檢測牛ADIPOQ基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物和熒光定量檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測牛ADIP0Q基因mRNA表達(dá)水平的特 異性引物和熒光定量PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR)是DNA體外操作技術(shù)中最 常用的技術(shù)。PCR技術(shù)將模板DNA、特異性引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶、鎂離子等放 在同一個(gè)緩沖反應(yīng)體系中，進(jìn)行反復(fù)高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環(huán)，實(shí)現(xiàn)靶DNA 片段在反應(yīng)液中呈2n倍擴(kuò)增(其中n為熱循環(huán)次數(shù))。
[0003] 熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù)和計(jì)算 機(jī)分析技術(shù)。熒光定量PCR在普通PCR反應(yīng)體系中加入特定的熒光標(biāo)記物質(zhì)，通過檢測每 個(gè)熱循環(huán)后PCR反應(yīng)體系中的熒光值的變化情況來實(shí)時(shí)監(jiān)測DNA的擴(kuò)增情況，并獲得每個(gè) 樣本的熒光定量變化曲線，進(jìn)而獲得每個(gè)反應(yīng)管的Ct值(熒光變化達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)）； 同時(shí)，在相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下檢測2 (或10)倍稀釋的已知數(shù)量的靶標(biāo)DNA，獲得 其Ct值，以起始模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和 各個(gè)標(biāo)本的Ct值對每個(gè)反應(yīng)的起始DNA模板數(shù)進(jìn)行定量測定。
[0004] 雖然Northernblot技術(shù)可檢測基因的mRNA表達(dá)水平，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程操作比較 復(fù)雜。Northernblot實(shí)驗(yàn)中一個(gè)主要的問題是存在RNA的降解，所以NorthernBlot中 所有的實(shí)驗(yàn)用品都需要經(jīng)過除去RNA酶的過程，如高溫烘烤、DEPC處理等。另外，Northern Blot中很多實(shí)驗(yàn)用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等等對人體都有一定的傷害?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn) 雖然降低了實(shí)驗(yàn)人員的工作量，并可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測幾千個(gè)基因表達(dá)量變化，但 是其靈敏度較低。
[0005] 而SYBR Green是一種結(jié)合于雙鏈DNA小溝中的結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其 熒光大大增強(qiáng)。該性質(zhì)用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR Green的最大吸收波長約為 497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒 光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā) 射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
[0006] SYBRGreen在核酸的實(shí)時(shí)檢測方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié) 合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對較低。此外，由于 一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SRYBGreen的靈敏度很高。但是，由于SYRB Green與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引 起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn) 物的影響。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreen得到定量結(jié)果。
[0007] 脂聯(lián)素（Adiponectin，ADIP0Q)主要由大量聚集成團(tuán)的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，是脂肪細(xì) 胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)。ADIP0Q同時(shí)也是一種胰島素增敏激素，能改 善小鼠的胰島素抗性和動脈硬化癥；對人體的研宄發(fā)現(xiàn)，ADIPOQ水平能預(yù)示II型糖尿病和 冠心病的發(fā)展，并在臨床試驗(yàn)表現(xiàn)出抗糖尿病、抗動脈粥樣和炎癥的潛力。ADIP0Q可作用 于骨骼肌增加脂肪酸氧化作用，同時(shí)還能作用于肝臟增加胰島素拮抗糖異生作用，當(dāng)脂肪 過度沉積時(shí)，ADIPOQ基因在脂肪組織中的表達(dá)量及血液ADIPOQ水平均降低；而體重下降 時(shí)，ADIPOQ的表達(dá)量和血液ADIPOQ水平均升高，ADIPOQ通過蛋白激酶促進(jìn)骨骼肌脂肪酸的 氧化，降低脂質(zhì)在骨骼肌的堆積，減少游離脂肪酸進(jìn)入肝臟，改善肝臟胰島素抵抗，降低肝 糖的生成和極低密度脂蛋白的合成。在動物生產(chǎn)中，動物體內(nèi)脂肪沉積及脂肪含量是影響 肉品質(zhì)的重要因素，動物產(chǎn)品脂肪含量過高不僅影響消費(fèi)者的健康，而且降低飼料利用率。 ADIPOQ的研宄，為改善動物胴體品質(zhì)、生長性能和脂肪沉積的分子育種研宄提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了檢測脂聯(lián)素（Adiponectin，ADIPOQ)基因mRNA表達(dá)水平的特異性引 物和熒光定量PCR檢測試劑盒。通過大量的實(shí)驗(yàn)研宄，我們優(yōu)化出了一套能夠有效檢測不 同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)ADIP0Q基因mRNA表達(dá)量的引物和PCR反應(yīng)的條件，并組裝 成ADIPOQ基因mRNA表達(dá)檢測熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，以滿足生命科學(xué)、動物醫(yī)學(xué) 和動物科學(xué)研宄者的檢測需要。
[0009] 本發(fā)明提供一種檢測牛ADIPOQ基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物，所述特異性引 物的核苷酸序列為： 上游引物序列為：5 ' -AGAAAGGGAGAACCTGGAGA-3 ' ； 下游引物序列為：5 ' -GGTAAAGCGAATGGGAACA-3 '。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種牛ADIPOQ基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢 測試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物，所述特異性引物序列為： 上游引物序列為：5 ' -AGAAAGGGAGAACCTGGAGA-3 ' ； 下游引物序列為：5 ' -GGTAAAGCGAATGGGAACA-3 '。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括SYBR Green染料。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
[0013] 優(yōu)選地，所述陽性對照的核苷酸序列參見序列表中SEQIDNo. 3。
[0014] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述試劑盒的使用方法，是以待測cDNA為模板，利用 權(quán)利要求1所述的特異性引物和SYBRGreen染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，記錄Ct值，并以 ADIPOQ標(biāo)準(zhǔn)基因作為陽性對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值進(jìn)行定量測定。
[0015] 優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性30秒；95°C5秒， 56. 0°C20秒，捕捉焚光信號，循環(huán)40次。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種牛ADIPOQ基因mRNA表達(dá)水平的定量檢測方法， 是以待測cDNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的特異性引物和SYBRGreen染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒 光定量PCR，記錄Ct值，并以ADIPOQ標(biāo)準(zhǔn)基因作為陽性對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和 Ct值進(jìn)行定量測定。
[0017] 優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性30秒；95°C5秒， 56. 0°C20秒，捕捉焚光信號，循環(huán)40次。
[0018] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供權(quán)利要求1所述的特異性引物、權(quán)利要求2-5任一所 述的試劑盒、序列表中SEQIDNo. 3所述的核苷酸序列在定量檢測牛ADIPOQ基因mRNA表 達(dá)水平中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述牛為黃牛、奶牛和牦牛。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 1.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了簡便快捷的定量檢測ADIP0Q基因mRNA表達(dá)水平的目的，可以監(jiān)測不 同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)、不同組織、不同時(shí)期的ADIPOQ基因的mRNA表達(dá)狀態(tài)。
[0020] 2.本發(fā)明在檢測基因mRNA表達(dá)水平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實(shí)驗(yàn)成本低的 優(yōu)點(diǎn)。
[0021] 3.本發(fā)明可以監(jiān)測不同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛）脂聯(lián)素（Adiponectin， ADIPOQ)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，通過對該基因的研宄，可以改善動物胴體品質(zhì)、生長性能和脂 肪沉積等性狀。
【附圖說明】
[0022] 附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為ADIPOQ基因mRNA表達(dá)水平的熒光檢測結(jié)果圖。其中，A:擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)為相對熒光量值（RelativeFluorescenceUnits，RFU);B:熔解曲線， 橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為單位溫度下相對熒光值的變化量（d(RFU)/dT)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0024] 其中，SYBRGreen染料購自寶生物工程(大連）有限公司。
[0025] 實(shí)施例1 本發(fā)明的ADIPOQ基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測試劑盒由以下組分組成：2XSYBRGREENMIX 5mL； 陽性對照：標(biāo)準(zhǔn)ADIPOQ基因模板 500 yL; 引物混合液 500yL; 超純水 5mL。
[0026]其中，2XSYBRGR