎn)生的暗電流更小，背景噪音更低，進(jìn)一步保證了熒光檢測的高靈敏度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為FX7熒光檢測篩選轉(zhuǎn)化的叢生芽；
[0015]圖2為FX7熒光檢測伸長的叢生芽；
[0016]圖3為PCR分別擴增GFP基因和BAR基因結(jié)果。
【具體實施方式】
[0017]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]實施例1、培育轉(zhuǎn)GFP煙草植株
[0019]將表達(dá)載體pB7WG2D采用凍融法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌LBA4404 (Invitrogen公司，產(chǎn)品編號18313015)中構(gòu)建重組菌LBA4404/pB7WG2D。表達(dá)載體pB7WG2D中含有啟動子和連接在啟動子下游的GFP 蛋白的編碼基因；啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子和Ubiquitin啟動子。
[0020]GFP蛋白編碼基因的喊基序列如SEQ ID NO: I所不；
[0021]SEQ ID NO: I
[0022]tggtgaagactaatctttttctctttttcatcttttcacttctcctatcattatcctcggccgacatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagtteatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagaaggacgagctgtaa
[0023]將煙草種子用次氯酸鈉溶液消毒，將制備好的重組菌LBA4404/pB7WG2D菌液進(jìn)行活化，用OD (吸光)值在0.6-0.8之間的菌液以共培養(yǎng)方式浸染煙草葉盤5分鐘，再暗培養(yǎng)3天。將暗培養(yǎng)后的葉盤移入到恢復(fù)培養(yǎng)基(B5大量鹽和微量鹽，MS鐵鹽，B5維生素，3%鹿糖，0.59g.L-1Mes, 1.7mg.L-16-BA, IOOmg.L-lcefotaxime, 0.8%瓊脂，PH = 5.6)。
[0024]恢復(fù)培養(yǎng)I周后，移入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基(Β5大量鹽和微量鹽，MS鐵鹽，Β5維生素，3 % 鹿糖，0.59g.L-lMes, 1.7mg.L-16-AP, IOOmg.L-lcefotaxime, 5mg.L-1PPT,
0.8%瓊脂，PH= 5.6)，采用FX7熒光檢測來篩選轉(zhuǎn)化的叢生芽，如圖1所示，將其切下后移入伸長培養(yǎng)基(MS大量鹽和微量鹽，MS鐵鹽，B5維生素，3%蔗糖，0.59g.L-1Mes,
0.1mg.L_1 IAA, IOOmg ?L-lcefotaxime, 0.8%瓊脂，PH = 5.6),每隔 I 周繼代 I 次。待伸長的抗性苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基之前，再次采用FX7熒光檢測抗性苗，將發(fā)綠色熒光的再生苗(圖2)移入生根培養(yǎng)基(1/2濃度的B5大量鹽和微量鹽，MS鐵鹽，2%蔗糖，0.59g.L-lMes, Img *L-1IAB,0.8%瓊脂，PH = 5.6)，獲得組培植株10株。最后將組培植株經(jīng)過馴化后，移入營養(yǎng)土中栽培。
[0025]實施例2、轉(zhuǎn)GFP煙草植株的PCR鑒定
[0026]分別提取上述獲得的轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA，PCR分別檢測GFP基因和BAR基因，結(jié)果如圖3所示，野生型煙草均未擴增出GFP基因和BAR基因的特異條帶，而經(jīng)過綠色熒光蛋白篩選得到的10株轉(zhuǎn)化植株，全部擴增出GFP基因和BAR基因的特異條帶，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。
[0027]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
【權(quán)利要求】
1.一種利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法，具體操作為:將GFP蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏蝎@得轉(zhuǎn)基因植物，通過檢測轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉在紫外光的激發(fā)下是否呈現(xiàn)綠色熒光來檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化，從而篩選出轉(zhuǎn)化組織； GFP蛋白編碼基因的喊基序列如SEQ ID NO:I所不。
2.如權(quán)利要求1所述的利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，具體的操作為: 將表達(dá)載體PB7WG2D采用凍融法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌LBA4404中構(gòu)建得到重組菌LBA4404/pB7WG2D ;表達(dá)載體pB7WG2D中含有啟動子和連接在啟動子下游的GFP蛋白的編碼基因; 將制備好的重組菌LBA4404/pB7WG2D的菌液進(jìn)行活化，用菌液以共培養(yǎng)方式浸染煙草葉盤，暗培后將葉盤移入至恢復(fù)培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)I周后移入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后熒光檢測篩選轉(zhuǎn)化的叢生芽，將其切下后移入伸長培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，采用熒光檢測繼代培養(yǎng)獲得的抗性苗，將發(fā)綠色熒光的再生苗移入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得組培植株，最后將組培植株經(jīng)過馴化后，移入營養(yǎng)土中栽培。
3.如權(quán)利要求2所述的利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子和Ubiquitin啟動子。
4.如權(quán)利要求2所述的利用GFP蛋白檢測煙草遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于:將煙草種子用次氯酸鈉溶液消毒，用OD值在0.6~0.8之間的菌液以共培養(yǎng)方式浸染煙草葉盤5分鐘，暗培3天。
【文檔編號】C12N15/64GK103993035SQ201410017274
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】宋雯雯, 段方猛 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)