專(zhuān)利名稱(chēng)：海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，我國(guó)淺海貝養(yǎng)殖有了長(zhǎng)足發(fā)展，但隨著氣候變暖，夏季高溫成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要環(huán)境因素。生物體受到熱激脅迫(高于正常生長(zhǎng)溫度5°C以上的溫度)時(shí)，能迅速誘導(dǎo)熱休克蛋白的合成，它最早是Ritossa于1962年在果蠅中首先發(fā)現(xiàn)的。而且除溫度外，許多損傷因素、應(yīng)激刺激(如缺氧、重金屬離子、病毒感染、自由基等)都可以誘導(dǎo)熱激反應(yīng)，合成的熱休克蛋白(HSPs)在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重建中起重要作用。熱休克蛋白70(HSP70)家族是熱休克蛋白超家族的重要成員，除了具有分子伴侶的功能以外，在消除重金屬污染對(duì)機(jī)體造成的損傷，調(diào)節(jié)受體數(shù)量，調(diào)理細(xì)胞凋亡，促進(jìn)抗原提呈，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)等方面都具有重要的作用。真核啟動(dòng)子作為在真核細(xì)胞中啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的必需元件，是真核表達(dá)載體中一個(gè)關(guān)鍵組成部分，決定了目標(biāo)基因的表達(dá)效果，不同類(lèi)型啟動(dòng)子活性不同。啟動(dòng)子按其作用方式和功能可分為三類(lèi)組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子。其中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可根據(jù)需要在生物體特定的發(fā)育階段、組織器官或生長(zhǎng)環(huán)境下，快速誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，如熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子(HSP啟動(dòng)子)等。目前已有許多熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被成功應(yīng)用于植物基因工程領(lǐng)域，例如將大豆熱激蛋白GmHSP17. 3B啟動(dòng)子與gus融合，轉(zhuǎn)入苔蘚。通過(guò)控制熱激溫度來(lái)調(diào)節(jié)GUS的表達(dá)量；將向日葵的HaHSP17. 7G4基因的啟動(dòng)子與gus連接，轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)其對(duì)高溫(42°C)、脫落酸都有應(yīng)答，在胚胎形成過(guò)程中也有積累。在水生動(dòng)物中，目前還沒(méi)有熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子，海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示。海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示序列具有> 75%同源性，且能夠控制下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA分子。海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示序列的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA分子。海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，所述海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子在調(diào)控海灣扇貝基因表達(dá)中的應(yīng)用。所述基因?yàn)橄掠位颉１景l(fā)明所述含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的重組載體，包含有本發(fā)明所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子，以及由該啟動(dòng)子控制的目標(biāo)蛋白基因。
3
本發(fā)明所述含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子重組載體的宿主細(xì)胞，是通過(guò)在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的重組載體獲得的，重組的宿主細(xì)胞中含有本發(fā)明所述的含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的重組載體，并能夠表達(dá)由海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子控制的目標(biāo)蛋白基因。本發(fā)明所述宿主細(xì)胞包括且不僅限于Hela細(xì)胞。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)如下本發(fā)明克隆的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子是典型的熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，具有強(qiáng)啟動(dòng)子活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子可以在Hela細(xì)胞系中高效啟動(dòng)下游基因表達(dá)，可以廣泛用于基因工程重組載體的構(gòu)建。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的RT-PCR檢測(cè)熱脅迫后海灣扇貝熱休克蛋白70表達(dá)情況柱狀圖(其中柱狀圖上方星號(hào)標(biāo)記表示與b 1 ank組顯著差異(**:P<0.01，N = 5))。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子活性分析圖(其中將包含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞系中，檢測(cè)熱激前后由海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性變化。pGL 3-control為陽(yáng)性對(duì)照，pGL 3-basic為陰性對(duì)照。)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子，是具有下述任一特征的DNA分子1、由SEQ ID NO. 1堿基對(duì)1-1540定義的DNA分子；2、由SEQ ID NO. 1堿基對(duì)1-1540定義的序列具有> 75%同源性，且能夠控制下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA分子；3、是SEQ ID NO. 1的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA分子。本發(fā)明所述海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的克隆方法，包括以下步驟一、海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子5’調(diào)控序列分離1、米用 Clontech 公司(www.Clontech.com)的 GenomeffalkerUniversalKit (Catalog No. 638904)的限制性?xún)?nèi)切酶(Dra IjEcoR V,Pv μ II & St μ I)構(gòu)建四個(gè)DNA內(nèi)切酶庫(kù)。2、采用兩輪兩步PCR方法克隆出5’ -端序列，具體步驟如下(1)第一輪PCR總體系為50 μ 1，包括40 μ 1無(wú)菌雙蒸餾水，5 μ 110XPCR buffer,1μ 1 dNTP (10πιΜ)，1μ 1 接頭引物(ΑΡ1，10μΜ)，1μ 1 基因特異性引物(SEQ ID NO. 2,10μΜ))，1μ 1 rTaq 聚合酶(TaKaRa)，1 μ 1 酶切文庫(kù) DNA。PCR 程序?yàn)? 個(gè)循環(huán)94°C 25s,72°C 3min ；32 個(gè)循環(huán)94°C 25s，67°C 3min ；1 個(gè)循環(huán)67°C 7min。(2)第二輪兩步PCR以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，利用巢式引物(AP2和SEQ IDN0. 3)，按照跟第一輪一樣的體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序?yàn)?個(gè)循環(huán)94°C 25s，72°C 3min ；20個(gè)循環(huán)94°C 25s，67°C 3min ；1 個(gè)循環(huán)67°C 7min。
所述SEQ ID NO. 2 序列為5’ -GGTTGTCCTGTTTCCTTGGTCATTGGCG-3'所述SEQ ID NO. 3 序列為5’ -CGCCAGTTATTTCAATGTTCCTGTCTCA-3'二、擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T Simple vector (TaKaRa)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得帶有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子序列SEQ ID N0.1的大腸桿菌質(zhì)粒。實(shí)施例IRT-PCR檢測(cè)熱脅迫后海灣扇貝熱休克蛋白70mRNA表達(dá)情況從青島水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)實(shí)驗(yàn)用海灣扇貝，于(17士 1)°C海水中暫養(yǎng)一周后進(jìn)行持續(xù)高溫刺激實(shí)驗(yàn)。取5只扇貝作為空白組，同時(shí)將另外25只扇貝放入海水中進(jìn)行熱激作為處理組。在刺激后的第lh、2h、4h、8h和12h，分別取扇貝的鰓凍存在_80°C，用于RNA提取。利用引物oligo dT(liS和反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV在42°C反轉(zhuǎn)lh。以扇貝的管家基因β-actin作為內(nèi)參，利用RT-PCR方法檢測(cè)AiHSP70基因的mRNA表達(dá)情況(參見(jiàn)圖1)。結(jié)果如圖1所示熱激1小時(shí)后，海灣扇貝熱休克蛋白70mRNA表達(dá)量迅速上升并達(dá)到最大值，為空白組的7. 61倍；之后表達(dá)量下降，到4小時(shí)時(shí)基本回復(fù)到初始水平；然后在處理8小時(shí)時(shí)又開(kāi)始上升，為空白組的3. 63倍；在處理12小時(shí)后，處理組的海灣扇貝熱休克蛋白70mRNA表達(dá)量為空白組的6. 94倍。f-test和t_test分析顯示海灣扇貝熱休克蛋白70mRNA表達(dá)量在處理1小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)后顯著高于空白組(** =P <0.01),這表明海灣扇貝熱休克70啟動(dòng)子屬于典型的熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。實(shí)施例2海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的克隆1.米用 Clontech 公司(www. Clontech. com)的 GenomeffalkerUniversa 1Kit (Catalog No. 638904)的限制性?xún)?nèi)切酶(Dra IjEcoR V,Pv μ II & St μ I)構(gòu)建四個(gè)DNA內(nèi)切酶庫(kù)。2.采用兩輪兩步PCR方法克隆出5’ -端序列，具體步驟如下(1)第一輪PCR總體系為50μ 1，包括38. 5μ 1無(wú)菌雙蒸餾水，5 μ 110XPCRbuffer, 3 μ 1 dNTP (IOmM)，1 μ 1 接頭引物(API :5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC_3，，10 μ Μ)，1 μ 1 基因特異性引物(SEQ IDN0. 2，10 μ Μ))，0. 5 μ 1 rTaq 聚合酶(TaKaRa)和 1 μ 1 步驟 1所述構(gòu)建的酶切文庫(kù)DNA為模板。PCR程序?yàn)?個(gè)循環(huán)94°C 25s, 72°C 3min ；32個(gè)循環(huán)940C 25s，67°C 3min ；1 個(gè)循環(huán)67°C 7min。(2)第二輪兩步PCR以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，利用巢式引物(AP2 5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，和SEQ ID N0. 3)，按照跟第一輪一樣的體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序?yàn)? 個(gè)循環(huán)94°C 25s，72°C 3min ；20 個(gè)循環(huán)94°C 25s，67°C 3min ； 1 個(gè)循環(huán)67°C 7min。所述SEQ ID NO. 2 序列為5’ -GGTTGTCCTGTTTCCTTGGTCATTGGCG-3'所述SEQ ID NO. 3 序列為5’ -CGCCAGTTATTTCAATGTTCCTGTCTCA-3'二、擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物連接到pMD18_T Simpl evector (TaKaRa)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用載體引物 RV-M(5’ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，)和 M13_47(5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得帶有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子序列SEQ ID NO. 1的大腸桿菌質(zhì)粒。所述 SEQ ID NO. 1 為:
cgacggcccgggctggtaaatatgacatatctttattcaaatagagatat50
ctttatttaaattagagatatctttaattaaatagagatatcttcatttt100
aaatagagatatcttttattaaatagagatatctatatttcaataggtaa150
clclclC CcltclclCggcttgccatactaacctacacttttaaagatatatagtt200
tgaaacagaattttccctaatactacatataaacagatgtctccattttt250
catttcatggtttatttacatgttagcaatgcatacacataaggagcttt300
gaaacatgcctgatccagccctatatttatcagtattatttacgtactat350
agttattataagttataaacacgtgacttgttttagtcatcttgtgggat400
gttccagatttgacgtcatatccttaagtgcgcataaatactcgtcgcat450
agcgccgggaaccaagaacaaaccggaacgaggagttttagctgagacaa500
gaacattgaaataactggctcttatattcaagaaaaaacaC 3.3.3.3.3.3. C 3.3.550
caggtaactttgtggaacgatatcggaagaaaatcgattcgattctgatt600
gatggttttgttgggattcgtgtaaattttgtcaagaataattttcaggg650
aggagccctcgagcagatgacagttttcactgggctttcaccgttgtatc700
aaaaagttaaatgaaaatcgtaacattttatatttctcgtgttaataata750
cattagttttagttactaaattccctcaaaatgatgtttcgttagatttg800
aagtagggctaccgaaagctttgttcattcacgttaccaatcgtcaacac850
cacatgcacgtagccggctaaatcgaccccattatataacCggttttgtt900
tagttactcagtctttgccttaagttgcgt 3.3.3. 3. 3.3.attgtaaaca950
ctgtggatga3. 3.3. C 3. 3.3.3.ttttagtttcgttatcgatttgactttgga1000
cgcgttaccttgctttagcaagttctattc attatcttcc ggaatcggtc1050
atgtgagttcCgtctggcgtggtagagctg tctctaaaag gagacaccca1100
aacaatgaagtgttaaaagtatggtatata aatagagtga acggaattcc1150
aagaataagttaccccttggtaacagaaca aatagtctgg tatttgttac1200
aactctggtgtcatgttggttaacgagtga acggaaaaag aatgtctgct1250
￡1￡1￡1￡10 ￡1￡1￡1agttttatgtgtttatgtgt attactttca caatatttaa1300
tgtgaatggtgaaatagacctagctatgat tataaacatt tgatcacaat1350
gatcacttatcattactatttattagtaat caattaatta tttttcatga1400
catacctaaaaggtgctagggaatggggta cactgtagat tgaaataggc1450
agagatgaaataaaatttgctgtaagaaaa aaattgtgaa tatttattaa1500
aaacctgctttagttttatttcgtttttgt ttttagcaaa1540
(a)序列特征
參長(zhǎng)度IMObp
參類(lèi)型堿基序列
參鏈型雙鏈
參拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類(lèi)型DNA
(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來(lái)源海灣扇貝(f)特異性名稱(chēng)pAi HSP7O實(shí)施例3海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子(pAiHSP70)活性檢測(cè)1、pGL-3-Basic-pAiHSP70重組載體的構(gòu)建1)合成分別帶有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)Kpn I 和 Bgl I I 的引物 SEQ ID NO. 4(5' -GGTACCATAACGGCTTGCCATACTAAC—3‘)禾口 SEQID NO. 5 (5，-AGATCTTTGCTAAAAACAAAAACGAAAT-3，)，用 Takara 高保真 Taq 酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。在總體積為50μ 1的反應(yīng)體系中包含有38. 5μ 1無(wú)菌雙蒸餾水，5μ 1 10XPCR buffer,3 μ 1 dNTP (IOmM)，1 μ 1 引物 SEQ ID NO. 4 (10 μ Μ)，1 μ 1 SEQ ID NO. 5 (10 μ Μ))，0· 5 μ 1 高保真Taq聚合酶(TaKaRa)和1 μ 1全基因組DNA為模板(50ng/ul)。PCR程序?yàn)?個(gè)循環(huán)940C 5min ；32 個(gè)循環(huán)94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s ；1 個(gè)循環(huán)72°C IOmin0 用膠回收試劑盒(TaKaRa)純化PCR產(chǎn)物。2)回收后的PCR產(chǎn)物和無(wú)啟動(dòng)子的空載體pGL-3-Basic (Promega)進(jìn)行雙酶切(Kpnl和Bgl II)，37°C孵育4h。膠回收純化酶切產(chǎn)物?；脤⑸鲜雒盖挟a(chǎn)物在16°C連接過(guò)夜。ΙΟμΙ連接體系中包含3μ1 (濃度15ng/μ 1)雙酶切后的空載pGL-3-Basi C(Promega)，5 μ 1 (濃度lOng/μ 1)雙酶切后的PCR產(chǎn)物片段，1 μ 1 10ΧΤ4 連接酶 buffer 和 1 μ 1 T4DNA 連接酶(TaKaRa)。4)將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。5)利用載體引物 RVprimer 3 (5，-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3，)和 GLprimer2 (5，-CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3’)進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，用小量質(zhì)粒試劑盒(!Iomega)提取質(zhì)粒，并雙酶切鑒定和測(cè)序。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性分析1)細(xì)胞鋪板500 μ 1 Hela細(xì)胞(2 X IO5個(gè)/ml)接種于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)上，于生化培養(yǎng)箱并通入5% CO2, 37°C條件下培養(yǎng)24h使融合度達(dá)到90% -95%。2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將0. 72 μ g上述構(gòu)建好的質(zhì)粒pGL3-Basic_pAiHSP70和0. 08 μ g內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒 pRL-TK (Promega)，在脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000，Invitrogen)介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hela細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pGL-3-control作為陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)染pGL-3-Basic作為陰性對(duì)照。3)熱激處理在轉(zhuǎn)染24h后，一個(gè)板在45°C條件下熱激lh，然后繼續(xù)在5% CO2,37°C條件下培養(yǎng)Mh，對(duì)照組生長(zhǎng)條件一直不變。4)轉(zhuǎn)染4 后收集細(xì)胞，參考雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(!Iomega)方法分析海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子活性(參見(jiàn)圖2)。結(jié)果如圖2所示，海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子可以在Hela細(xì)胞中啟動(dòng)下游報(bào)告基因Luciferase酶的表達(dá)，具有啟動(dòng)子活性。熱激后，海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子活性顯著上升(** =P < 0. 01)，屬于熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
權(quán)利要求
1.一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子，其特征在于海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示。
2.按權(quán)利要求1所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子，其特征在于海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示序列具有>75%同源性，且能夠控制下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA分子。
3.按權(quán)利要求1所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子，其特征在于海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子核苷酸序列為序列表SEQ ID NO. 1所示序列的片段、遺傳變體或缺失體，且能夠控制下游基因轉(zhuǎn)錄的DNA分子。
4.一種權(quán)利要求1所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于所述海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子在調(diào)控海灣扇貝基因表達(dá)中的應(yīng)用。
5.按權(quán)利要求4所述的海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于所述基因?yàn)橄掠位颉?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子序列及其克隆方法，以及包含有此啟動(dòng)子的重組載體的構(gòu)建，可用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因。提供一種海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子及其克隆方法，以及含有海灣扇貝熱休克蛋白70基因啟動(dòng)子的重組載體和重組的宿主細(xì)胞。本發(fā)明利用分子生物學(xué)方法分析該片段控制下的海灣扇貝熱休克蛋白70基因mRNA和報(bào)告基因Luciferase酶的表達(dá)模式，結(jié)果表明該啟動(dòng)子受熱脅迫誘導(dǎo)調(diào)控，能夠啟動(dòng)外源基因在Hela細(xì)胞中的高效表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102559683SQ20121004014
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月21日
發(fā)明者宋林生, 張峘, 楊傳燕, 王玲玲, 邱麗梅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所