一種a型h5n6亞型禽流感病毒雙通道實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種A型H5N6亞型禽流感病毒雙通道實(shí) 時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒是流行性感冒的病原體，屬于正粘病毒科，為RNA病毒，根據(jù)流感病毒核 蛋白（Nucleoprotein，NP)和基質(zhì)1蛋白（Matrix protein 1，M1)抗原性的不同，流感病毒可 分為A、B、C三型，其中A型流感病毒是正粘病毒科的唯一屬，根據(jù)流感病毒表面血凝素 (hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分 為18個(gè)HA亞型（H1-H18)和11個(gè)NA亞型（N1-N11)，H5N1亞型禽流感病毒(Avian inf luenza virus，AIV)表示一個(gè)禽流感病毒具有H5型HA蛋白和N1型ΝΑ蛋白。因此，在理論上，根據(jù)目前 已知的18個(gè)ΗΑ和11個(gè)ΝΑ亞型可以組合形成198個(gè)亞型流感病毒.人感染Α型流感病毒通常局 限于3種HA亞型（H1，H2和H3)和2種NA亞型（N1和N2)，而家禽和野生鳥類通常作為其他亞型 流感病毒的天然宿主。許多跨物種傳播的禽流感病毒已經(jīng)報(bào)道，如H5N1，H5N2，H9N2，H7N7， !17呢，!17似，!11(^7，!17冊(cè)和!11(^8，尤其是!15附和!17冊(cè)亞型禽流感病毒疫情造成了巨大的經(jīng) 濟(jì)損失和人感染死亡病例。
[0003] 2014年2月，一種新型的H5N6亞型重配禽流感病毒造成人類感染，截止2015年7月， 全球共報(bào)告5例人感染病例，全部病例發(fā)生在中國(guó)大陸，另外在老撾、越南及中國(guó)大陸的禽 及禽類市場(chǎng)環(huán)境中已檢出H5N6亞型禽流感病毒，表明人感染H5N6亞型禽流感疫情形勢(shì)不容 樂觀。為了有效地控制人感染H5N6亞型禽流感疫情，早期、快速、特異和敏感的檢測(cè)方法研 究成為當(dāng)務(wù)之急。目前針對(duì)H5N6亞型禽流感病毒的檢測(cè)主要依賴病毒培養(yǎng)、核酸檢測(cè)和基 因測(cè)序等方法，其中實(shí)時(shí)熒光PCR方法因具有快速、特異、敏感的特點(diǎn)，已成為各大研究機(jī)構(gòu) 和生物試劑公司優(yōu)先研究開發(fā)的重點(diǎn)方向.
[0004] 隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在流感分子診斷領(lǐng)域發(fā)展最快。 2004年Jurgen A.Richt等利用real-time RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了北美豬流感病毒的型別和亞 型的分子診斷，該體系每次只能進(jìn)行一個(gè)型別或亞型的診斷.2006年multiplex PCR技術(shù) 被用于呼吸道病毒的分子診斷.2007年有人利用2套multiplex PCR對(duì)12種呼吸道病毒進(jìn)行 了分子診斷，但這兩種方法都靠凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析，且自身存在靈敏度差、易交叉污染 等不足。2007年real-time PCR被用于同時(shí)進(jìn)行人禽流感病毒H5N1亞型的分子診斷.2008年 多重real-time PCR開始被用于常見呼吸道病毒的分子診斷.2009年多管多重?zé)晒舛縋CR 被用于檢測(cè)新甲型H1N1流感病毒和季節(jié)性流感病毒.2010年單管多重?zé)晒舛縋CR開始被 用于流感病毒亞型分型.但因?yàn)榱鞲胁《镜亩嘧冃?，目前尚沒有針對(duì)新近發(fā)現(xiàn)的A型H5N6流 感病毒的單管多重?zé)晒舛縋CR試劑盒和診斷方法的報(bào)道.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的A型H5N6亞型禽流感 病毒雙通道實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，可用于H5N6亞型禽流感病毒的監(jiān)測(cè)和臨床診斷。
[0006] 本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒具體包括以下組分：
[0007] (l)RT-PCR反應(yīng)液：含有50mM MgS〇4、0.4mM dNTPs;
[0008] (2)引物和探針混合液:包含H5及N6特異性引物、探針，其中H5-F和N6-F引物濃度 均為20yM，H5-R和N6-R引物濃度均為40μΜ，Η5和N6探針濃度為20μΜ;擴(kuò)增特異性引物的序列 如下：
[0009] Η5上游引物H5-F:5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3(Seq ID No:l);
[0010] H5下游引物H5-R:5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3(Seq ID No:2);
[0011] H5特異性探針H5-probe: 5-熒光報(bào)告基團(tuán)-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-熒光猝滅基 團(tuán)-3(Seq ID No:5);
[0012] N6上游引物N6-F:5-CTAGGGTCGARTGCATAGGATG-3(Seq ID No:3);
[0013] N6下游引物N6-R:5-TACCACACYACTGCCGATGC-3(Seq ID No:4);
[0014] N6特異性探針N6-probe:5-熒光報(bào)告基團(tuán)-AAGCACGTCATGCCAYGATG-熒光猝滅基 團(tuán)-3(Seq ID No:6);
[0015] (3)酶混合液:含有逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶；
[0016] (4)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為含H5N6亞型禽流感病毒特異性HA和NA基因片段DNA濃度分別為 3.6 ng/yL和3.3ng/yL的質(zhì)粒混合物；
[0017] (5)陰性標(biāo)準(zhǔn)品為ddH2〇。
[0018] 上述A型H5N6亞型禽流感病毒HA和ΝΑ基因的雙通道核酸檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)液每 管20.0 yL，最優(yōu)組成為:RT-PCR反應(yīng)液16. OyL、引物和探針混合液3. OyL、酶混合液1. OyL.
[0019] 本發(fā)明的雙通道熒光PCR檢測(cè)用引物具體包括兩對(duì)引物及其各自對(duì)應(yīng)的探針，分 別擴(kuò)增、檢測(cè)H5基因和N6基因.
[0020] 本發(fā)明的探針一端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，探針另一端標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)，熒光 報(bào)告基團(tuán)可以為常見的所述的熒光報(bào)告基團(tuán)包括:MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、 NED、TET、R0X或CY5;熒光猝滅基團(tuán)包括:了六11^、8即1、8即2，兩條探針的熒光報(bào)告基團(tuán)不相 同即可.優(yōu)選的，H5探針標(biāo)記的焚光報(bào)告基團(tuán)為FAM焚光基團(tuán)，N6探針標(biāo)記的焚光報(bào)告基團(tuán) 為Hex，所述的熒光猝滅基團(tuán)均為BHQ1.
[0021] 本發(fā)明的酶混合物，由逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶組成，所述的逆轉(zhuǎn)錄酶為鼠白血病病毒逆 轉(zhuǎn)錄酶，Taq酶為常見的耐熱Taq聚合酶。兩種酶的濃度分別為2IU/yL和2IU/yL。
[0022] 本發(fā)明的反應(yīng)體系中，所述的RT-PCR反應(yīng)液、引物和探針混合液、酶混合液可以分 開單獨(dú)保存，也可以混合在一起，優(yōu)選混合在一起保存.
[0023]本發(fā)明所述的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，可以為含有H5基因和N6基因的DNA片段，該DNA片段可 以為PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物、質(zhì)粒、人工合成基因.
[0024] 本發(fā)明樣本核酸的提取，可參考現(xiàn)有病毒RNA提取技術(shù)，優(yōu)選試劑盒提取法。
[0025] 本發(fā)明試劑盒的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?①50°C30min，②95°C10min，③95°C15sec，④55 °C45sec，其中③-④循環(huán)40次，熒光收集在步驟④。
[0026] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括以下步驟： [0027] (1)病毒RNA的提??；
[0028] (2)試劑配置:在標(biāo)明編號(hào)的PCR反應(yīng)管中加入擴(kuò)增反應(yīng)液16.OyL、引物和探針混 合液3. OyL、待檢模板5. OyL和酶混合液1. OyL;陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)管和陰性標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)管中各 加入5.0μΙν^準(zhǔn)品；
[0029] (3)PCR擴(kuò)增：將上述PCR反應(yīng)管混勻、離心后置于熒光定量PCR儀上，設(shè)置擴(kuò)增程 序：①50°C30min，②95°C10min，③95°C15sec，④55°C45sec，其中③-④循環(huán)40次，④收集 信號(hào).
[0030] (4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)PCR反應(yīng)體系的熒光信號(hào)值，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好 超過(guò)陰性標(biāo)準(zhǔn)品樣本熒光值最高點(diǎn)，熒光通道優(yōu)先FAM和HEX通道.
[0031] 結(jié)果判讀:在儀器正常、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品均正常的情況下進(jìn)行結(jié)果分析， 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品Ct < 35.0，陰性標(biāo)準(zhǔn)品Ct 2 38.0，PCR擴(kuò)增有效.
[0032] FAM通道：1)陽(yáng)性:待測(cè)樣本檢測(cè)結(jié)果Ct< 35.0,擴(kuò)增曲線呈S型且有明顯指數(shù)增長(zhǎng) 期，判斷為H5亞型禽流感病毒陽(yáng)性;2)陰性:待測(cè)樣本檢測(cè)結(jié)果Ct>38.0,判斷為H5亞型禽 流感病毒陰性;3)可疑:待測(cè)樣本結(jié)果35.0<Ct<3