一種沙眼衣原體的熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，本發(fā)明提供用于檢測(cè)臨床樣品中沙眼衣原體 iracAoazaiis，簡(jiǎn)稱CT)的突光定量PCR試劑盒，用于沙眼衣原體的臨床早期 診斷。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙眼衣原體iracAoaza ，CT)是衣原體屬的一類，介于病毒和立克次 氏體間，能通過(guò)濾菌器，具有專性細(xì)胞內(nèi)寄生與獨(dú)特生活周期的原核細(xì)胞型微生物。衣原體 對(duì)黏膜上的皮細(xì)胞，尤其是柱狀上皮細(xì)胞有親和力，故易引起眼結(jié)合膜及泌尿生殖系統(tǒng)黏 膜感染。
[0003] 我國(guó)沙眼衣原體感染居性傳播疾?。⊿TD)的第三位，且其發(fā)病率有逐年增高的趨 勢(shì)。目前，沙眼衣原體感染已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問題。一方面衣原體已成為性病中最 常見的一種病原體，另一方面它可出現(xiàn)嚴(yán)重的持續(xù)感染現(xiàn)象。沙眼衣原體感染的特點(diǎn)之一 是大部分感染者沒有明顯的臨床癥狀，最高可有70%的婦女宮頸炎和50%的男性尿道感染 是無(wú)癥狀的攜帶者，因無(wú)自覺癥狀，這些人在社會(huì)上是一個(gè)高危的潛在傳染源。有學(xué)者報(bào) 道，經(jīng)衣原體陽(yáng)性母親產(chǎn)道出生的嬰兒，有50%_70%的機(jī)會(huì)可以獲得衣原體感染，同時(shí)注射 沙眼衣原體疫苗后，可以誘發(fā)局部特異性免疫，但其保護(hù)作用僅能維持1-2年。高發(fā)病率、 高構(gòu)成比是目前國(guó)內(nèi)沙眼衣原體感染的基本流行概況。所以提早診斷衣原體感染有著極大 的意義。
[0004] 另外，沙眼衣原體是HIV傳播的輔助因子，感染CT的女性發(fā)生HIV感染較無(wú) CT感 染的女性高3~5倍，治療CT可降低HIV的傳播。
[0005] 醫(yī)院和檢測(cè)機(jī)構(gòu)常規(guī)的沙眼衣原體檢測(cè)方法是培養(yǎng)法、直接涂片法、免疫學(xué)方法， 如免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法等。培養(yǎng)法準(zhǔn)確可靠，但是往往需要2-3天，培養(yǎng)周期長(zhǎng)， 并且操作繁瑣，受樣本采集方法和運(yùn)輸方式等影響常常導(dǎo)致陽(yáng)性率低等缺點(diǎn)，已經(jīng)滿足不 了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)快速診斷治療的步伐；直接涂片法操作簡(jiǎn)單，但是檢測(cè)準(zhǔn)確率差，依賴于主觀判 斷；免疫學(xué)方法如膠體金技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法等雖然具有簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)勢(shì)，但是存在特異 性差、靈敏度低、假陽(yáng)性率高等缺點(diǎn)，并不適合臨床診斷確診依據(jù)，只能作為初診工具。
[0006] 近年發(fā)展起來(lái)的PCR方法則具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于核酸分 析、遺傳學(xué)檢測(cè)和臨床檢測(cè)領(lǐng)域。尤其是在原普通PCR的基礎(chǔ)上，發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，通過(guò)引入特異性探針和熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)使PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增及分析的全過(guò)程可以 再單管內(nèi)封閉完成，并且可以對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及自動(dòng)分析結(jié)果，避免了 PCR后的處理，是一種先進(jìn)的分子定量檢測(cè)技術(shù)。熒光PCR技術(shù)有多種類型，其定量方式也 不同，主要分為熒光染料嵌入技術(shù)、熒光探針技術(shù)和自身淬滅熒光技術(shù)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提供一種靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快的沙眼衣原體 的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，用于臨床樣本中沙眼衣原體感染的輔助診斷。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：一種沙眼衣原體的熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒，試劑盒包含PCR反應(yīng)液、DNA聚合酶液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、弱陽(yáng)性質(zhì)控 品、陽(yáng)性定量參比品、裂解液及蛋白酶K溶液，PCR反應(yīng)液中包含有沙眼衣原體特異性的正 向引物、反向引物和熒光探針； 正向引物序列：5' -GCATGAGTCAGGACGAGTT-3'， 反向引物序列：5' -CGAAACTAAATGTGCGAGAGC-3'， 熒光探針序列：5'-FAM-TTAGCCACCGATGAAGACCCGTTAC-TAMRA-3'， 裂解液為 5. OmM Na0H、10.0 mM Tris-HCl (pH8.0)、0.2mM EDTA(pH8.0)、l%(V/V) TritonX-100,0. 5%(V/V) NP40.0. 5%(V/V)Tween20 ； DNA聚合酶液為包含有熱啟動(dòng)的Taq DNA聚合酶和UDG酶； 陽(yáng)性質(zhì)控品與弱陽(yáng)性質(zhì)控品為含插入沙眼衣原體特異性保守序列的質(zhì)粒PCR2. 1載 體，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中增殖后經(jīng)提取純化用分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度 后用無(wú)菌TE緩沖液定量稀釋，其中CT陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度為5. OX 107C〇pieS/ml，CT弱陽(yáng)性 質(zhì)控品的濃度為5. OX 103copies/ml ; CT陽(yáng)性定量參比品為含插入沙眼衣原體特異性保守序列的質(zhì)粒pCR2. 1載體，濃度 分別為 Pl :5. OX 106copies/ml，P2 :5. OX 105copies/ml，P3 :5. OX 104copies/ml，P4 : 5. OX 103copies/ml ;陰性質(zhì)控品為滅菌去離子水。
[0009] PCR反應(yīng)液還包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP四種核苷酸和含有鎂離子的緩沖液。
[0010] 本試劑盒保存于-20°c及以下，盡量減少反復(fù)凍融。
[0011] PCR反應(yīng)液所包含的正向引物、反向引物和探針的衍生序列也為本發(fā)明的保護(hù)范 圍，所述衍生序列為向5'端和3'方向延伸一至數(shù)個(gè)堿基或刪減一至數(shù)個(gè)堿基得到的序列。
[0012] 所述探針序列5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM可替換為TET、JOE、HEX或VIC中的一 種；所述探針序列3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)TAMRA可替換為DABCYL或BHQ中的一種。
[0013] 本發(fā)明采用的是Taqman探針法技術(shù)，該技術(shù)相對(duì)于熒光染料嵌入技術(shù)和自身淬 滅熒光技術(shù)來(lái)說(shuō)，特異性更強(qiáng)，同時(shí)不受引物二聚體的影響，由于不需要分析溶解曲線的步 驟，檢測(cè)時(shí)間更短，因此更適合臨床使用。
[0014] 本發(fā)明針對(duì)沙眼衣原體特異性基因保守序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，能特異性擴(kuò)增 靶DNA序列從而達(dá)到臨床診斷目的，可以簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)臨床樣本中沙眼衣原體感染，本 發(fā)明與其它檢測(cè)技術(shù)相比主要優(yōu)點(diǎn)如下： 1、 相對(duì)于常規(guī)PCR技術(shù)，本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便，結(jié)果明了等特點(diǎn)，產(chǎn)物不用凝膠電泳檢 測(cè)，完全閉管操作，有效的減低了 PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)， 2、 同時(shí)引入了 UDG酶抗污染體系，可以有效地減少產(chǎn)物形成的氣溶膠污染而引起的假 陽(yáng)性問題， 3、 檢測(cè)速度快，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作僅需2~3個(gè)小時(shí)，操作簡(jiǎn)單。
[0015] 總之，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單與快速明了等特 點(diǎn)，是一種適用于臨床樣本中沙眼衣原體快速檢測(cè)的試劑盒。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是沙眼衣原體定量檢測(cè)試劑盒的線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表 示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度；S1-S7分別表示濃度為5. OX Kfcopies/ ml >5. OX 107copies/ml > 5. 0 X 106copies/ml > 5. 0 X 105copies/ml >5. 0 X 104copies/ml > 5. OX 103copies/ml、5. OX 102copies/ml的陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，各3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)；CK為陰 性質(zhì)控品； 圖2是根據(jù)線性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的該試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖，圖中橫坐標(biāo)Ig質(zhì)粒濃度表 示陽(yáng)性參考品濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)CT值表示擴(kuò)增循環(huán)數(shù)； 圖3是沙眼衣原體定量檢測(cè)試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度；A代表CT陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，B代表特異性參考品擴(kuò) 增曲線，特異性參考品分別為大腸埃希菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡 萄球菌、銅綠假單胞桿菌、白色念珠菌、糞腸球菌與淋病奈瑟氏菌； 圖4是沙眼衣原體定量檢測(cè)試劑盒的陰性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增循環(huán) 數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，A代表CT陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線，B代表25個(gè)無(wú)菌去離子水 重復(fù)樣本的擴(kuò)增曲線； 圖5是沙眼衣原體定量檢測(cè)試劑盒的精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，圖中橫坐標(biāo)cycle表示擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)Λ Rn表示熒光強(qiáng)度，S2為10份濃度為5. OX 107C〇pieS/ml的陽(yáng)性參考品 擴(kuò)增曲線，S6為10份