專利名稱：以黃顙魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和生長激素基因?yàn)樵?gòu)建的黃顙魚本源轉(zhuǎn)基因載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃顙魚β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子和生長激素基因以及3’-非翻譯區(qū)序列的克隆、重組及啟動(dòng)子活性分析和應(yīng)用，并以此為元件構(gòu)建黃顙魚本源的轉(zhuǎn)基因載體，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃顙魚(Pseudobagrus fulvidraco Richardson)俗稱昂子魚,黃蠟丁。隸屬鯰形目，鮑科，黃顙魚屬。該魚屬溫水性魚類，營底棲生活，個(gè)體通常在30 100克左右，廣泛分布于我國內(nèi)陸水域中。其體表光滑無磷，肉質(zhì)細(xì)嫩，無肌間刺，蛋白質(zhì)含量15. 37%，氨基酸總量14. 19%,必需氨基酸指數(shù)達(dá)73. 34，賴氨酸含量較高，味道鮮美，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，且其肉味甘、平，有祛風(fēng)、利尿之功效，深受消費(fèi)者歡迎。從水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)角度來說，黃顙魚是一種優(yōu)質(zhì)高檔魚類，在國內(nèi)外擁有成熟的消費(fèi)市場。近年來，其平均價(jià)格一直穩(wěn)中有升，一般在20 40元/千克，僅南京市場年銷售量就達(dá)70萬公斤以上，而蘇錫常及上海銷售量更大。在國際市場上，黃顙魚深受東南亞各國消費(fèi)者喜愛，尤其是韓國每年要從我國進(jìn)口數(shù)百噸黃顙魚商品魚，是出口創(chuàng)匯的優(yōu)良品種。然而，目前市場上銷售的黃顙魚主要來自于野生資源的捕撈，由于該魚生長速度慢、個(gè)體規(guī)格偏小，通常要兩年才能性成熟，加上該魚產(chǎn)卵量低，市場供應(yīng)的商品魚不僅數(shù)量少且個(gè)體小(多為50克左右)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。為解決這些問題，國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了許多有益的嘗試，主要集中在人繁馴養(yǎng)、品種改良和養(yǎng)殖環(huán)境的優(yōu)化方面，但從國內(nèi)外水產(chǎn)動(dòng)物研究的趨勢來看，從分子水平對(duì)魚類基因組進(jìn)行改造，定向培育新型養(yǎng)殖品種是最有潛力的一種方法；更具重要意義的是轉(zhuǎn)生長激素基因魚餌料系數(shù)低，養(yǎng)殖周期短，當(dāng)年即可上市，能顯著降低魚類養(yǎng)殖成本。目前轉(zhuǎn)生長激素基因魚在加速魚體生長，增大魚體個(gè)頭，提高餌料的利用率等方面都顯示了良好的效果。在魚類基因工程育種中，采用“全魚”技術(shù)，即所轉(zhuǎn)基因全部來自于受體魚自身品系，制作成的大規(guī)格的轉(zhuǎn)基因魚，被認(rèn)為是確保轉(zhuǎn)基因在生物安全，生態(tài)環(huán)境安全，食品安全及消費(fèi)者認(rèn)可等方面因素后的最佳選擇。目前歐洲許多國家已經(jīng)批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因魚在飼料上的應(yīng)用，我國的轉(zhuǎn)基因鯉魚也制作成功。但轉(zhuǎn)基因黃顙魚的研發(fā)尚未有文獻(xiàn)和研究涉及，因此構(gòu)建黃顙魚本源轉(zhuǎn)基因載體具有廣泛的經(jīng)濟(jì)效益前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供黃顙魚肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、生長激素基因及其3’ -非翻譯區(qū)序列以及以此為元件構(gòu)建的黃顙魚本源生長激素轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)1.黃顙魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的克隆(1)本發(fā)明根據(jù)GenBank上已有的魚類β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列，在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一條上游引物P1，其位置在CAAT box附近。之后再將其外顯子進(jìn)行序列比對(duì)，在 β-肌動(dòng)蛋白的3號(hào)外顯子的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一條下游引物P2，通過這對(duì)引物來克隆黃顙魚的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。(2)提取黃顙魚腦垂體組織的基因組DNA，并以此為模板，用Ρ1，Ρ2為引物，擴(kuò)增出黃顙魚的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列包含β-肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)調(diào)控序列、 外顯子1以及部分外顯子2的序列，全長為1756bp。(3)將PCR擴(kuò)增的β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列克隆進(jìn)pMD 18-T載體中，命名為 pActinproexon—To(4)為了證明黃顙魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的活性，將β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子插入到黃色熒光蛋白載體中，看能否驅(qū)動(dòng)熒光蛋白的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚的活體實(shí)驗(yàn)，證明了 β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子能夠有效地驅(qū)動(dòng)黃色熒光蛋白在斑馬魚體內(nèi)的廣泛表達(dá)。2.黃顙魚生長激素基因及其3’ -非翻譯區(qū)序列的克隆(1)參照GenBank中已發(fā)表的魚類生長激素基因cDNA序列，在同源保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物(P3和P4)擴(kuò)增該基因的開放閱讀框(ORF)序列。(2)提取黃顙魚的腦組織的總RNA并通過逆轉(zhuǎn)錄得到用于PCR反應(yīng)的cDNA模板。 隨后用P3，P4為引物，擴(kuò)增出黃顙魚生長激素基因的開放閱讀框序列，即蛋白質(zhì)編碼序列。 該序列全長全長60;3bp，編碼200個(gè)氨基酸。(3)將PCR擴(kuò)增的生長激素開放閱讀框序列序列克隆進(jìn)pMDIS-T載體中，命名為 pGHORF-T。(4)為了通過3’ -RACE反應(yīng)獲得黃顙魚生長激素基因的3’ -非翻譯區(qū)序列 (3’-UTR)，在終止密碼子上游IOObp處設(shè)計(jì)引物P5。另一引物為含有接頭序列的通用引物 UPM。(5)提取黃顙魚的腦組織的mRNA并通過逆轉(zhuǎn)錄得到用于PCR反應(yīng)的cDNA模板。隨后用P5，UPM為引物，擴(kuò)增出黃顙魚生長激素基因3’ -非翻譯區(qū)序列。該序列全長687bp。(6)將PCR擴(kuò)增的生長激素基因3’ -非翻譯區(qū)序列克隆進(jìn)pMDIS-T載體中，命名為 pGH3-UTR-T。(7)由于開放閱讀框序列和3’ -非翻譯區(qū)序列之間存在160bp的重疊區(qū)，通過 OverlappingPCR法介導(dǎo)黃顙魚生長激素基因開放閱讀框序列和3’-非翻譯區(qū)序列的重組。 根據(jù)已獲得黃顙魚cDNA序列，設(shè)計(jì)了 2對(duì)Overlapping PCR引物P6、P7和P8、P9。(8)以重組質(zhì)粒pGH ORF-T為模板，用P6和P7為引物，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；以重組質(zhì)粒PGH 3-UTR-T為模板，用P8和P9為引物，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。之后以上述兩對(duì)引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物為共同模板，以P6和P9為引物，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，獲得包含黃顙魚生長激素基因開放閱讀框和3’-非翻譯區(qū)序列的生長激素cDNA。該序列全長1088bp。(9)將Overlapping PCR重組得到的黃顙魚生長激素cDNA克隆進(jìn)pMD18_T載體中,命名為pGH-cDNA-T。3.黃顙魚本源生長激素轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建(1)為使整個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體從啟動(dòng)子到加尾信號(hào)之間的表達(dá)相關(guān)序列全部為黃顙魚的本源序列，在通過設(shè)計(jì)引物PlO JfBamH I位點(diǎn)引入到β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列的 5’ -端。以Ρ10、Ρ11為引物，以pActin proexon-T為模板，PCR擴(kuò)增得到引入了 BamH I位點(diǎn)的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子片段，并將其克隆到PMD18-T載體中，命名為pActin Bproexon-T0(2)通過 BamH I 和 Nco I 雙酶切重組質(zhì)粒 pActin Bproexon-T 和 pGH-cDNA-T，分別得到黃顙魚的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子片段和生長激素cDNA片段(包含開放閱讀框和3’-非翻譯區(qū)序列)。隨后將此兩個(gè)元件通過BamH I位點(diǎn)克隆到pBluescript-SK質(zhì)粒中，通過酶切篩選正確的陽性克隆。該本源轉(zhuǎn)基因元件通過黃顙魚自身的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)自身的生長激素基因的表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明從黃顙魚基因組DNA中獲得了黃顙魚β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子序列，擴(kuò)充了轉(zhuǎn)基因魚類的啟動(dòng)子種類；本發(fā)明從黃顙魚總RNA中獲得了黃顙魚生長激素基因開放閱讀框及3’ -非翻譯區(qū)序列，擴(kuò)充了轉(zhuǎn)基因魚類的基因庫；本發(fā)明構(gòu)建了黃顙魚β -肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的黃色熒光蛋白表達(dá)載體，并成功在轉(zhuǎn)基因斑馬魚內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，該重組載體對(duì)魚類轉(zhuǎn)基因研究具有極大的生物學(xué)和生物工程學(xué)意義；本發(fā)明得到的黃顙魚本源轉(zhuǎn)基因載體在應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因黃顙魚育種生產(chǎn)時(shí)不含有任何菌源核苷酸，其顯微注射基因片段是一種全黃顙魚本源基因片段。


圖1.黃顙魚β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的PCR電泳圖。泳道1為DNA Marker,泳道2為 PCR結(jié)果，條帶大小為1756bp。圖2.用黃顙魚β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的黃色熒光表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼體96 小時(shí)的熒光顯微鏡照片。圖3.黃顙魚生長激素基因開放閱讀框的PCR電泳圖。泳道1為DNA Marker,泳道 2為PCR結(jié)果，條帶大小為60;3bp。圖4.黃顙魚生長激素基因3，-RACE的PCR電泳圖。泳道1為DNA Marker，泳道 2為PCR結(jié)果，條帶大小為687bp。圖5.黃顙魚生長激素基因overlapping PCR電泳圖。圖A為開放閱讀框的PCR 電泳圖，泳道1為DNAMarker，泳道2為PCR結(jié)果，條帶大小為60;3bp ；圖B為3’ -非翻譯區(qū)序列PCR電泳圖。泳道1為DNAMarker，泳道2為PCR結(jié)果，條帶大小為687bp ；圖C為 overlappingPCR電泳圖，泳道1為PCR結(jié)果，條帶大小為lO^bp，泳道2為DNAMarker。圖6.黃顙魚本源轉(zhuǎn)基因載體pActin promoter-GH的酶切鑒定圖。泳道1為DNA Marker,泳道2為pActin promoter-GH質(zhì)粒的電泳條帶，泳道3為BamH I和Nco I雙酶切的結(jié)果電泳條帶，泳道4為BamH I酶切的電泳條帶。圖7.黃顙魚本源轉(zhuǎn)基因載體pActin promoter-GH的示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1黃顙魚β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的克隆1.引物設(shè)計(jì)將GenBank上已發(fā)表的stingcatfish和tilapia等魚類的β -肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子序列進(jìn)行序列比對(duì)，在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一條上游引物Ρ1，其位置在CAAT box附近。之后再將其外顯子進(jìn)行序列比對(duì)，在肌動(dòng)蛋白的3號(hào)外顯子的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一條下游引物Ρ2，通過這對(duì)引物來克隆黃顙魚的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
Pl 5 ‘-GTGWGTGACGCMGGACCAATC-3，(W = A+T, M = T+C)P2 5 ‘-CCATXTCXTCCCAGTTGGTYACAAT-3，(X = A+G, Y = G+C)2.基因組DNA提取取成體黃顙魚腦垂體剪碎于1. 5ml已滅菌的離心管中，加入一定量(m/v = 1/10，以IOml每g組織為宜)的消化緩沖液(IOmM Tris-Cl, pH 8.0,1% SDS，100 μ g/ml蛋白酶K)后放置37°C水浴鍋中不時(shí)輕微振蕩消化5小時(shí)，到組織塊消化完全；然后加入相等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1)提取兩次，將水相轉(zhuǎn)移至干凈的1. 5ml已滅菌的離心管中，并加入3M氯化鈉至終濃度為0. 3M ；再加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動(dòng)離心管，直至溶液完全融合，可以觀察到白色絮狀沉淀；將其以3000g，離心 10分鐘；用70%的乙醇洗滌沉淀后在室溫下干燥，并在100 μ 1 TEdOmM Tris-Cl,pH 8.0， ImM EDTA)中溶解；溶解后加入十分之一體積3M醋酸鈉(pH = 5. 6)，加入(無核酸酶)RNase A至濃度100 μ g/ml ；37°C放置5分鐘，加入10% SDS至最終濃度0. 2%;再加入相等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1)提取兩次，將水相轉(zhuǎn)移至干凈的1. 5ml已滅菌的離心管中，并加入3M氯化鈉至終濃度為0. 3M ；再加入2. 5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動(dòng)離心管， 直至溶液完全融合，可以觀察到白色絮狀沉淀，1200g離心10分鐘，干燥，20 μ 1 IOmM TE中溶解，并保存-80°C待用。3.PCR擴(kuò)增以上述基因組DNA為模板，用P1、P2擴(kuò)增黃顙魚β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子，PCR反應(yīng)體系如表1 表1. PCR反應(yīng)體系
MilliQ H2O12.1μ1
10 X buffer (無 Mg2+) 2μ1 25mM Mg2+2μ1
5μΜΡ1Ιμ 5^mp2叫
5mM dNTP0.8μ1
rTaq 酶0.1 μ
基因組 DNAΙμ (200ng)
Total20μ PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95°C預(yù)變性時(shí)間5分鐘，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性1分鐘，58°C 復(fù)性45秒，72°C延伸2分鐘，循環(huán)30次，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)72°C延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后取5 μ 1 PCR產(chǎn)物，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖1)。4. PCR產(chǎn)物的T載體連接按Takara pMD18_T載體說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物和pMD_18T 載體連接，體系如表2:表2 連接體系
權(quán)利要求
1.黃顙魚β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，其特征在于所述序列表中序列1的5’ -端1至1017位堿基為啟動(dòng)子區(qū)域。
2.黃顙魚的生長激素基因及其3’-非翻譯區(qū)，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。其特征在于所述序列表中序列2的5’ -端1至603位堿基為氨基酸編碼區(qū)域；604至1088位堿基為3，-非翻譯區(qū)序列；1070至1075位堿基為Poly A加尾信號(hào)。
3.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求2所述基因的真核表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的重組微生物。
6.含有權(quán)利要求2所述基因的重組微生物。
7.權(quán)利要求1所述黃顙魚肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子在黃顙魚基因育種中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2所述黃顙魚生長激素在促進(jìn)魚類生長中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃顙魚的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、生長激素基因及其3’-非翻譯區(qū)序列以及以此為元件構(gòu)建的黃顙魚本源轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明獲得了黃顙魚的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列以及外顯子1和部分外顯子2的序列，還獲得了黃顙魚生長激素基因的氨基酸編碼序列和3’-非翻譯區(qū)序列，并以獲得的黃顙魚β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子、生長激素編碼基因以及3’-非翻譯區(qū)為元件構(gòu)建黃顙魚本源生長激素轉(zhuǎn)基因載體。本發(fā)明用黃顙魚自身的β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其自身的生長激素基因表達(dá)的方法來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，能有效地避免轉(zhuǎn)基因魚所面臨的生物安全性問題，對(duì)黃顙魚基因育種與人工繁殖有重大的實(shí)際意義和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/18GK102191270SQ20101011612
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者宋偉, 熊熙文, 趙慶順 申請(qǐng)人:南京大學(xué)