一種檢測牛MSTN基因mRNA表達水平的特異性引物和熒光定量檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種檢測牛MSTN基因 mRNA表達水平的 特異性引物和熒光定量PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR)是DNA體外操作技術中最 常用的技術。PCR技術將模板DNA、特異性引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶、鎂離子等放 在同一個緩沖反應體系中，進行反復高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環(huán)，實現(xiàn)靶DNA 片段在反應液中呈2n倍擴增(其中η為熱循環(huán)次數(shù))。
[0003] 熒光定量PCR技術是在普通PCR反應的基礎上，結合了實時熒光檢測技術和計算 機分析技術。熒光定量PCR在普通PCR反應體系中加入特定的熒光標記物質(zhì)，通過檢測每 個熱循環(huán)后PCR反應體系中的熒光值的變化情況來實時監(jiān)測DNA的擴增情況，并獲得每個 樣本的熒光定量變化曲線，進而獲得每個反應管的Ct值(熒光變化達到閾值時的循環(huán)數(shù)）； 同時，在相同的反應體系和反應條件下檢測2-10個倍數(shù)稀釋的已知數(shù)量的靶標DNA，獲得 其Ct值，以起始模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標制備標準曲線，據(jù)此標準曲線和 各個標本的Ct值對每個反應的起始DNA模板數(shù)進行定量測定。
[0004] 雖然Northern blot技術可檢測基因的mRNA表達水平，但整個實驗過程操作比較 復雜。Northern blot實驗中一個主要的問題是存在RNA的降解，所以Northern Blot中 所有的實驗用品都需要經(jīng)過除去RNA酶的過程，如高溫烘烤、DEPC處理等。另外，Northern Blot中很多實驗用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等等對人體都有一定的傷害?；蛐酒瑢嶒?雖然降低了實驗人員的工作量，并可以在一次實驗中同時檢測幾千個基因表達量變化，但 是其靈敏度較低。
[0005] 而SYBR Green是一種結合于雙鏈DNA小溝中的結合染料。與雙鏈DNA結合后，其 熒光大大增強。該性質(zhì)用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR Green的最大吸收波長約為 497 nm，發(fā)射波長最大約為520 nm。在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒 光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā) 射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
[0006] SYBR Green在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈DNA相結 合，不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。此外，由于 一個PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結合，因此SRYB Green的靈敏度很高。但是，由于SYRB Green與所有的雙鏈DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產(chǎn)物引 起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn) 物的影響。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量結果。
[0007] MSTN全稱肌生成抑素（Myostatin)，是1997年美國John Hopkins大學醫(yī)學院的 一個研宄小組在研宄轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β )時發(fā)現(xiàn)的一種新的生長因子，被命名為生 長/分化因子-8(GDF-8)。MSTN缺失的鼠肌肉增大，骨骼肌肌群分布更廣泛，體重約是野生 鼠2倍。雙肌牛中MSTN基因發(fā)生突變，結果在同樣喂食條件下，雙肌牛比普通牛多提供30 %的肉產(chǎn)品。由于MSTN對骨骼肌的生長具有負調(diào)控作用，所以又命名為肌生成抑素。該因 子一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就受到科學工作者的廣泛重視，現(xiàn)已成為分子生物學領域的一個研宄熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種檢測肌生成抑素（Myostatin，MSTN)基因 mRNA表達水平的特 異性引物和熒光定量PCR檢測試劑盒。通過大量的實驗研宄，我們優(yōu)化出了一套能夠有效 檢測不同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)MSTN基因 mRNA表達量的引物和PCR反應的條件，并 組裝成MSTN基因 mRNA表達檢測熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，以滿足生命科學、醫(yī)學和 畜牧獸醫(yī)研宄者的檢測需要。
[0009] 本發(fā)明提供一種檢測牛MSTN基因 mRNA表達水平的特異性引物，所述特異性引物 的核苷酸序列為： 上游引物序列為：5' -AACCAGGAGAAGATGGAC-3' ； 下游引物序列為：5 ' -TTAGAGGGTAACGACAGC-3 '。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種牛MSTN基因 mRNA表達水平的熒光定量PCR檢測 試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物，所述特異性引物序列為： 上游引物序列為：5' -AACCAGGAGAAGATGGAC-3' ； 下游引物序列為：5 ' -TTAGAGGGTAACGACAGC-3 '。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括SYBR Green染料。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
[0013] 進一步地，所述陽性對照的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No. 3。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述試劑盒的使用方法，是以待測cDNA為模板，利用 權利要求1所述的特異性引物和SYBR Green染料進行實時熒光定量PCR，記錄Ct值，并以 MSTN標準基因作為陽性對照繪制標準曲線，據(jù)此標準曲線和Ct值進行定量測定。
[0015] 優(yōu)選地，所述實時熒光定量PCR的反應條件是：95°C預變性30秒；95°C 5秒， 57. 6°C 20秒，捕捉焚光信號，循環(huán)40次。
[0016] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種牛MSTN基因 mRNA表達水平的定量檢測方法，是 以待測cDNA為模板，利用權利要求1所述的特異性引物和SYBR Green染料進行實時熒光 定量PCR，記錄Ct值，并以MSTN標準基因作為陽性對照繪制標準曲線，據(jù)此標準曲線和Ct 值進行定量測定。
[0017] 優(yōu)選地，所述實時熒光定量PCR的反應條件是：95°C預變性30秒；95°C 5秒， 57. 6°C 20秒，捕捉焚光信號，循環(huán)40次。
[0018] 本發(fā)明的第五個目的是提供上述特異性引物、試劑盒、序列表中SEQ ID No. 3所述 的核苷酸序列在定量檢測牛MSTN基因 mRNA表達水平中的應用；優(yōu)選地，所述牛為黃牛、奶 牛和牦牛。
[0019] 與現(xiàn)有最好技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于： 1.本發(fā)明實現(xiàn)了方便快捷的定量檢測MSTN基因 mRNA表達水平的目的，可以監(jiān)測不同 牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)、不同組織、不同時期的肌肉生長發(fā)育狀態(tài)，同時可以鑒定與 肌肉發(fā)育異常相關的疾病。
[0020] 2.本發(fā)明在檢測基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實驗成本低的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0021] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為MSTN基因 mRNA表達水平的熒光檢測結果圖。其中，A :擴增曲線，橫坐標為PCR 循環(huán)次數(shù)，縱坐標為相對焚光量值（Relative Fluorescence Units，RFU);B:恪解曲線，橫 坐標為溫度，縱坐標為單位溫度下相對熒光值的變化量。
【具體實施方式】
[0022] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0023] 其中，SYBR Green染料購自寶生物工程(大連）有限公司。
[0024] 實施例1 本發(fā)明的MSTN基因 mRNA表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒由以下組分組成： 2XSYBR GREEN MIX 5mL ； 陽性對照：標準MSTN基因模板 500 μ L ; 引物混合液 500 yL; 超純水 5mL。
[0025] 其中，2X SYBR GREEN MIX 由以下組分組成：Taq DNA 聚合酶 0· I U/μ UdNTPs 底 物 0· 4 mmol /1,、Mg2+ 5. 0 mmol/L、KCl 100 mmol/L、ρΗ8· 3 的 Tris · HCl 20 mmol/L、質(zhì)量 百分含量為〇. 02%的明膠和SYBR Green染料。
[0026] 引物混合液：上游引物8 ymol/L、下游引物8 ymol