專利名稱：家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子及其重組表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種組織特異性啟動子及其表達載體和應用。
背景技術：
家蠶在天然條件下產出的絲纖維是一種在紡織工業(yè)、生物醫(yī)學等領域具有廣泛應用的纖維材料。蜘蛛與家蠶具有相似的紡絲體，但其產出的絲纖維卻較蠶絲具有更強的硬度和更出色的韌性。絲纖維在生物體內的形成是一個極其復雜的過程，至今都沒有獲得完全闡明。現(xiàn)有的合成纖維都是人工模擬昆蟲天然產絲的過程，在體外進行合成，但其力學性能還遠不能和蜘蛛絲纖維進行對比。如果能使家蠶高效、特異地產出大量優(yōu)質的類蜘蛛絲纖維，對于優(yōu)質纖維材料的獲取具有非常重要的意義。家蠶前部絲腺是向列型液晶形成的場所，離子強度對絲纖維的形成具有重要作用。利用家蠶前部絲腺特異啟動子過量表達外源蛋白例如家蠶前部絲腺的某些離子通路蛋白，可能使絲纖維性質發(fā)生改變，獲得更加優(yōu)良的蠶絲纖維。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶表皮蛋白啟動子及其重組表達載體和應用，該啟動子可以使外源蛋白在家蠶前部絲腺特異性表達，利用該啟動子在家蠶前部絲腺調控某些離子通路蛋白的表達，可能使絲纖維性質發(fā)生改變，獲得更加優(yōu)良的蠶絲纖維。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案
I、家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子，由SEQ ID No. I中第I位至第1457位核苷酸組成， 或者由SEQ ID No. I中第I位至第1511位核苷酸組成。2、含有所述家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子的重組表達載體。進一步，所述重組表達載體為pBac[BmCP231-表達基因-SV40，3xP3EGFP]， 是將由家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子、表達基因序列和SV40終止信號組成的表達框 [BmCP231-表達基因-SV40]插入穿梭載體pSLfall80fa的多克隆位點中，獲得重組載體 pSL[BmCP231-表達基因-SV40]，再用Asc I從載體pSL[BmCP231_表達基因-SV40]中切下 [BmCP231-表達基因-SV40]片段，與同樣經Asc I酶切的載體pBac [3xP3_EGFPafm]連接， 即得。進一步，所述表達基因為紅色熒光蛋白DsRed基因。3、所述家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子作為家蠶前部絲腺特異性啟動子的應用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明利用蛋白質組學手段鑒定到一個在家蠶前部絲腺特異并且高量表達的表皮蛋白BmCP231，對其啟動子序列進行了克隆，并以DsRed基因為代表基因構建了由BmCP231啟動子調控的DsRed表達載體，將該表達載體顯微注射入家蠶體內獲得了轉基因家蠶，對該轉基因家蠶的研究發(fā)現(xiàn)，BmCP231啟動子驅動DsRed在家蠶前部絲腺特異表達，因此，BmCP231啟動子可以作為家蠶前部絲腺特異性啟動子應用。利用BmCP231啟動子在家蠶前部絲腺調控某些離子通路蛋白的表達，可能使絲纖維性質發(fā)生改變，獲得更加優(yōu)良的蠶絲纖維，從而本發(fā)明為下一步研究通過調控家蠶前部絲腺的離子通路蛋白表達來影響家蠶吐絲行為和改良絲纖維性能打下了基礎，而本發(fā)明提供的含有 BmCP231啟動子的重組表達載體為上述研究提供了有力的工具。


圖I為含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶不同時期在白光和熒光照射下的照片，其中a和b分別為白光和熒光照射下的卵，c和d分別為白光和熒光照射下的成蟲，e和 f分別為白光和熒光照射下的五齡第五天的家蠶，g和h分別為白光和熒光照射下的家蠶繭殼。圖2為轉基因家蠶的絲腺解剖圖，其中a和b分別為白光和熒光照射下的無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶絲腺，c和d分別為白光和熒光照射下的含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶絲腺，e和f分別為白光和熒光照射下的非轉基因家蠶大造絲腺。圖3 為轉基因家香的 Southern blot 分析，其中 I 為 Tran 2K plus DNA Marker, 2為經Bgl II酶切的非轉基因家蠶大造蠶蛾DNA，3為經Bgl II酶切的無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶Gl代蠶蛾DNA，4為經Bgl II酶切的含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶 Gl代蠶蛾DNA，5為增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因(陽性對照)。圖4為轉基因家蠶在前部絲腺特異表達DsRed的Western blot分析,其中I為無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶前部絲腺蛋白，2為含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶前部絲腺蛋白，3為非轉基因家蠶大造前部絲腺蛋白。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中使用的家蠶品種為大造，由中國西南大學家蠶基因資源庫提供。一、家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子的克隆
根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中序列nscaf2986，分別設計兩對上下游引物。設計的引物委托生工生物工程(上海)有限公司進行合成。引物序列如下
231-F 5' -ttgtcgacgcttcacggcagaaatag-3' (SEQ ID No. 2,下劃線部分為 Sal I 酶切位點)；
231-R1 :5’ -RaaRatcttRctRtRRttRttRaR-3’ (SEQ ID No. 3,下劃線部分為 Bgl II 酶切位點)；
231-R2 5'-gaagatctgctcccataagcggcagccaaaaggcaagaaaaggttaccaacttgagggccatt gctgtggttgttgag-3’ (SEQ ID No. 4,下劃線部分為 Bgl II 酶切位點)。以五齡第三天的大造基因組DNA為模板，采用引物231-F和231-R1擴增無信號肽BmCP231啟動子片段(序列如SEQ ID No. I中第I位至第1457位核苷酸所示)，采用引物231-F和231-R2擴增含信號肽BmCP231啟動子片段(序列如SEQ ID No. I中第I位至第 1511位核苷酸所示)。PCR反應條件為94°C預變性4分鐘；然后94°C變性40秒，52°C退火 40秒(無信號肽BmCP231啟動子片段)或60°C退火40秒(含信號肽BmCP231啟動子片段)，
472°C延伸I. 5分鐘，共24個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收純化目的片段，再克隆入載體PMD19-T Simple (TaKaRa)，分別獲得重組載體 PMD19-無信號肽BmCP231和pMD19_含信號肽BmCP231。二、BmCP231啟動子調控的DsRed表達載體的構建
分別將重組載體PMD19-無信號肽BmCP231和pMD19_含信號肽BmCP231用Sal I和 Bgl II雙酶切，回收無信號肽BmCP231啟動子片段和含信號肽BmCP231啟動子片段，再與同樣經Sal I和Bgl II雙酶切的載體pSL[MCS-DsRed-SV40]進行連接，分別獲得重組載體 pSL[無信號肽 BmCP231-DsRed-SV40]和 pSL[含信號肽 BmCP231-DsRed_SV40]。所述載體 pSL[MCS-DsRed-SV40]系參照文獻方法(Horn and ffimmer, 2000)，利用 pSLfall80fa 克隆穿梭載體，采用兩步克隆法構建而得，具體構建方法見中國專利申請20110423280. 3。分別將重組載體pSL[無信號肽BmCP231-DsRed-SV40]和pSL[含信號肽 BmCP231- DsRed_SV40]用Asc I酶切，回收無信號肽BmCP231-DsRed_SV40片段和含信號肽 BmCP231-DsRed-SV40片段，再與同樣經Asc I酶切的載體pBac [3xP3_EGFPafm]進行連接， 分別獲得重組載體PBac [無信號肽BmCP231-DsRed-SV40，3xP3EGFP]和pBac [含信號肽 BmCP231-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]。所述載體 pBac [3xP3_EGFPafm]系參照文獻方法(Horn and ffimmer, 2000)構建而得。三、BmCP231啟動子調控的DsRed表達載體轉基因家蠶的獲得
分別將重組載體PBac [無信號肽BmCP231-DsRed-SV40，3xP3EGFP]和pBac [含信號肽 BmCP231-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]與編碼piggyBac轉座酶的轉基因輔助載體pHA3PIG等摩爾比混合，通過顯微注射入已解除滯育的大造早期胚胎(產卵后2飛小時，GO代)中，注射后的蠶卵用無毒膠水封口，25°C催青至孵化，孵化的幼蟲采用人工飼料飼育，至成蟲后進行自交制種，獲得的卵期第7天的蠶卵(Gl代)在宏觀體視熒光顯微鏡(Olympus MVX10)下利用波長為46(T490nm的激發(fā)光檢測綠色熒光，篩選出在眼睛或神經特異激發(fā)綠色熒光的轉基因陽性個體(圖I a-d)，即獲得無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶和含信號肽BmCP231 啟動子轉基因家蠶。隨機選取無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶Gl代蠶蛾和含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶Gl代蠶蛾，分別提取基因組DNA進行Southern blot檢測，結果如圖3所示，EGFP的插入拷貝數(shù)均為I個，DsRed與EGFP處在同一個轉座子區(qū)域中，其插入拷貝數(shù)也均為I個，表明攜帶DsRed的piggyBac轉座元件在無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶和含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶的基因組中均發(fā)生了 I次轉座事件。四、BmCP231啟動子調控的DsRed表達載體在轉基因家蠶前部絲腺的特異表達
I、熒光觀察DsRed在轉基因家蠶中的時期與組織特異性
隨機選取無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶和含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶，于胚胎發(fā)育后期開始進行連續(xù)的熒光檢測，結果發(fā)現(xiàn)，在蟻蠶時就可以觀察到前部絲腺發(fā)出紅色熒光，之后隨著轉基因家蠶的發(fā)育，紅色熒光越來越強，當家蠶發(fā)育到五齡第三天時，紅色熒光可以直接透過家蠶的表皮被觀察到(圖I e，f)0將五齡第一天的無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶和含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶進行解剖后發(fā)現(xiàn)，紅色熒光是從前部絲腺發(fā)出且無性別差異，而在其它組織如中腸、生殖腺等中沒有觀察到紅色熒光，在轉基因家蠶的繭殼中也沒有觀察到紅色熒光(圖I g, h)。將無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶、含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶與非轉基因家蠶的絲腺進行解剖后發(fā)現(xiàn)，只有在無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶和含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶的前部絲腺中才能檢測到紅色熒光(圖2)。2、RT-PCR檢測DsRed基因在轉基因家蠶中的時期與組織特異性
分別取自五齡起蠶時期至蛹期第二天的轉基因家蠶個體，以及五齡第三天轉基因家蠶的各組織樣品，在液氮中快速研磨并提取總RNA，反轉錄成cDNA，采用DsRed基因特異引物[DsRed-F :5，-atggtgcgctcctccaagaacg-3，(SEQ ID No. 5) ;DsRed_R : 5’ -ctacaggaacaggtggtggc-gg-3’ (SEQ ID No. 6)]進行 RT-PCR 檢測，以 Actin3 為對照。 PCR反應條件為94°C預變性4分鐘；然后94°C變性15秒，65°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，共24個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，DsRed基因在含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶和無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶中的表達情況一致，時期檢測顯示DsRed基因自五齡起蠶時期至上蔟12小時均高量表達，而自上蔟12小時后表達量急劇下降；在組織特異性方面，DsRed基因只在轉基因家蠶的前部絲腺表達。3、Western blot檢測DsRed在轉基因家蠶前部絲腺中的表達
分別取五齡第三天的無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶、含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶和非轉基因家蠶的前部絲腺，在液氮中快速研磨溶于8mol/L尿素緩沖液中，4°C放置I小時，離心取上清，測定總蛋白濃度，再與5X加樣緩沖液混合，100°C變性 10分鐘，進行10% SDS-聚丙稀酰胺膠凝膠電泳，電泳完畢后，以Anti-DsRed抗體為一抗、 Tubulin抗體為內參照抗體進行Western blot分析。結果如圖4所示，DsRed在無信號肽 BmCP231啟動子轉基因家蠶和含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶的前部絲腺中均有表達，而在非轉基因家蠶前部絲腺中沒有表達；從表達量上看，含信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶前部絲腺中的DsRed表達量高于無信號肽BmCP231啟動子轉基因家蠶。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權利要求
1.家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子，其特征在于，由SEQID No. I中第I位至第1457位核苷酸組成，或者由SEQ ID No. I中第I位至第1511位核苷酸組成。
2.含有權利要求I所述家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子的重組表達載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體為 pBac[BmCP231-表達基因-SV40, 3xP3EGFP]，是將由家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子、表達基因序列和SV40終止信號組成的表達框[BmCP231-表達基因-SV40]插入穿梭載體 pSLfall80fa的多克隆位點中，獲得重組載體pSL[BmCP231_表達基因-SV40]，再用Asc I 從載體pSL[BmCP231-表達基因-SV40]中切下[BmCP231_表達基因-SV40]片段，與同樣經 Asc I酶切的載體pBac[3xP3-EGFPafm]連接，即得。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述表達基因為紅色熒光蛋白 DsRed基因。
5.權利要求I所述的家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子作為家蠶前部絲腺特異性啟動子的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個家蠶表皮蛋白BmCP231啟動子，由SEQ ID No.1中第1位至第1457位核苷酸組成，或者由SEQ ID No.1中第1位至第1511位核苷酸組成；該啟動子可以驅動外源蛋白在家蠶前部絲腺特異表達，可作為家蠶前部絲腺特異性啟動子應用；本發(fā)明還公開了含有該啟動子的重組表達載體，為下一步研究通過調控家蠶前部絲腺的離子通路蛋白表達來影響家蠶吐絲行為和改良絲纖維性能提供了有力的工具。
文檔編號C12N15/113GK102604954SQ20121008589
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權日2012年3月28日
發(fā)明者夏慶友, 王峰, 王鑫, 衣啟營, 趙萍, 馬三垣 申請人:西南大學