專利名稱：家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種組織特異性啟動(dòng)子及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
家蠶在天然條件下產(chǎn)出的絲纖維是一種在紡織工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用的纖維材料。蜘蛛與家蠶具有相似的紡絲體，但其產(chǎn)出的絲纖維卻較蠶絲具有更強(qiáng)的硬度和更出色的韌性。絲纖維在生物體內(nèi)的形成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，至今都沒有獲得完全闡明?，F(xiàn)有的合成纖維都是人工模擬昆蟲天然產(chǎn)絲的過程，在體外進(jìn)行合成，但是其力學(xué)性能還遠(yuǎn)不能和蜘蛛絲纖維進(jìn)行對(duì)比。如果能使家蠶高效、特異地產(chǎn)出大量?jī)?yōu)質(zhì)的類蜘蛛絲纖維，對(duì)于優(yōu)質(zhì)纖維材料的獲取具有非常重要的意義。家蠶前部絲腺是向列型液晶形成的場(chǎng)所，離子強(qiáng)度對(duì)絲纖維的形成具有重要作用。利用家蠶前部絲腺特異啟動(dòng)子過量表達(dá)外源蛋白例如家蠶前部絲腺的某些離子通路蛋白，可能使絲纖維性質(zhì)發(fā)生改變，獲得更加優(yōu)良的蠶絲纖維。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶表皮蛋白啟動(dòng)子及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用，該啟動(dòng)子可以使外源蛋白在家蠶前部絲腺特異性表達(dá)，利用該啟動(dòng)子在家蠶前部絲腺調(diào)控某些離子通路蛋白的表達(dá)，可能使絲纖維性質(zhì)發(fā)生改變，獲得更加優(yōu)良的蠶絲纖維。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
I、家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子，由SEQ ID No. I所示核苷酸序列組成。2、含有所述家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體。進(jìn)一步，所述重組表達(dá)載體為pBac[BmCP274-表達(dá)基因-SV40，3xP3EGFP]， 是將由家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子、表達(dá)基因序列和SV40終止信號(hào)組成的表達(dá)框 [BmCP274-表達(dá)基因-SV40]插入穿梭載體pSLfall80fa的多克隆位點(diǎn)中，獲得重組載體 pSL [BmCP274-表達(dá)基因-SV40]，再用Asc I從重組載體pSL [BmCP274-表達(dá)基因-SV40]中切下[BmCP274-表達(dá)基因-SV40]片段，與同樣經(jīng)Asc I酶切的載體pBac [3xP3_EGFPafm] 連接，即得。進(jìn)一步，所述表達(dá)基因?yàn)榧t色熒光蛋白DeRed基因。3、所述家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子作為家蠶前部絲腺特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明利用蛋白質(zhì)組學(xué)手段鑒定到一個(gè)在家蠶前部絲腺特異并且高量表達(dá)的表皮蛋白BmCP274，對(duì)其啟動(dòng)子序列進(jìn)行了克隆，并以DsRed基因?yàn)榇砘驑?gòu)建了由BmCP274啟動(dòng)子調(diào)控的DsRed表達(dá)載體，將該表達(dá)載體顯微注射入家蠶體內(nèi)獲得了轉(zhuǎn)基因家蠶陽性個(gè)體，對(duì)該轉(zhuǎn)基因家蠶陽性個(gè)體的研究發(fā)現(xiàn)，BmCP274啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) DsRed在家蠶前部絲腺特異表達(dá)，因此，BmCP274啟動(dòng)子可以作為家蠶前部絲腺特異性啟動(dòng)子應(yīng)用。利用BmCP274啟動(dòng)子在家蠶前部絲腺調(diào)控某些離子通路蛋白的表達(dá)，可能使絲纖維性質(zhì)發(fā)生改變，獲得更加優(yōu)良的蠶絲纖維，從而本發(fā)明為下一步研究通過調(diào)控家蠶前部
3絲腺的離子通路蛋白表達(dá)來影響家蠶吐絲行為和改良絲纖維性能打下了基礎(chǔ)，而本發(fā)明提供的含有BmCP274啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體為上述研究提供了有力的工具。


圖I為BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶不同時(shí)期在白光和熒光照射下的照片，其中a 和b分別為白光和熒光照射下的卵，c和d分別為白光和熒光照射下的成蟲，e和f分別為白光和突光照射下的家蠶苗殼。圖2為BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶的絲腺解剖圖，其中a和b分別為白光和熒光照射下的轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺，c和d分別為白光和熒光照射下的非轉(zhuǎn)基因家蠶大造絲腺。圖3為BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶的Southern blot分析，其中I為Tran 2K plus DNA Marker，2為經(jīng)Bgl II酶切的非轉(zhuǎn)基因家蠶大造蠶蛾DNA，3為經(jīng)Bgl II酶切的轉(zhuǎn)基因家蠶Gl代蠶蛾DNA，4為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因(陽性對(duì)照)。圖4為BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶在前部絲腺特異表達(dá)DsRed的Western blot 分析，其中I為轉(zhuǎn)基因家蠶前部絲腺蛋白，2為非轉(zhuǎn)基因家蠶大造前部絲腺蛋白。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中使用的家蠶品種為大造，由中國西南大學(xué)家蠶基因資源庫提供。一、家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子的克隆
根據(jù)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中序列nscaf 1681，設(shè)計(jì)I對(duì)上下游引物。設(shè)計(jì)的引物委托生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行合成。引物序列如下
274-F 5' -ttgtcgacgtagcctttacataatatgccg-3' (SEQ ID No. 2,下劃線部分為 Sal I 酶切位點(diǎn))；
274-R :5’ -gaagatctctttcctggtgatcgatgg-3' (SEQ ID No. 3,下劃線部分為 Bgl II 酶切位點(diǎn))。以五齡第三天的大造基因組DNA為模板，采用引物274-F和274-R擴(kuò)增BmCP274啟動(dòng)子片段(SEQ ID No. I)。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4分鐘；然后94°C變性40秒，51°C 退火40秒，72°C延伸I. 5分鐘，共24個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收純化目的片段，再克隆入載體PMD19-T Simple(TaKaRa),獲得重組載體 pMD19-BmCP274。二、BmCP274啟動(dòng)子調(diào)控的DsRed表達(dá)載體的構(gòu)建
將重組載體pMD19-BmCP274用Sal I和Bgl II雙酶切，回收BmCP274啟動(dòng)子片段，再與同樣經(jīng)Sal I和Bgl II雙酶切的載體pSL[MCS-DsRed-SV40]進(jìn)行連接，獲得重組載體 pSL[BmCP274-DsRed-SV40]。所述載體 pSL[MCS-DsRed_SV40]系參照文獻(xiàn)方法(Horn and ffimmer, 2000),利用pSLfall80fa克隆穿梭載體,采用兩步克隆法構(gòu)建而得,具體構(gòu)建方法見中國專利申請(qǐng)20110423280. 3。將重組載體pSL [BmCP274-DsRed-SV40]用 Asc I 酶切，回收 BmCP274-DsRed_SV40片段，再與同樣經(jīng)Asc I酶切的載體pBac [3xP3-EGFPafm]進(jìn)行連接，獲得重組載體 pBac [BmCP274-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]。所述載體 pBac [3xP3-EGFPafm]系參照文獻(xiàn)方法 (Horn and ffimmer, 2000)構(gòu)建而得。三、BmCP274啟動(dòng)子調(diào)控的DsRed表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因家蠶的獲得
將重組載體pBac[BmCP274-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]與編碼piggyBac轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因輔助載體pHA3PIG等摩爾比混合，通過顯微注射入已解除滯育的大造早期胚胎(產(chǎn)卵后2飛小時(shí)，GO代)中，注射后的蠶卵用無毒膠水封口，25°C催青至孵化，孵化的幼蟲采用人工飼料飼育，至成蟲后進(jìn)行自交制種，獲得的卵期第7天的蠶卵(Gl代)在宏觀體視熒光顯微鏡 (Olympus MVX10)下利用波長(zhǎng)為46(T490nm的激發(fā)光檢測(cè)綠色熒光，篩選出在眼睛或神經(jīng)特異激發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體(圖I a-d)，即獲得BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶。隨機(jī)選取BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶Gl代蠶蛾，提取基因組DNA進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，EGFP的插入拷貝數(shù)為I個(gè)，DsRed與EGFP處在同一個(gè)轉(zhuǎn)座子區(qū)域中，其插入拷貝數(shù)也為I個(gè)，表明攜帶DsRed的piggyBac轉(zhuǎn)座元件在BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶的基因組中發(fā)生了I次轉(zhuǎn)座事件。四、BmCP274啟動(dòng)子調(diào)控的DsRed表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因家蠶前部絲腺的特異表達(dá)
I、熒光觀察DsRed在轉(zhuǎn)基因家蠶中的時(shí)期與組織特異性
隨機(jī)選取BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶，于胚胎發(fā)育后期開始進(jìn)行連續(xù)的熒光檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在蟻蠶時(shí)就可以觀察到前部絲腺發(fā)出紅色熒光，之后隨著轉(zhuǎn)基因家蠶的發(fā)育，紅色熒光越來越強(qiáng)。將五齡第一天的BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)，紅色熒光是從前部絲腺發(fā)出且無性別差異，而在其它組織如中腸、生殖腺等中沒有觀察到紅色熒光，在轉(zhuǎn)基因家蠶的繭殼中也沒有觀察到紅色熒光(圖I e，f)。將BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶與非轉(zhuǎn)基因家蠶的絲腺進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)，只有在BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶的前部絲腺中才能檢測(cè)到紅色熒光(圖2)。2、RT-PCR檢測(cè)DsRed基因在轉(zhuǎn)基因家蠶中的時(shí)期與組織特異性
分別取自五齡起蠶時(shí)期至蛹期第二天的轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體，以及五齡第三天轉(zhuǎn)基因家蠶的各組織樣品，在液氮中快速研磨并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用DsRed基因特異引物[DsRed-F :5，-atggtgcgctcctccaagaacg-3，(SEQ ID No. 4) ;DsRed_R : 5’ -ctacaggaacaggtggtggc-gg-3’ (SEQ ID No. 5)]進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè)，以 Actin3 為對(duì)照。 PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4分鐘；然后94°C變性15秒，65°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，共24個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，在時(shí)期特異性方面，DsRed基因自五齡起蠶時(shí)期至上蔟12小時(shí)都有高量表達(dá)，而自上蔟 12小時(shí)后表達(dá)量急劇下降；在組織特異性方面，DsRed基因只在家蠶前部絲腺表達(dá)。3、Western blot檢測(cè)DsRed在轉(zhuǎn)基因家蠶前部絲腺中的表達(dá)
分別取五齡第三天的BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶和非轉(zhuǎn)基因家蠶的前部絲腺，在液氮中快速研磨溶于8mol/L尿素緩沖液中，4°C放置I小時(shí)，離心取上清，測(cè)定總蛋白濃度，再與 5X加樣緩沖液混合，100°C變性10分鐘，進(jìn)行10% SDS-聚丙稀酰胺膠凝膠電泳，電泳完畢后，以Anti-DsRed抗體為一抗、Tubulin抗體為內(nèi)參照抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果如圖4所示，DsRed在BmCP274啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因家蠶的前部絲腺中表達(dá)，而在非轉(zhuǎn)基因家蠶前部絲腺中沒有表達(dá)。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子，其特征在于，由SEQID No. I所示核苷酸序列組成。
2.含有權(quán)利要求I所述家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為 pBac[BmCP274-表達(dá)基因-SV40, 3xP3EGFP]，是將由家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子、表達(dá)基因序列和SV40終止信號(hào)組成的表達(dá)框[BmCP274-表達(dá)基因-SV40]插入穿梭載體 pSLfall80fa的多克隆位點(diǎn)中，獲得重組載體pSL[BmCP274_表達(dá)基因-SV40]，再用Asc I 從重組載體pSL[BmCP274-表達(dá)基因-SV40]中切下[BmCP274_表達(dá)基因-SV40]片段，與同樣經(jīng)Asc I酶切的載體pBac[3xP3-EGFPafm]連接，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)基因?yàn)榧t色熒光蛋白 DsRed基因。
5.權(quán)利要求I所述的家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子作為家蠶前部絲腺特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)家蠶表皮蛋白BmCP274啟動(dòng)子，由SEQ ID No.1所示核苷酸序列組成；該啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)外源蛋白在家蠶前部絲腺特異表達(dá)，可作為家蠶前部絲腺特異性啟動(dòng)子應(yīng)用；本發(fā)明還公開了含有該啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，為下一步研究通過調(diào)控家蠶前部絲腺的離子通路蛋白表達(dá)來影響家蠶吐絲行為和改良絲纖維性能提供了有力的工具。
文檔編號(hào)C12N15/866GK102604953SQ20121008585
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者夏慶友, 徐漢福, 王鑫, 衣啟營, 趙萍, 馬三垣 申請(qǐng)人:西南大學(xué)