一種新型隱球菌檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型隱球菌（CN-DNA）檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化鉀20～300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反應液中包含用于CN-DNA檢測的引物和探針序列如下，CN-DNA上游引物：TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，CN-DNA下游引物：GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，CN-DNA探針：CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。使用本發(fā)明的試劑盒檢測新型隱球菌的靈敏度高，定量線性范圍寬；應用該試劑盒可以對全血、血清（血漿）、肺泡灌洗液等培養(yǎng)物中的CN-DNA進行快速準確的檢測，為診斷新型隱球菌感染提供可靠的實驗依據(jù)。
【專利說明】一種新型隱球菌檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明提供一種新型隱球菌檢測試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的CN檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]新型隱球菌(Cryptococcus Neoformans, CN)是一種可引起人類嚴重感染的酵母樣病原真菌，主要引起細胞免疫功能低下者，如器官移植、長期應用激素及艾滋病(AIDS)患者并發(fā)隱球菌病。
[0003]新型隱球菌通常經呼吸道或皮膚黏膜破損處侵入人體，血行播散至腦、骨骼和皮膚。有80%病例中樞神經系統(tǒng)受損，引起慢性腦膜炎，此外，還可引起肺隱球菌病，以及其他感染，如侵害淋巴結、骨、皮膚等引起炎癥、膿腫等。臨床檢測方法主要有墨汁染色、腦脊液細胞形態(tài)學檢驗、組織病理學方法等。墨汁染色和腦脊液細胞形態(tài)學檢驗、組織病理學方法均難以計數(shù)，且需進行創(chuàng)傷性操作，臨床應用具有局限性。
[0004]近年來以DNA為基礎的PCR分子生物學檢測方法因快速、準確而倍受關注，成為探索的熱點，主要包括巢式PCR (nest PCR)、實時突光定量PCR (real-time fluorescencequantify PCR)等。由于實時熒光定量PCR在速度、操作、特異性等多方面存在眾多優(yōu)勢，因此臨床上其中新型隱球菌感染早期診斷領域的應用愈加廣泛，給臨床診斷和治療帶來了重要的指導意義。
[0005]運用熒光PCR技術檢測新型隱球菌DNA主要包括新型隱球菌核酸提取和核酸PCR擴增兩方面。
[0006]目前國內臨床上主要采用機械破碎法對新型隱球菌核酸進行提取:先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，反復高速震蕩和高速離心，再取上清為模板。該方法的優(yōu)點在于對于樣本中的PCR抑制物去除較徹底，但存在步驟繁瑣，操作時間長，對于操作人員技術水平要求高和需添置專門的設備等不足之處。
[0007]臨床上檢測CN-DNA的方法目前主要是基于實時熒光定量PCR的技術及其改進，實時熒光定量PCR技術是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán)的擴增水平，試驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴增曲線，根據(jù)擴增曲線與熒光閾值線的交點(即Ct值)以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品，則可以通過軟件自動分析獲得標準曲線，由此實現(xiàn)對未知樣本的定值(即定量檢測)。與傳統(tǒng)的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，熒光報告基團發(fā)出的熒光能量被淬滅基團吸收，呈現(xiàn)淬滅效應；如果擴增過程中有靶序列的存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉移效應，熒光報告基團發(fā)出的熒光信號被熒光檢測裝置收集。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現(xiàn)線性增強。試驗結束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果，因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應用。
[0008]目前國外已有基于實時熒光定量PCR技術檢測CN-DNA的試劑盒，但這些試劑盒的核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，樣本中的DNA存在損耗，尤其對于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低。且其檢測靈敏度不高，某些弱陽性樣本經常無法擴增。這些試劑盒大多缺乏完善的質控體系，還需要進一步完善和提高技術水平，使此類產品更加滿足臨床準確診斷的需要。另外，受限于現(xiàn)有技術中針對CN-DNA檢測的引物探針序列，本領域還需要開發(fā)出一種檢測CN-DNA特異性好且綜合性能優(yōu)良的PCR檢測試劑盒。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明提供一種核酸釋放劑在新型隱球菌檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2%和乙醇0.05~1%。
[0010]在本發(fā)明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領域常用的，例如為無菌水或TE緩沖液。本發(fā)明首次披露在CN檢測中使用含強蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡化了該核酸檢測的步驟，而且檢測靈敏度有了很大的提高。
[0011]本發(fā)明提供一種新型隱球菌(CN-DNA)檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) 0.01~0.5mmol/L,氯化鉀20~300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應液中包含用于CN-DNA檢測的引物和 探針序列如下，
[0012]CN-DNA 上游引物:TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，
[0013]CN-DNA 下游引物:GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
[0014]CN-DNA 探針:CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
[0015]使用本發(fā)明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測結果沒有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提?。槐景l(fā)明試劑盒檢測CN的靈敏度高，定量線性范圍寬。另外，本發(fā)明的試劑盒因采用用于檢測靶多核苷酸的上述引物和探針序列，具有很好的特異性。
[0016]本發(fā)明中，優(yōu)選所述試劑盒中還包括內標，且所述PCR反應液中還包含用于檢測內標的引物和探針序列，
[0017]內標:AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA ；
[0018]內標上游引物:TGAAGACTTACACAAGCCTGGG,
[0019]內標下游引物:TGAATCCTTGCAGCACTGTC，
[0020]內標探針:ACTACCCGGTACTAACTATGITGGGCCTG。
[0021]本發(fā)明中所述內標為插入pUC18T載體的一段長為125堿基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，它作為PCR擴增體系中的陽性內對照，預防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質導致的假陰性。
[0022]優(yōu)選本發(fā)明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ U I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產物，利用UNG酶和PCR反應液中的dUTP可以起到預防PCR產物污染的作用，從而防止樣本檢測假陽性。
[0023]在一個【具體實施方式】中，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內標、PCR反應液、酶混合液、CN定量參 考品、CN陽性對照、CN陰性對照和CN濃縮液。
[0024]本發(fā)明還提供一種新型隱球菌CN-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用于CN-DNA檢測的引物和探針序列如下，
[0025]CN-DNA 上游引物:TGGACTTGGATTTGGGTGTTT，
[0026]CN-DNA 下游引物:GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
[0027]CN-DNA 探針:CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
[0028]本發(fā)明提供的新型隱球菌熒光定量PCR檢測試劑盒操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬，應用該試劑盒可以對全血、血清(血漿)、肺泡灌洗液等培養(yǎng)物中的CN-DNA進行快速準確的檢測，為診斷新型隱球菌感染提供可靠的實驗依據(jù)。
【具體實施方式】
[0029]以下僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何本領域的技術人員在本發(fā)明公開的技術范圍內，可很容易進行的改變或變化都涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。因此，本發(fā)明的保護范圍應以權利要求書的保護范圍為準。
[0030]另外，如未做特殊交待，則本發(fā)明中的百分含量指質量百分含量。
[0031]實施例1
[0032]本實施例提供一種具體的新型隱球菌檢測試劑盒，它包括如下組分:
[0033]①核酸釋放劑:包含莎梵婦(surfactin) 0.lmmol/L,氯化鉀100mmol/L,十二烷基磺酸鈉(SDS) 0.1%，0.1%的乙醇和溶劑TE緩沖液。
[0034]②內標(陽性內對照):為插入PUC18T載體的一段長為125堿基對的人工合成DNA序列的重組體，即質粒，濃度為2.00E+05copies/ml, 125堿基對的序列為:
[0035]5，-AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA-3’ ；
[0036]③PCR反應液:包括10XPCR反應緩沖液5iU，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物均為0.3i!m0l/L，用于靶多核苷酸檢測的探針為0.3i!m0l/L，用于內標片段擴增的上下游引物均為0.lymol/L，用于檢測內標的探針為0.lymol/L。其中，所述10XPCR反應緩沖液為包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP和dTTP ;所述用于靶多核苷酸擴增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測的探針是源于新型隱球菌核酸的保守區(qū)域的引物和探針，其堿基序列分別為:
[0037]CN-DNA 上游引物:5 ’ -TGGACTTGGATTTGGGTGTTT-3，，
[0038]CN-DNA 下游引物:5，-GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT-3，，[0039]CN-DNA 探針:5’ -CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC-3’ ；
[0040]所述的用于檢測內標的引物探針序列分別為:
[0041 ]內標上游引物:5 ’ -TGAAGACTTACACAAGCCTGGG-3，，
[0042]內標下游引物:5’ -TGAATCCTTGCAGCACTGTC-3，，
[0043]內標探針:5’ -ACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTG-3’。
[0044]④酶混合液:包含5U/ U I的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.3U/ U I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。
[0045]⑤CN定量參考品:來源于使用CN企業(yè)定量線性參考品LI~L5定值后的CN強陽性質粒，該定量參考品包括A、B、C、D四個濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為1.00~
.5.00E+06CFU/ml (A)、1.00 ~5.00E+05CFU/ml (B)、1.00 ~5.00E+04CFU/ml (C)、1.00 ~.5.00E+03CFU/ml (D)。
[0046]⑥CN陽性對照:為臨床醫(yī)院收集的CN強陽性樣本，其濃度為1.00~.5.00E+05CFU/ml。
[0047]⑦CN陰性對照:為滅菌生理鹽水。
[0048]⑧CN濃縮液:聚乙二醇6000 (PEG_6000)10~100mmol/L (質量/體積)，氯化鈉50~500mmol/L (質量/體積)。
[0049]實施例2
[0050]本實施例提供上述實施例1所述試劑盒用于檢測全血、血清(血漿)、肺泡灌洗培養(yǎng)物等未知樣本中CN-DNA的操作步驟:
[0051]一、試劑準備
[0052]根據(jù)待測樣本、CN陰性對照、CN陽性對照以及CN定量參考品A~D的數(shù)量，按比例取相應量的PCR反應液(38 iil/人份)、酶混合液(I iil/人份)及內標0.5 iil/人份，充分混勻成PCR-mix ;瞬時離心后備用。
[0053]二、核酸提取
[0054]1.待測樣本:取100 U I待測樣本，加入CN濃縮液100 U 1，振蕩混勻后12，OOOrpm離心5min，棄上清，沉淀中加入50 U I核酸釋放劑，震蕩或移液槍吸打混勻，100°C處理IOmin, 12000r/min離心3min,作為待測樣本備用。
[0055]2.CN陰性對照、CN陽性對照、CN定量參考品:CN陰性對照、CN陽性對照、CN定量參考品A~D分別取10 iil與10 iil核酸釋放劑混勻待用。
[0056]三、向PCR反應管中加樣
[0057]每個PCR反應管中加入上述第二步驟中處理后的待測樣本、CN陰性對照、CN陽性對照以及CN定量參考品A~D各IOiU ;靜置10分鐘后，每管加入步驟一中的PCR-mix40 u 1，吸打混勻2-3次，去除氣泡后蓋上管蓋，2000rpm離心30秒。
[0058]四、熒光PCR反應與結果分析(在熒光定量PCR擴增儀上進行)
[0059]1)將PCR反應管放入擴增儀樣品槽，按對應順序設置待測樣本名稱及定量參考品濃度。
[0060]2)突光檢測通道選擇:選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測CN ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測內標；參比突光(PassiveReference)設置為 none。[0061]3)熒光定量PCR反應條件見表1:
[0062]表1
[0063]
【權利要求】
1.一種核酸釋放劑在新型隱球菌檢測中的應用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2% 和乙醇 0.05 ~1%。
2.一種新型隱球菌CN-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01~0.Smmol /I,,氯化鉀20~300mmol/L,十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應液中包含用于CN-DNA檢測的引物和探針序列如下， CN-DNA 上游引物:TGGACTTGGATTTGGGTGTTT， CN-DNA 下游引物:GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
CN-DNA 探針:CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內標，且所述PCR反應液中還包含用于檢測內標的引物和探針序列，
內標:AGTGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCA ； 內標上游引物:TGAAGACTTACACAAGCCTGGG， 內標下游引物:TGAATCCTTGCAGCACTGTC， 內標探針:ACTACCCGGTACTAACTATGITGGGCCTG。`
4.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ U I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時在所述PCR反應液中還包含dUTP。
5.根據(jù)權利要求2~4中任意一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內標、PCR反應液、酶混合液、CN定量參考品、CN陽性對照、CN陰性對照和CN濃縮液。
6.一種新型隱球菌CN-DNA檢測試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應液，所述PCR反應液中包含用于CN-DNA檢測的引物和探針序列如下， CN-DNA 上游引物:TGGACTTGGAITTGGGTGITT， CN-DNA 下游引物:GGTAATCACCTTCCCACTAACACAT，
CN-DNA 探針:CTGCAAAGGACGTCGGCTCGCC。
【文檔編號】C12Q1/04GK103740832SQ201410017251
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權日:2014年1月15日
【發(fā)明者】戴立忠, 張操昊, 鄧中平 申請人:湖南圣維爾醫(yī)學檢驗所有限公司